专利名称：靶向GSK3β基因RNA干扰重组慢病毒载体及其构建、筛选方法
技术领域：
本发明涉及革巴向糖原合成激酶3 β (glycogen synthesis kinase 3 β , GSK3 β )基因的RNA干扰重组慢病毒载体(LV-sh-GSK3i3)及其构建制备，属于生物医药技术领域。
背景技术：
阿尔茨海默病(AD)是以进行性认知功能障碍为特征的神经变性疾病，老年斑和神经元纤维缠结(NFT)是其特征的病理性损伤。异常磷酸化的tau蛋白(微管相关蛋白)构成NFT的核心，目前认为tau蛋白过磷酸化使微管稳定功能受损、螺旋状纤丝(PHF)形成及神经元丢失。因此阻断tau蛋白过磷酸化应是AD治疗的有效途径之一。GSK3 0是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，参与多种细胞内信号传导通路，是很多细胞功能的重要调节因子，参 与细胞代谢、分化、增殖与运动等过程。有研究证明糖原合成激酶_3 β (GSK-3i3)是导致tau蛋白过磷酸化的重要激酶之一。多项研究表明GSK_3i3在阿尔茨海默病的发展中起关键作用。Takashima A及Balaraman Y等证实GSK-30与几乎AD中所有的关键因素都有着直接或间接的联系，例如淀粉样变、神经元纤维缠结、早老素、神经元凋亡以及胰岛素抵抗等，参见Takashima A. GSK-3 is essential in the pathogenesis of Alzheimer' s disease.J Alzheimers Dis. 2006;9(3Suppl):309-17.及 Balaraman Y, Limaye AR, Levey Al，etal. Glycogen synthase kinase 3beta and Alzheimer! s disease!pathophysiologicaland therapeutic significance. Cell Mol Life Sci. 2006Jun;63(11):1226-35.。LeroyK发现GSK-30在阿尔茨海默病中，活性异常升高。Rankin CA等发现GSK_30与螺旋状纤丝(PHF)的形成及tau的过磷酸化有关。GSK-30的激活是脑老化和AD级联损害反应的关键步骤，早于神经元纤维缠结和神经元死亡。参见Leroy K，BoutajangoutA，Authelet Mj et al.The active form of glycogen synthase kinase_3beta isassociated with granuIovacuoIar degeneration in neurons in Alzheimer ! sdisease. Acta Neuropathol. 2002Feb;103(2) :91-9.及Rankin CA，Sun Q，Gamblin TC.Tauphosphorylation by GSK_3beta promotes tangle-like filament morphology.MolNeurodegener. 2007Jun 28:2:12·。因此，针对靶向抑制GSK-3 β的治疗或许会对AD这种灾难性疾病带来希望。RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术能特异性降解mRNA，沉默祀基因，在转录后水平抑制基因的表达，从而可用来进行基因功能的研究和药物靶标的研究。RNA干扰机制研究表明，双链RNA分子首先被细胞内RNA酶Dicer降解成21 23个碱基大小的小分子干扰RNA (small interfering RNA, si RNA) □ siRNA被认为是RNA干扰的主要效应物。RNA干扰常用的技术包括化学合成、体外转录法以及表达载体转录法等。其中慢病毒载体是目前常用的病毒载体之一，其特点为免疫原性低，能感染分裂相和非分裂相细胞，能将自身携带片断整合入宿主细胞基因组，并在哺乳动物各类细胞稳定表达siRNA，长期抑制基因表达。与质粒载体及其他病毒载体相比，慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点。该技术被广泛用于基因功能研究，在疾病的基因治疗上具有良好的前景。阿尔茨海默病是多因素、多基因疾病，在基因治疗领域RNA干扰特别适合用于某个基因过度表达或由于体内突变基因表达所致的疾病。利用RNA干扰相关技术可以针对在疾病发病过程中发挥重要作用的tau、Aβ 42 (淀粉样蛋白)、早老素基因、凋亡相关基因、神经生长因子及其受体以及部分关键酶等，在不影响正常基因功能的前提下抑制突变基因表达或基因的过量表达，从而达到治疗阿尔茨海默病的目的
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种靶向GSK_3i3基因的RNA干扰重组慢病毒载体构建、筛选及其用途。术语说明GSK3 β (glycogen synthesis kinase 3 β ):糖原合成激酶 3 β。SH-SY5Y :人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株。本发明以利用RNA干扰技术为主，针对GSK3P基因的不同靶序列，构建了两个能在SH-SY5Y细胞中表达siRNA的慢病毒真核表达载体GP-Supersilencing-shGSK-3 β ,该载体是自身失活的第三代慢病毒载体。其示意图谱见
图1，能高效特异性的抑制GSK3 0基因表达。本发明的技术方案如下一种靶向GSK3i3基因的siRNA重组慢病毒表达载体，是用于阿尔茨海默病GSK3 β基因相关性治疗性物质。该载体是由GP-Supersilencing-shGSK-3 β重组载体、pHelperl. O载体、pHelper 2. O载体共转染293T细胞培养获得；其中，所述的GP-Supersilencing-shGSK-3 β重组载体是在GP-Supersilencing载体的多克隆位点中连接双链DNA片段构建而得，酶切位点是XhoI和HpaI ;所述的双链DNA片段为以下序列中的一种(I) GSK3 β -homo-1292 寡核昔酸序列 I :正义链5， -TGCTAGATCACTGTAACATAGTTTCAAGAGAACTATGTTACAGTGATCTAGCTTTTTTC-3，反义链5， -TCGAGAAAAAAGCTAGATCACTGTAACATAGTTCTCTTGAAACTATGTTACAGTGATCTAGCA-3，(2) GSK3 β -homo-2169 寡核昔酸序列 2 正义链5，-TGCAGCGTCAGATGCTAATACTTTCAAGAGAAGTATTAGCATCTGACGCTGCTTTTTTC-3，反义链5，-TCGAGAAAAAAGCAGCGTCAGATGCTAATACTTCTCTTGAAAGTATTAGCATCTGACGCTGCA-3，所述的GP-Supersilencing载体的多克隆位点,其酶切位点即是XhoI和Hpal。根据本发明，所述的靶向GSK3 0基因RNA干扰的重组慢病毒载体的构建方法，包括步骤如下a.根据GSK3 β mRNA序列，设计合成双链DNA片段，所述的双链DNA片段为以上所述的GSK3 β -homo-1292寡核昔酸序列I、GSK3 β -homo-2169寡核昔酸序列2中的一种。b.然后将所述的双链DNA片段连接到GP-Supersilencing载体的多克隆位点中构建成 GP-Supersilencing-sh GSK3 β 重组载体；c.再将所述的 GP-Supersilencing_shGSK3 β 重组载体与 pHelperl. O 载体、pHelper 2. O载体共转染293T细胞培养，获得目标产品，即靶向GSK3 β基因RNA干扰的重
组慢病毒载体。作为优选，在所述的双链DNA片段末端引入XhoI和HpaI酶切位点。作为优选，用XhoI和HpaI酶将GP-SupersiIencing载体酶切，回收大片段后将其与所述双链DNA片段连接后转化感受态菌，挑取重组阳性克隆。为了对靶向GSK3 β基因RNA干扰的重组慢病毒载体对GSK3 β基因的抑制效果进行鉴定，脂质体转染细胞，提取总RNA，RT - PCR法测定对GSK3 β mRNA表达水平的抑制作用，Western blot测定抑制GSK3 β后对GSK3 0蛋白表达水平的影响。各步步骤如下I、总RNA的提取按照以下步骤进行总RNA提取吸弃6孔板中的培养液，每孔加入Iml TrizolReagent。用DEPC处理的枪头吹打使细胞完全裂解。将裂解液转移至I. 5ml EP管中，室温放置10分钟。加入200 μ I三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温放置10分钟。12000g 4° C离心10分钟，吸取上层清液至新离心管中，加入等体积的异丙醇，室温沉淀10分钟。12000g4° C离心15分钟，弃上清。沉淀用500 μ I 75%乙醇洗涤一次。12000g 4° C离心5分钟，回收沉淀，弃上清。常温倒置晾干10分钟。用20 μ I DEPC-H2O溶解沉淀，测定OD26tl、OD28tl,计算RNA浓度。琼脂糖电泳检查RNA的完整性。2、RNA逆转录获得cDNA逆转录反应体系
权利要求
1.一种靶向GSK30基因的siRNA重组慢病毒表达载体，是用于阿尔茨海默病GSK3 3基因相关治疗性物质，该载体是由GP-Supersilencing-shGSK-3 0重组载体、pHelperl. O载体、pHelper 2. O载体共转染293T细胞培养获得；其中， 所述的 GP-Supersilencing-shGSK-3 ^ 重组载体是在 GP-Supersilencing 载体的多克隆位点中连接双链DNA片段构建而得，酶切位点是XhoI和HpaI ;所述的双链DNA片段为以下序列中的一种 (1)GSK3 3 -homo-1292 寡核昔酸序列 I 正义链.5，-TGCTAGATCACTGTAACATAGTTTCAAGAGAACTATGTTACAGTGATCTAGCTTTTTTC-3， 反义链.5，-TCGAGAAAAAAGCTAGATCACTGTAACATAGTTCTCTTGAAACTATGTTACAGTGATCTAGCA-3， (2)GSK3 -homo-2169 寡核昔酸序列 2 正义链.5，-TGCAGCGTCAGATGCTAATACTTTCAAGAGAAGTATTAGCATCTGACGCTGCTTTTTTC-3， 反义链.5，-TCGAGAAAAAAGCAGCGTCAGATGCTAATACTTCTCTTGAAAGTATTAGCATCTGACGCTGCA-3，。
2.根据权利要求I所述的靶向GSK3P基因的siRNA重组慢病毒表达载体的构建方法，包括步骤如下 a.根据GSK3^ mRNA序列，设计合成双链DNA片段，所述的双链DNA片段为所述的GSK3 -homo-1292寡核昔酸序列I、GSK3 -homo-2169寡核昔酸序列2中的一种。
b.然后将所述的双链DNA片段连接到GP-SupersiIencing载体的多克隆位点中构建成GP-Supersilencing-sh GSK3 ^ 重组载体； c.再将所述的GP-Supersilencing_shGSK3 ^ 重组载体与 pHelperl. 0 载体、pHelper.2.0载体共转染293T细胞培养，得靶向GSK3 ^基因RNA干扰的重组慢病毒载体。
3.权利要求I所述的靶向GSK3P基因的siRNA重组慢病毒表达载体在制备治疗阿尔茨海默病GSK3 ^相关性基因药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及靶向GSK3β基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建、筛选及其用途。本发明利用RNA干扰技术，针对GSK3β基因的不同靶序列，构建了两个能在SH-SY5Y细胞中表达siRNA的慢病毒真核表达载体，该载体是由GP-Supersilencing-shGSK-3β重组载体、pHelper1.0载体、pHelper 2.0载体共转染293T细胞培养获得。本发明靶向GSK3β基因RNA干扰重组慢病毒载体能高效特异性的抑制GSK3β基因表达，可用于制备治疗阿尔茨海默病GSK3β相关性基因药物。
文档编号C12N15/867GK102703508SQ201210156759
公开日2012年10月3日 申请日期2012年5月18日 优先权日2012年5月18日
发明者党宁宁, 李严霜, 林晓英, 赵静, 边卫, 边红, 陈雯 申请人:边红