专利名称：疟原虫疫苗、抗原、组合物和方法
疟原虫疫苗、抗原、组合物和方法交叉申请案本申请案主张2008年9月观日申请的美国临时申请案61/100，744的权益，所述申请案的整体揭示内容以全文引用的方式并入本文中。
背景技术：
疟疾是一种由疟原虫属(genus Plasmodium)的原生动物寄生虫引起的媒介传播的传染性疾病。其在热带和亚热带地区广泛传播，包括美洲、亚洲和非洲的部分地区。 每年约有5. 15亿疟疾病例，导致一百万到三百万人死亡，其中大多数是撒哈拉以南非洲 (Sub-Saharan Africa)的年幼儿童(斯诺(Snow)等人，2005，自然(Nature)，4；34 :214-7 ； 以引用的方式并入本文中)。疟疾通常与贫穷有关，但也是贫穷的原因和经济发展的主要障碍。疟原虫属寄生虫通过雌性疟蚊属(Anopheles)蚊虫来传播。症状包括头晕目眩、 呼吸急促、心动过速、发热、寒战、恶心、类似流感的疾病、昏迷和死亡中的一种或一种以上。 目前没有可用于疟疾的疫苗。现有预防性疗法必须连续使用以降低感染风险，但这些预防性处理对于生活在地方病流行地区的大多数人来说通常太过昂贵。疟疾感染通常通过使用诸如奎宁(quinine)或青蒿素(artemisinin)衍生物等抗疟疾药来治疗，但耐药性越来越常见。
发明内容
本发明提供诱导或增强针对疟原虫有性繁殖阶段(sexual-stage)抗原(例如 Pfs25、Pfs28、Pfs48/45、Pfs230、HAP2、GCSl同源物)和配子体表面抗原的免疫反应的组合物和制备组合物的方法。所述组合物适用于减少疟原虫感染的传播。所述组合物可包括包含热稳定性蛋白质和疟原虫多肽的分离的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽可为Pfs25、 Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽或其免疫原性部分，且其中所述融合蛋白在投予个体时诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应。在一些实施例中，所述热稳定性蛋白质可为地衣多糖酶(lichenase)多肽。所述地衣多糖酶多肽可为经修饰的地衣多糖酶B多肽。所述经修饰的地衣多糖酶B多肽可为具有SEQ ID NO :40的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO :40具有至少90%、至少95%、至少98%序列一致性的经修饰的地衣多糖酶B多肽。在一些实施例中，疟原虫多肽可为Pfs25多肽。所述Pfs25多肽可具有SEQ ID NO 42的氨基酸序列或可与SEQ ID NO 42具有至少95%、至少98%、至少99%序列一致性。在一些实施例中，疟原虫多肽可为Pfs^多肽。所述Pf8 多肽可具有SEQ ID N0:55 的氨基酸序列或可与SEQ ID NO :55具有至少95%、至少98%、至少99%序列一致性。在一些实施例中，疟原虫多肽可为Pfs48/45多肽。所述Pfs48/45多肽可具有SEQ ID NO 62 的氨基酸序列或可与SEQ ID NO :62具有至少95%、至少98%、至少99%序列一致性。在一些实施例中，疟原虫多肽可为Pfs230多肽。所述Pfs230多肽可具有SEQ ID NO :95的氨基酸序列或可与SEQ ID NO :95具有至少95%、至少98%、至少99%序列一致性。
在一些实施例中，融合蛋白可具有选自由以下组成的群组的氨基酸序列SEQ ID NO 152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、 188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、 228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252 和 254，或可为与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少99%序列一致性的多肽SEQ ID NO 152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、 188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、 228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252 和 254。还揭示包含编码所述融合蛋白的序列的核酸。所述核酸可编码选自由以下组成的群组的多肽的氨基酸序列:SEQ ID NO :152、巧4、156、158、160、162、164、166、168、170、172、 174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、 212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、 252和254，或与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少99% 序列一致性的多肽的氨基酸序列:SEQ ID NO :152、154、156、158、160、162、164、166、168、 170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、 208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、 248、250、252和254。还揭示包含所述核酸的表达载体。所述表达载体可进一步包含前导序列。表达载体可为农杆菌(Agrobacterial)质粒、植物病毒载体或克隆到农杆菌质粒中的植物病毒载体。还揭示包含所述表达载体的宿主细胞。所述宿主细胞可为植物细胞且可包含植物。还揭示产生融合蛋白和疟原虫Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽的方法， 所述方法包含提供包含编码所述融合蛋白的核酸的核酸构筑体；将所述核酸构筑体引入植物细胞中；和在允许融合蛋白表达的条件下维持所述细胞。还揭示在植物中制备诱导或增强针对疟原虫有性繁殖阶段抗原(例如Pfs25、 Pfs28、Pfs48/45、Pfs230、HAP2、GCSl同源物)和配子体表面抗原的免疫反应的组合物的方法。这些方法包括制备诱导或增强针对疟原虫Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽的免疫反应的组合物的方法。在一实施例中，所述方法包含在植物中产生如上文所述的融合蛋白；分离融合蛋白；和将分离的融合蛋白与医药学上可接受的载剂组合。在一实施例中，所述方法包含在植物中产生疟原虫多肽Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230 ；分离多肽；和将多肽与医药学上可接受的载剂组合。疟原虫多肽可为Pfs25多肽；所述Pfs25多肽可具有SEQ ID NO :42的氨基酸序列或可为与SEQ ID NO :42具有至少90%序列一致性的多肽。疟原虫多肽可为Pfs^多肽；所述Pfs28多肽可具有SEQ ID NO 55的氨基酸序列或可为与SEQ ID NO :55具有至少90%序列一致性的多肽。疟原虫多肽可为Pfs48/45 多肽；所述Pfs48/45多肽可具有SEQ ID NO :62的氨基酸序列或可为与SEQ ID NO :62具有至少90%序列一致性的多肽。疟原虫多肽可为Pfs230多肽；所述Pfs230多肽可具有 SEQ ID NO :95的氨基酸序列或可为与SEQ ID NO :95具有至少90%序列一致性的多肽。 植物可短暂表达多肽或融合蛋白；所述短暂表达可来自农杆菌质粒、植物病毒载体或克隆到农杆菌质粒中的植物病毒载体。在一些实施例中，植物可为多肽或融合蛋白转基因植物。植物可来自选自由以下组成的群组的属芸苔属(Brassica)、烟草属(Nicotiana)、 矮牵牛属(Petunia)、西红棉属(Lycopersicon)、爺属(Solanum)、番椒属(Capsium)、胡萝卜属(Daucus)、旱芹属(Apium)、莴苣属(Lactuca)、芥子属(Sinapis)或拟南芥属 (Arabidopsis)，例如本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)、埃塞俄比亚芥(Brassica carinata)、^f 胃(Brassica juncea)、yjfl _ 3 (Brassica napus)、！I # (Brassica nigra) > 1ξ[" M (Brassica oleraceae) > ^f (Brassica tournifortii) > [=| ^f
(Sinapis alba)和萝卜(Raphanus sativus)。可使用的植物包括紫花苜蓿(alfalfa)、萝卜 (radish)、芥菜(mustard)、绿豆(mung bean)、西兰花(broccoli)、7jC 田序(watercress)、 大豆(soybean)、小麦(wheat)、向曰葵(sunflower)、卷心菜(cabbage)、三叶草(clover)、 (petunia)(tomato)(potato)(tobacco) ^ (spinach)禾口
小扁豆(lentil)。在一些实施例中，植物可为发芽的籽苗。还提供通过上述方法产生的植物细胞和含有这种植物细胞的植物。在一些实施例中，植物产疟原虫多肽是从植物材料纯化而来。在一些实施例中，植物产疟原虫多肽不是从植物材料纯化而来。还揭示包含技术方案1至32中任一技术方案的融合蛋白和医药学上可接受的载剂或赋形剂的医药组合物。所述组合物可进一步包括佐剂。所述佐剂可选自由以下组成的群组明矾、Quil A、QS21、氢氧化铝、磷酸铝、矿物油、MF59、Malp2、不完全弗氏佐剂 (incomplete Freund' s adjuvant)、完全弗氏佐剂(complete Freund' s adjuvant)、招胶(alhydrogel)、3去_0_酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)、脂质A、百日咳杆菌(Bortadella pertussis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、默克佐剂 65 (Merck Adjuvant65)、角鲨烯、病毒颗粒(virosome)、SBAS2、SBAS1、AS03 和未甲基化 CpG 序列。还提供一种在个体中诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应的方法，所述方法包含投予治疗有效量的根据上述方法制备的疟原虫多肽或其组合物。可经口、鼻内、皮下、静脉内、腹膜内或肌肉内投予所述肽或其组合物。还提供一种在个体中诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应的方法，所述方法是通过向个体供给通过上文所述产生的植物或其可食用部分或植物细胞来进行。在这些方法中，所述个体可为动物，诸如人类、非人类灵长类动物、鸟类或啮齿动物。还揭示减少疟原虫感染的传播的方法。在一实施例中，所述方法包含减少疟原虫向处于疟原虫感染风险中的群体中的个体传播，包含向所述群体中的一个或一个以上个体投予有效量的根据上述方法制备的疟原虫多肽或其组合物。在一实施例中，方法包含减少疟原虫从个体传播的方法，所述方法包含向个体投予有效量的根据上述方法制备的疟原虫多肽或其组合物。在这些方法中，所述个体可为动物，诸如人类、非人类灵长类动物、鸟类或啮齿动物。定义氨基酸如本文中所使用，术语“氨基酸”在其最广泛意义上是指任何可并入多肽链中的化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸具有通用结构&N-C(H) (R)-C00H。在一些实施例中，氨基酸为天然存在的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸为合成氨基酸；在一些实施例中，氨基酸为D-氨基酸；在一些实施例中，氨基酸为L-氨基酸。“标准氨基酸”是指天然存在的肽中常见的二十种标准L-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸以外的任何氨基酸，这与其是合成制备还是从天然来源获得无关。如本文中所使用， “合成氨基酸”涵盖经化学修饰的氨基酸，包括(但不限于)盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺)和/或取代。肽中的氨基酸(包括羧基端和/或氨基端氨基酸)可通过甲基化、酰胺化、乙酰化和/或用其它可改变所述肽的循环半衰期而不会不利地影响其活性的化学基团取代来修饰。氨基酸可能会参与二硫键。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。可从使用术语的上下文明了其是指游离氨基酸还是肽的残基。动物如本文中所使用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施例中，所述非人类动物为哺乳动物(例如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、 猴、犬、猫、绵羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，动物包括(但不限于)哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可为转基因动物、遗传工程改造动物和/或克隆。抗体如本文中所使用，术语“抗体”是指天然或完全或部分合成产生的任何免疫球蛋白。其维持特定结合能力的所有衍生物也都包括在所述术语中。所述术语还涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源或基本上同源的结合结构域的任何蛋白质。所述蛋白质可以来源于天然来源，或部分或完全合成产生。抗体可为单克隆或多克隆抗体。抗体可为任何免疫球蛋白类别的成员，包括任何人类类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。如本文中所使用， 术语“抗体片段”或“抗体的特征性部分”可互换使用并且是指小于全长的任何抗体衍生物。 一般来说，抗体片段至少保留全长抗体的特定结合能力的相当大部分。抗体片段的实例包括(但不限于)Fab、Fab'、F(ab' )2、scFv、Fv、dsFv双功能抗体和Fd片段。抗体片段可以通过任何方式来产生。举例来说，抗体片段可以通过裂解完整抗体以酶促方式或以化学方式产生和/或其可以由编码部分抗体序列的基因重组产生。或者或另外，抗体片段可以完全或部分合成产生。抗体片段可以任选包含单链抗体片段。或者或另外，抗体片段可以包含例如由二硫键连接在一起的多个链。抗体片段可以任选包含多分子复合物。功能性抗体片段通常包含至少约50个氨基酸且更通常包含至少约200个氨基酸。约如本文中所使用，术语“约(approximately/about)”在应用于一个或一个以上所关注的值时是指类似于所述参考值的值。在某些实施例中，除非另有规定或另外从上下文显而易见(除了所述数值将超过可能值的100%的情况以外)，否则术语“约”是指处于所述参考值在任一方向(大于或小于)上的25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、 13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小以内的值范围。特征性部分如本文中所使用，短语蛋白质或多肽的“特征性部分”是含有一段连续氨基酸或共同作为蛋白质或多肽的特点的许多段连续氨基酸的部分。各所述连续段一般将含有至少两个氨基酸。此外，所属领域的技术人员应了解，通常需要至少5个、至少10个、 至少15个、至少20个或更多氨基酸表现蛋白质的特点。一般来说，特征性部分是除以上所指定的序列特性外还与相关完整蛋白质共有至少一种功能性特征的部分。特征性序列“特征性序列”是存在于多肽或核酸家族的所有成员中的序列，且因此所属领域的技术人员可用来定义家族的成员。组合疗法如本文中所使用，术语“组合疗法”是指以重叠方案投予两种或两种以上不同医药剂以使个体同时接触两种药剂的那些情形。给药方案如本文中所使用，“给药方案”是指间隔一定时段个别地投予的一组单位剂量(通常是多个)。推荐用于特定医药剂的一组剂量(即，投药量、时序、途径等)构成其给药方案。表达如本文中所使用，核酸序列的“表达”是指一个或一个以上如下事件⑴从 DNA序列产生RNA模板(例如通过转录)；( 加工RNA转录物(例如通过拼接、编辑和/或 3'末端形成)；(3)将RNA翻译为多肽或蛋白质；(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。基因如本文中所使用，术语“基因”具有如所属领域中所了解的含义。所属领域的技术人员应了解，术语“基因”可以包括基因调控序列(例如启动子、增强子等)和/或内含子序列。应进一步了解，基因的定义包括提及不编码蛋白质而是编码功能性RNA分子 (诸如tRNA)的核酸。为了清楚起见，我们应注意，如本申请案中所使用，术语“基因”一般是指编码蛋白质的核酸的一部分；所属领域的技术人员从上下文可显而易见，所述术语可任选涵盖调控序列。这一定义并不打算排除对不编码蛋白质的表达单元应用术语“基因”， 而是澄清在大多数情况下，如本文件中所使用的所述术语是指编码蛋白质的核酸。基因产物如本文中所使用，术语“基因产物”或“表达产物” 一般是指从基因转录的RNA(加工前和/或加工后)或由从所述基因转录的RNA所编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。同源性如本文中所使用，术语“同源性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施例中， 如果聚合分子的序列至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55 %、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少 95%或至少99%—致，那么认为这些聚合分子彼此“同源”。在一些实施例中，如果聚合分子的序列至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%类似，那么认为这些聚合分子彼此“同源”。—致性如本文中所使用，术语“一致性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如 DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。举例来说，两个核酸序列的一致性百分比的计算可通过出于最佳比较目的对准两个序列来进行(例如，可将间隙引入第一和第二核酸序列中的一个或两个中以便最佳对准且出于比较目的可以忽略非一致序列)。在某些实施例中，出于比较目的所对准的序列长度为参考序列长度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。接着比较相应核苷酸位置的核苷酸。当第一序列中的位置未被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据时，则所述分子在那个位置上是一致的。两个序列之间的一致性百分比与所述序列共有的一致位置的数目有关，并且考虑最佳对准两个序列需要引入的间隙的数目和各间隙的长度。序列的比较和两个序列之间的一致性百分比的测定可以使用数学算法来完成。 举例来说，两个核苷酸序列之间的一致性百分比可以使用迈尔(Meyers)和米勒(Miller) (生物科学中的计算机应用(CABIOS)，1989,4:11-17)的算法来测定，所述算法已并入使用 PAM120权数残基表、间隙长度罚分12和间隙罚分4的ALIGN程序O. 0版)中。或者，两个核苷酸序列之间的一致性百分比可以使用GCG软件包中的GAP程序，使用NWSgapdna. CMP 矩阵来测定。如本文中所使用，术语“总体一致性”是指一长段序列中的一致性。在一些实施例中，总体一致性是指至少50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、400个、500个或更多个氨基酸和/或核苷酸中的一致性。在一些实施例中，总体一致性是指指定序列的完整长度中的一致性。分离的如本文中所使用，术语“分离的”是指如下的物质和/或实体⑴与至少一些在最初产生(在自然界中和/或在实验环境中)时与其结合的组分分离；和/或(2) 人工产生、制备和/或制造。分离的物质和/或实体可以与最初与其结合的其它组分的至少约 10%、约 20%、约 30%、约 40%、约 50%、约 60%、约 70%、约 80%、约 90%、约 95%、 约98 %、约99 %或100 %分离。在一些实施例中，分离的药剂的纯度大于约80 %、约85 %、 约 90%、约 91%、约 92%、约 93%、约 94%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98%、约 99%、实质上100%或100%。如本文中所使用，如果物质实质上不含其它组分，那么其是“纯的”。 如本文中所使用，术语“分离的细胞”是指不包含在多细胞生物体中的细胞。地衣多糖酶多肽如本文中所使用，术语“地衣多糖酶多肽”是指与表1中所列的一种或一种以上地衣多糖酶多肽显示至少50%总体序列一致性的多肽。在一些实施例中， 地衣多糖酶多肽与所列地衣多糖酶多肽显示至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% —致性。在一些实施例中，地衣多糖酶多肽与所列地衣多糖酶多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。核酸如本文中所使用，术语“核酸”在其最广泛意义上是指并入或可以并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是经由磷酸二酯键并入或可以经由磷酸二酯键并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”是指个别核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)。在一些实施例中，“核酸”是指包含个别核酸残基的寡核苷酸链。如本文中所使用，术语“寡核苷酸”和“聚核苷酸”可互换使用。在一些实施例中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或CDNA0此夕卜，术语“核酸”、“DNA，，、 “RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即具有非磷酸二酯主链的类似物。举例来说，所属领域中已知且在主链中具有肽键以代替磷酸二酯键的所谓“肽核酸”被认为在本发明的范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括互为简并形式和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列包括内含子。核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生且任选纯化，化学合成等。适当时，例如在化学合成分子的情况下，核酸可以包含核苷类似物，诸如具有经化学修饰的碱基或糖、主链修饰等的类似物。除非另有指示，否则核酸序列以5'至3'方向呈现。术语“核酸区段”在本文中用于指作为较长核酸序列的一部分的核酸序列。在许多实施例中，核酸区段包含至少3个、至少 4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或10个以上残基。在一些实施例中，核酸是以下物质或包含以下物质天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、 尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、(N-吡咯基)_嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)；插入的碱基；经修饰的糖(例如2’ -氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸酯基(例如硫代磷酸酯和5 ‘ -N-亚磷酰胺键联)。在一些实施例中，本发明可能具体涉及“未经修饰的核酸”，其意思是尚未经化学修饰以促进或实现
13传递的核酸(例如聚核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。可操作地连接如本文中所使用，术语“可操作地连接”是指两个核酸序列之间的关系，其中一个核酸序列的表达受另一核酸序列控制、调控、调节等。举例来说，核酸序列的转录受可操作地连接的启动子序列指导；核酸的转录后加工受可操作地连接的加工序列指导；核酸序列的翻译受可操作地连接的翻译调控序列指导；核酸或多肽的转运或定位受可操作地连接的转运或定位序列指导；且多肽的翻译后加工受可操作地连接的加工序列指导。可操作地连接于第二核酸序列的核酸序列可以直接或间接共价连接于所述序列，不过任何有效三维结合都是可接受的。Pfs25多肽如本文中所使用，术语“Pfs25多肽”是指与图1中所列的一种或一种以上Pfs25多肽显示至少50%总体序列一致性的多肽。在一些实施例中，Pfs25多肽与所列Pfs25多肽显示至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少95%、至少96%、至少 97 %、至少98 %、至少99 %或100 % —致性。在一些实施例中，Pf s25多肽与所列Pf s25多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。编码代表性Pfs25多肽的氨基酸序列展示于图M中 (SEQ ID NO 41 ；基因库(Genbank)编号AAF63684. 1)。与基因库编号AAF63684. 1的氨基酸序列相比，Pfs25的其它代表性形式的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、10个或更多个氨基酸变化。Pfs25的已鉴别出的其它氨基酸序列包括例如(但不限于)AAD55785. 1 ；AAD39544. 1。Pfs28多肽如本文中所使用，术语“Pfd8多肽”是指与图1中所列的一种或一种以上Pfs28多肽显示至少50%总体序列一致性的多肽。在一些实施例中，Pfs28多肽与所列Pfs^多肽显示至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少95%、至少96%、至少 97%、至少98%、至少99%或100% —致性。在一些实施例中，Pfs28多肽与所列Pfs^多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。编码代表性Pfs^多肽的氨基酸序列展示于图M 中(SEQ ID NO 55 ；基因库编号AAT00624. 1)。与基因库编号AAT00624. 1的氨基酸序列相比，Pfs25的其它代表性形式的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、10个或更多个氨基酸变化。Pfs48/45多肽如本文中所使用，术语“Pfs48/45多肽”是指与图1中所列的一种或一种以上Pfs48/45多肽显示至少50%总体序列一致性的多肽。在一些实施例中， Pfs48/45多肽与所列Pfs48/45多肽显示至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100% —致性。在一些实施例中， Pfs48/45多肽与所列Pfs48/45多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。编码代表性 Pfs48/45多肽的氨基酸序列展示于图M中(SEQ ID NO 62 ；基因库编号PF13_0M7)。与基因库编号PF13_0M7的氨基酸序列相比，Pfs48/45的其它代表性形式的氨基酸序列具有 1、2、3、4、5、10个或更多个氨基酸变化。Pfs230多肽如本文中所使用，术语“Pfs230多肽”是指与图1中所列的一种或一种以上Pfs230多肽显示至少50%总体序列一致性的多肽。在一些实施例中，Pfs230多肽与所列Pfs230多肽显示至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少85 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %或100 % —致性。在一些实施例中，Pf s230多肽与所列Pf s230 多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。编码代表性Pfs230多肽的氨基酸序列展示于图M中(SEQ ID NO 95 ；基因库编号AAA^724)。与基因库编号AAA297M的氨基酸序列相比，Pfs230的其它代表性形式的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、10个或更多个氨基酸变化。医药剂如本文中所使用，短语“医药剂”是指当投予个体时具有治疗作用和/或引发所需生物和/或药理学作用的任何药剂。医药学上可接受的载剂或赋形剂如本文中所使用，术语“医药学上可接受的载剂或赋形剂”的意思是任何类型的无毒、惰性固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、囊封材料或调配助剂。疟原虫多肽如本文中所使用，术语“疟原虫多肽”或“疟原虫抗原多肽”是指与图1中所列的一种或一种以上Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和/或Pfs230多肽显示至少50% 总体序列一致性的多肽。在一些实施例中，疟原虫多肽与所列Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和 /或Pfs230多肽显示至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少95%、至少96%、至少97 %、至少98 %、至少99 %或100 % —致性。在一些实施例中、疟原虫多肽与所列Pf s25、 Pfs28、Pfs48/45和/或Pfs230多肽进一步共有至少一个特征性序列元件。在一些实施例中，疟原虫多肽不是Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和/或Pfs230多肽，而是由疟原虫属的一个或一个以上物种天然产生的不同多肽。部分如本文中所使用，短语物质的“部分”或“片段”在最广泛意义上是与相关完整物质共有一定程度的序列和/或结构一致性和/或至少一种功能性特征的部分或片段。 举例来说，蛋白质或多肽的“部分”是含有一段连续氨基酸或共同作为蛋白质或多肽的特点的许多段连续氨基酸的集合的部分。在一些实施例中，各所述连续段一般将含有至少2个、 至少5个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个氨基酸。一般来说，部分是除以上所说明的序列一致性外还与相关完整蛋白质共有至少一种功能性特征的部分。在一些实施例中，所述部分可以具有生物活性。蛋白质如本文中所使用，术语“蛋白质”是指多肽(即，含至少两个由肽键相互连接的氨基酸的链)。蛋白质可以包括除氨基酸以外的部分(例如可为糖蛋白、蛋白聚糖等) 和/或可以另外经加工或修饰。所属领域的普通技术人员应了解，“蛋白质”可为由细胞所产生的完整多肽链(有或无信号序列)，或可为其特征性部分。所属领域的普通技术人员应了解，蛋白质有时可以包括多个多肽链，例如由一个或一个以上二硫键连接或通过其它方式结合。多肽可以含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者而且可以含有所属领域中已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。适用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化等。在一些实施例中，蛋白质可以包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸和其组合。术语“肽”一般用于指长度小于约100个氨基酸的多肽。相似性如本文中所使用，术语“相似性”是指聚合分子之间，例如核酸分子(例如 DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。聚合分子彼此的相似性百分比的计算可以与计算一致性百分比相同的方式进行，除了相似性百分比的计算考虑如所属领域中所了解的保守性取代以外。个体如本文中所使用，术语“个体”或“患者”是指例如出于实验、诊断、预防和/ 或治疗目的可以投予本发明的组合物的任何生物体。典型个体包括动物(例如哺乳动物， 诸如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物和人类；昆虫；蠕虫；等)。实质上如本文中所使用，术语“实质上”是指展现全部程度或接近全部程度的所关注特征或性质的定性条件。所属领域的普通技术人员应了解，生物学和化学现象很少 (如果发生过的话)达到完全和/或进行到完全或达成或避免绝对结果。因此，术语“实质上”在本文中用于记录许多生物学和化学现象中所固有的可能的完全性缺乏。
罹患“罹患”疾病、病症和/或病状的个体已确诊患有所述疾病、病症和/或病状或呈现所述疾病、病症和/或病状的一种或一种以上症状。易患“易患”疾病、病症和/或病状的个体尚未确诊患有所述疾病、病症和/或病状。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状的个体可能不展现所述疾病、病症和/或病状的症状。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状的个体将发展所述疾病、病症和 /或病状。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状的个体不会发展所述疾病、病症和/ 或病状。在一些实施例中，易患疾病、病症和/或病状的个体为发展特定疾病或病症或其症状的风险(通常基于遗传倾向、环境因素、个人病史或其组合)高于一般群体中所观察到的风险的个体。治疗有效量术语医药剂或药剂组合的“治疗有效量”欲指在适用于任何医学治疗的合理益处/风险比下对所治疗的个体赋予治疗作用的药剂的量。在一些实施例中，治疗有效量是当投予罹患或易患疾病、病症和/或病状的个体时足以治疗、诊断、预防和/或延缓疾病、病症和/或病状的症状发作的量。所述治疗作用可为客观的(即，可通过一些测试或标记来测量)或主观的(即，个体声明有作用或感到有作用)。治疗有效量通常以可能包含多个单位剂量的给药方案来投予。对于任何特定医药剂，治疗有效量(和/或有效给药方案中的适当单位剂量)可以例如视投药途径、与其它医药剂的组合而变化。用于任何特定个体的特定治疗有效量(和/或单位剂量)也可以视多种因素而定，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所用特定医药剂的活性；所用的特定组合物；个体的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；投药时间、投药途径和/或所用特定医药剂的排泄或代谢速率；治疗持续时间；和如医学技术中熟知的类似因素。治疗剂如本文中所使用，短语“治疗剂”是指当投予个体时具有治疗作用和/或引发所需生物和/或药理学作用的任何药剂。治疗如本文中所使用，术语“治疗”是指以任何形式投予生物活性剂，从而部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症和/或病状的一种或一种以上症状或特征，延缓其一种或一种以上症状或特征发作，预防其一种或一种以上症状或特征，降低其一种或一种以上症状或特征的严重程度和/或降低其一种或一种以上症状或特征的发生率。所述治疗可以用于不展现相关疾病、病症和/或病状的征兆的个体和/或仅展现疾病、病症和/或病状的早期征兆的个体。或者或另外，所述治疗可以用于展现相关疾病、病症和/或病状的一种或一种以上既定征兆的个体。单位剂量如本文中所使用，术语“单位剂量”是指通常在给药方案的情形下医药剂的不连续投予。载体如本文中所使用，“载体”是指可以转运与其所连接的另一核酸的核酸分子。 在一些实施例中，载体可以在诸如真核和/或原核细胞等宿主细胞中实现与其所连接的核酸的染色体外复制和/或表达。能够指导可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为 “表达载体”。
图1.来自疟原虫属物种的例示性Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230。粗体氨基酸表示信号肽的位置。下划线氨基酸表示存在地衣多糖酶、6XHis标签和KDEL序列。正常字体氨基酸表示Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230序列。粗体又下划线的氨基酸表示天然蛋白质中的跨膜结构域和/或gpi锚。图2-12.肽与AlMVCP的融合物的表达、表征和纯化图 13 是二元投放载体(Binary Launch Vector)的图形表示pGR_D4。图14是用于产生构筑体的经修饰的地衣多糖酶基因的图形表示。图15显示所选疟疾抗原的蛋白质产生的实例。图16. Pfs25和Pfs28目标的工程改造、表达和溶解性概况。图17是总结Pfs25构筑体的IFA、SIFA和SMFA分析的结果的表格。图18是总结Pfs28构筑体的IFA、SIFA和SMFA分析的结果的表格。图19.Pfs48目标的工程改造、表达和溶解性概况。图20是总结Pfs48/45构筑体的IFA、SIFA和SMFA分析的结果的表格。图21. Pfs230目标的工程改造、表达和溶解性概况。图22是总结Pfs230构筑体的IFA、SIFA和SMFA分析的结果的表格。图23A描绘在铝胶存在下由Pfs230A引发的IgG反应的同型分析的结果。图2 描绘在Quil A佐剂存在下由Pfs230A引发的IgG反应的同型分析的结果。图M提供来自疟原虫属物种的例示性Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230融合蛋白序列。图25提供来自疟原虫属物种的例示性Pfs25、Pfs28、Pfs48/45和Pfs230融合蛋白构筑体。
具体实施例方式疟原虫和疟原虫疗法疟疾，一种常见传染性疾病和巨大公众健康问题，是由疟原虫属的原生动物寄生虫引起。四种疟原虫属物种可感染人类恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疱原虫(Plasmodium ovale)和三日疱原虫(Plasmodium malariae)。疾病的最严重形式是由恶性疟原虫和间日疟原虫引起。如本文中所使用，术语 “疟疾寄生虫”用于指这些疟原虫属物种中的一种、两种、三种或四种。疟疾寄生虫通过雌性疟蚊属蚊虫来传播。疟疾寄生虫在红血球中繁殖，引起包括贫血症状(例如头晕目眩、呼吸急促、心动过速等)的症状，以及其它全身症状，诸如发热、 寒战、恶心、类似流感的疾病和在严重情况下甚至导致昏迷和死亡。疟疾传播可通过用蚊帐和驱虫剂来防止蚊虫叮咬，或通过诸如在室内喷洒杀虫剂和排干积水(蚊虫会在积水中产卵)等蚊虫防治措施来减少。目前没有可用于疟疾的疫苗。现有预防性疗法必须连续使用以降低感染风险。这些预防性处理对于生活在地方病流行地区的人来说通常太过昂贵。疟疾感染通过使用抗疟疾药来治疗，诸如奎宁或青蒿素衍生物，但耐药性越来越常见。本文提供用于诱导或增强针对在疟原虫生命周期的有性繁殖阶段表达的抗原的免疫反应的材料与方法。更具体来说，提供多肽和制备所述多肽的方法。针对寄生虫的有性繁殖阶段的免疫性提供减少或阻止疟疾传播的有效方式。特异性靶向蚊虫媒介中的寄生虫的有性发育的传播阻断疫苗(transmission blocking vaccine,TBV)可引出制造可有效地阻断寄生虫从无脊椎动物蚊虫媒介传播到脊椎动物宿主的抗体。疟疾的传播取决于在受感染者的周边血液中存在传染性雄性和雌性配子体和疟蚊属蚊虫成功摄取这些配子体。摄取后不久，在蚊虫的中肠中形成小配子，且新出现的雄配子使雌配子受精，从而形成合子。合子经历受精后转化成为活动型动合子，其穿过中肠上皮并发育成卵囊，从而产生传染性子孢子。最后，子孢子释放到血腔中，侵入唾液腺并且在随后取食血液期间传播到脊椎动物宿主。传播阻断抗体的目标可包括在循环配子体中表达的受精前抗原(Pfs230和 Pfs48/45)和在蚊虫阶段动合子发育期间表达的受精后抗原(Pfs25和Pfs28)。不同于 Pfs25和Pfs28，受精前抗原也是天然免疫反应的目标且因此由基于任何这些抗原的疫苗诱导的免疫性将增加免疫性的天然加强的益处。因为传播阻断抗体靶向蚊虫媒介中的寄生虫所表达的抗原，所以预期所述抗体有效减少寄生虫传播到下一宿主。传播阻断抗体适用于减少群体(例如一个、两个、三个、四个、五个或五个以上个体的群组)中的疟原虫传播。 所述个体可存在于同一有限地理区域内，例如家庭或社区。疟原虫抗原—般来说，疟原虫抗原可以包括引发针对疟原虫属寄生虫的免疫反应的任何免疫原性多肽。根据本发明，所关注的免疫原性多肽可以独立多肽形式、以融合蛋白形式、以经修饰多肽(例如含有其它侧接基团，诸如碳水化合物基团、甲基、烷基[诸如甲基、乙基等]、 磷酸酯基、脂质基团、酰胺基、甲酰基、生物素基、血红素基、羟基、碘基、异戊二烯基、十四烷酰基、黄素基、软脂酰基、硫酸酯基、聚乙二醇等)形式提供。在一些实施例中，用于本发明的疟原虫抗原多肽具有是或包括与自然界中所发现的疟原虫多肽序列一致的序列的氨基酸序列；在一些实施例中，疟原虫抗原多肽具有是或包括与自然界中所发现的疟原虫多肽的特征性部分(例如免疫原性部分)一致的序列的氨基酸序列。在某些实施例中，利用全长蛋白质作为本发明的疫苗组合物中的疟原虫抗原多肽。在一些实施例中，使用疟原虫多肽的一个或一个以上免疫原性部分。在某些实施例中， 以一个或一个以上单独多肽形式或以一个或一个以上融合多肽中连接在一起的形式利用两个或三个或三个以上免疫原性部分。用于本发明的疟原虫抗原多肽可以包括全长疟原虫多肽、其融合物和/或其免疫原性部分。当无论单独还是以融合蛋白形式利用疟原虫蛋白质的部分时，所述部分都保留免疫活性(例如与抗疟原虫抗体的交叉反应性)。本发明涵盖认识到Pfs25多肽、PfdSg 肽、Pfs48/45多肽和/或Pfs230多肽是产生疫苗中所关注的抗原。因此，本发明提供表达异源蛋白质(例如疟原虫抗原多肽，诸如疟原虫蛋白质或其免疫原性部分，或包含疟原虫蛋白质或其免疫原性部分的融合蛋白)的植物细胞和植物。本发明的异源蛋白质可以包含所关注的任何疟原虫抗原多肽，包括(但不限于)Pfs25 多肽、PfdS多肽、Pfs48/45多肽和Pfs230多肽、其部分、其免疫原性部分、其融合物和/或其组合。所属领域中已知多种不同疟原虫Pfs25多肽、Pfs28多肽、Pfs48/45多肽和/ 或Pfs230多肽(例如来自不同物种和/或品系)的氨基酸序列且其可在诸如基因库 (GenBank)等公共数据库中获得。图1中提供多种疟原虫属物种和/或品系的Pfs25多肽、 Pfs28多肽、Pfs48/45多肽和Pfs230多肽的例示性全长蛋白质序列。
18
在某些实施例中，本发明的疫苗组合物中利用全长Pfs25。在一些实施例中，可使用Pfs25的一个或一个以上结构域。在某些实施例中，以一个或一个以上单独多肽形式或以在一个或一个以上融合多肽中连接在一起的形式利用两个或三个或三个以上结构域。图 1中呈示例示性Pfs25多肽的序列。在某些实施例中，本发明的疫苗抗原中利用全长PfdS抗原。在一些实施例中，可使用PfdS的结构域。在某些实施例中，两个或三个或三个以上结构域可用作本发明的抗原。某些例示性实施例提供包含全长PfdS但缺乏跨膜锚定肽序列的疟原虫抗原多肽。图 1中呈示例示性Pfs28多肽的序列。在某些实施例中，本发明的疫苗抗原中利用全长PfS48/45抗原。在一些实施例中，可使用Pfs48/45的结构域。在某些实施例中，两个或三个或三个以上结构域可用作本发明的抗原。某些例示性实施例提供包含全长Pfs48/45但缺乏跨膜锚定肽序列的疟原虫抗原多肽。图1中呈示例示性Pfs48/45多肽的序列。在某些实施例中，本发明的疫苗抗原中利用全长Pfs230抗原。在一些实施例中， 使用Pfs230的结构域。在某些实施例中，在本发明的抗原中提供两个或三个或三个以上结构域。某些例示性实施例提供包含全长Pfs230的疟原虫抗原多肽。图1中呈示例示性 Pfs230多肽的序列。还提供融合蛋白。融合物可包括经修饰的SEQ ID NO :40的地衣多糖酶B序列。 融合蛋白的实例展示于图M中；对应于疟原虫多肽或其部分的氨基酸序列加有下划线。融合蛋白可为具有以下任一者的氨基酸序列的多肽SEQ ID N0:152、1M、156、158、160、162、 164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、 202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、 M2、M4、M6、M8、250、252和254。在一些实施例中，融合蛋白可为与以下任一者的氨基酸序列具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%序列一致性的多肽SEQ ID NO :152、 154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、 192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、 232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252 和 254。在一些实施例中，融合蛋白构筑体可包括其它序列，例如前导序列和/或His/ KDEL标签。包含前导序列(斜体)和His/KDEL标签的融合蛋白构筑体的实例展示于表 24中且可包括具有以下氨基酸序列的多肽SEQ ID NO :44、46、48、50、52、54、57、59、61、 62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、97、99、101、103、105、107、109、 111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145、147 和 149。另外，范例提供若干种可用于本发明的其它疟原虫多肽序列。虽然本文提供例示性疟原虫抗原多肽的序列，但应了解可使用具有Pfs25多肽、 Pfs28多肽、Pfs48/45多肽和/或Pfs230多肽的免疫原性特征的任何序列。在一些实施例中，用于本发明的疟原虫抗原多肽具有如下氨基酸序列与选自图1中所示的任何序列的序列约60%—致、约70%—致、约80%—致、约85%—致、约90%—致、约91%—致、约 92%一致、约93%一致、约94%一致、约95%一致、约96%一致、约97%一致、约98%一致、 约99%—致或100%—致。在一些实施例中，所述疟原虫抗原多肽保留免疫原性活性。
在一些实施例中，用于本发明的疟原虫抗原多肽具有包含选自图1中所示的任何序列的序列的约50个至约700个连续氨基酸的氨基酸序列。在一些实施例中，疟原虫抗原多肽具有如下氨基酸序列与具有选自图1中所示的任何序列的序列的约100个氨基酸的连续段约60 % —致、约70 % —致、约80 % —致、约85 % —致、约90 % —致、约91 % —致、约 92%一致、约93% —致、约94% —致、约95% —致、约96% —致、约97% —致、约98% —致、 约99%—致或100%—致。在一些实施例中，用于本发明的疟原虫抗原多肽具有如下氨基酸序列包含选自图1中所示的任何序列的序列的约150个、约200个、约250个、约300个、约350个、约400 个、约450个、约500个、约550个或更多个连续氨基酸。在一些实施例中，疟原虫抗原多肽具有如下氨基酸序列与具有选自图1中所示的任何序列的序列的约150个、200个、250 个、300个、350个或更多个氨基酸的连续段约60%—致、约70%—致、约80%—致、约85% 一致、约90%—致、约91%—致、约92%—致、约93%—致、约94%—致、约95%—致、约 96%—致、约97%—致、约98%—致、约99%—致或100%—致。举例来说，与疟原虫抗原多肽具有足够一致性且保留免疫原性特征的序列能够同与本文所提供的一种或一种以上抗原反应的抗体结合。免疫原性特征常常包括相关氨基酸或侧基的三维呈现。所属领域的技术人员可容易地鉴别在序列上具有适度差异的序列(例如在边界和/或某些序列替代物中具有差异，然而仍保留免疫原性特征)。在一些实施例中，可从疟原虫多肽中删去图1中所示的任何例示性序列的特定部分和/或结构域。举例来说，？作251作观和？作48/45多肽通常含有跨膜锚定序列。本发明涵盖删去跨膜锚定序列的Pfs25、Pfs28和Pfs48/45多肽。我们已利用来自如本文所详述的特定物种的疟原虫属寄生虫的特定序列作为例示性抗原。存在各种物种的疟原虫属寄生虫且当新亚型出现时，其可被持续鉴别出。所属领域的技术人员应了解，本文所提供的方法和组合物可适合于利用其它物种的序列。本文所提供的方法和组合物涵盖和包涵所述变化。疟原虫多肽与热稳定性蛋白质的融合物在某些方面，提供包含融合多肽的疟原虫抗原多肽，所述融合多肽包含疟原虫蛋白质(或其部分或变异体)可操作地连接于热稳定性蛋白质。本发明融合多肽可在所属领域中已知的任何可用表达系统中制备。在某些实施例中，本发明融合蛋白是在植物或其部分(例如植物、植物细胞、根、芽等)中制备。人类或动物细胞中未天然发现的酶或其它蛋白质尤其适合用于本发明的融合多肽中。当融合时赋予融合产物热稳定性的热稳定性蛋白质是适用的。热稳定性允许所产生的蛋白质保持构形，且将所产生的蛋白质保持在室温下。这一特征有利于以容易、节省时间和节省成本的方式回收融合多肽。适用于本发明的热稳定性酶的代表性家族为葡聚糖水解酶家族。这些酶特异性裂解混合连接型多糖中与1，3-β键联相邻的1，4-β糖苷键(汉(Hahn)等人，1994 美国国家科学院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA), 91 :10417 ； 以引用的方式并入本文中)。这些酶发现于诸如燕麦和大麦等谷物中，而且也在包括热纤梭菌(C. thermocellum)等许多真菌和细菌物种中发现(金科瓦(Goldenkova)等人，2002， 分子生物学(Mol. Biol. )36:698;以引用的方式并入本文中)。因此，用于本发明的融合多肽中的所需热稳定性蛋白质包括糖苷酶。例示性热稳定性糖苷酶蛋白质包括由选自表1中所示的基因库保藏编号的基因库保藏编号表示的蛋白质，各自内容是通过完全并入各参考编号的基因库保藏信息以引用的方式并入本文中。用于本发明的融合蛋白中的例示性热稳定性酶包括热纤梭菌(Clostridium thermocellum)P^716、短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)P37073和海洋红嗜热盐菌(Rhodthermus marinus)P45798，其各自以引用其基因库保藏编号的方式并入本文中。代表性融合蛋白利用经修饰的从热纤梭菌分离的热稳定性酶，然而，根据本发明可类似地利用任何热稳定性蛋白质。例示性热稳定性糖苷酶蛋白质列于表1中表1 热稳定性糖苷酶蛋白质
权利要求
1.一种分离的融合蛋白，其包含热稳定性蛋白质和疟原虫(Plasmodium)多肽，其中所述疟原虫多肽为Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽或其免疫原性部分，且其中所述融合蛋白在投予个体时诱导或增强针对所述疟原虫多肽的免疫反应。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述热稳定性蛋白质为地衣多糖酶 (Iichenase)多月太。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶多肽为与SEQID N0:40具有至少90%序列一致性的经修饰的地衣多糖酶B多肽。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶B多肽与SEQID NO :40具有至少95%的序列一致性。
5.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶B多肽与SEQID NO :40具有至少98%的序列一致性。
6.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶B多肽与SEQID NO :40具有至少99%的序列一致性。
7.根据权利要求3所述的融合蛋白，其中所述地衣多糖酶多肽具有SEQID N0:40的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽为 Pfs25多肽，其中所述Pfs25多肽与SEQ ID NO 42具有至少90%的序列一致性。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQID N0:42具有至少 95%的序列一致性。
10.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQID N0:42具有至少 98%的序列一致性。
11.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQID N0:42具有至少 99%的序列一致性。
12.根据权利要求8所述的融合蛋白，其中所述Pfs25多肽具有SEQID NO :42的氨基酸序列。
13.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽为与 SEQ ID NO 55具有至少90%序列一致性的Pfs^多肽。
14.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQID NO :55具有至少95%的序列一致性。
15.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQID NO :55具有至少98%的序列一致性。
16.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQID NO :55具有至少99%的序列一致性。
17.根据权利要求13所述的融合蛋白，其中所述PfdSg肽具有SEQID NO :55的氨基酸序列。
18.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽为 Pfs48/45多肽，其中所述Pfs48/65多肽为与SEQ ID NO 62具有至少90%序列一致性的多肽。
19.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQID NO :62具有至少95%的序列一致性。
20.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQID NO :62具有至少98%的序列一致性。
21.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQID NO :62具有至少99%的序列一致性。
22.根据权利要求18所述的融合蛋白，其中所述Pfs48/45多肽具有SEQID NO :62的氨基酸序列。
23.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽为 Pfs230多肽，其中所述Pfs230多肽与SEQ ID NO 95具有至少90%的序列一致性。
24.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQID NO :95具有至少95%的序列一致性。
25.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQID NO :95具有至少98%的序列一致性。
26.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述疟原虫多肽与SEQID NO :95具有至少99%的序列一致性。
27.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述Pfs230多肽具有SEQID NO :95的氨基酸序列。
28.一种融合蛋白，其包含与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有至少90%的序列一致性的多肽:SEQ ID NO :152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、 176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、 214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252 和 254。
29.根据权利要求28所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有至少95%的序列一致性=SEQ ID NO :152、巧4、156、158、160、162、164、166、 168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、 206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、 246、248、250、252 和 254。
30.根据权利要求观所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有至少98%的序列一致性=SEQ ID NO :152、巧4、156、158、160、162、164、166、 168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、 206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、 246、248、250、252 和 254。
31.根据权利要求观所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白与选自由以下组成的群组的氨基酸序列具有至少 99% 的序列一致性=SEQ ID NO 152、154、156、158、160、162、164、166、 168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、 206、208、210、212、214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、 246、248、250、252 和 254。
32.根据权利要求观所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有选自由以下组成的群组的氨基酸序列:SEQ ID NO :152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、·176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、 214、216、218、220、224、226、228、230、232、234、236、238、240、242、244、246、248、250、252 和 254。
33.一种核酸，其包含编码根据权利要求1至32中任一权利要求所述的融合蛋白的序列。
34.一种表达载体，其包含根据权利要求33所述的核酸。
35.根据权利要求34所述的表达载体，其进一步包含前导序列。
36.根据权利要求34或35所述的表达载体，其中所述表达载体为农杆菌质粒 (Agrobacterial plasmid)、植物病毒载体或克隆到农杆菌质粒中的植物病毒载体。
37.一种宿主细胞，其包含根据权利要求34至36中任一权利要求所述的表达载体。
38.根据权利要求37所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为植物细胞。
39.一种植物，其包含根据权利要求38所述的植物细胞。
40.一种医药组合物，其包含根据权利要求1至32中任一权利要求所述的融合蛋白和医药学上可接受的载剂或赋形剂。
41.一种在个体中诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽，所述方法包含向所述个体投予有效量的根据权利要求40所述的医药组合物。
42.一种产生根据权利要求1至32中任一权利要求所述的融合蛋白的方法，所述方法包含(a)提供包含编码所述融合蛋白的核酸的核酸构筑体；(b)将所述核酸构筑体引入植物细胞中；和(c)在允许表达所述融合蛋白的条件下维持所述细胞。
43.一种制备诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应的组合物的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽，所述方法包含a)在植物中产生根据权利要求1至32中任一权利要求所述的融合蛋白；b)分离所述融合蛋白；和c)将步骤(b)的所述融合蛋白与医药学上可接受的载剂组合。
44.一种制备诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应的组合物的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或Pfs230多肽或其免疫原性部分，所述方法包含a)在植物中产生所述疟原虫多肽；b)分离所述多肽；和c)将所述多肽与医药学上可接受的载剂组合。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs25多肽，其中所述Pf s25 多肽为与SEQ ID NO :42具有至少90%序列一致性的多肽。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述Pfs25多肽具有SEQID NO :42的氨基酸序列。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述疟原虫多肽为PfdS多肽，其中所述PfdS 多肽为与SEQ ID NO :55具有至少90%序列一致性的多肽。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述PfdSg肽具有SEQID NO :55的氨基酸序列。
49.根据权利要求44所述的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs48/45多肽，其中所述 Pfs48/45多肽为与SEQ ID NO :62具有至少90%序列一致性的多肽。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述PfS48/45多肽具有SEQ ID NO :62的氨基酸序列。
51.根据权利要求44所述的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs230多肽，其中所述 Pfs230多肽为与SEQ ID NO 95具有至少90%序列一致性的多肽。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述Pfs230多肽具有SEQ ID NO :95的氨基酸序列。
53.根据权利要求42至52中任一权利要求所述的方法，其中所述植物短暂表达所述多肽或融合蛋白。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述短暂表达是来自农杆菌质粒、植物病毒载体或克隆到农杆菌质粒中的植物病毒载体。
55.根据权利要求42至52中任一权利要求所述的方法，其中所述植物是所述多肽的转基因植物。
56.根据权利要求43至55中任一权利要求所述的方法，其进一步包含将所述组合物与至少一种佐剂组合。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述佐剂是选自由以下组成的群组明矾、Quil A、QS21、氢氧化铝、磷酸铝、矿物油、MF59、Malp2、不完全弗氏佐剂(incomplete Freund' s adjuvant)、完全弗氏佐齐[J (complete Freund ‘ s adjuvant)、招胶(alhydrogel)、3 去-0-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)、脂质Α、百日咳杆菌(Bortadella pertussis)、结核分 feff (Mycobacterium tuberculosis)齐[J 65 (Merck Adjuvant 65)、_gji、^|_ 颗粒(virosome)、SBAS2、SBASl、AS03 和未甲基化 CpG 序列。
58.一种产生疟原虫多肽的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs25、Pfs28、Pfs48/45或 Pfs230多肽或其免疫原性部分，所述方法包含(a)提供包含编码所述疟原虫多肽的核酸的核酸构筑体；(b)将所述核酸构筑体引入植物细胞中；和(c)在允许表达所述融合蛋白的条件下维持所述细胞。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs25多肽，其中所述Pf s25 多肽为与SEQ ID NO :42具有至少90%序列一致性的多肽。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述Pfs25多肽具有SEQID NO :42的氨基酸序列。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述疟原虫多肽为PfdS多肽，其中所述PfdS 多肽为与SEQ ID NO :55具有至少90%序列一致性的多肽。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述Pfs28多肽具有SEQ ID NO :55的氨基酸序列。
63.根据权利要求58所述的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs48/45多肽，其中所述 Pfs48/45多肽为与SEQ ID NO :62具有至少90%序列一致性的多肽。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述PfS48/45多肽具有SEQ ID NO :62的氨基酸序列。
65.根据权利要求58所述的方法，其中所述疟原虫多肽为Pfs230多肽，其中所述 Pfs230多肽为与SEQ ID NO 95具有至少90%序列一致性的多肽。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述Pfs230多肽具有SEQID NO 95的氨基酸序列。
67.根据权利要求38、39或42至66中任一权利要求所述的方法，其中所述植物是来自选自由以下组成的群组的属芸苔属(Brassica)、烟草属(Nicotiana)、矮牵牛属(Petunia)、西红棉属(Lycopersicon)、^jp 属(Solanum)、番椒属(Capsium)、古月萝卜属(Daucus)、旱芹属(Apium)、莴苣属(Lactuca)、芥子属(Sinapis)或拟南芥属 (Arabidopsis)。
68.根据权利要求38、39或42至66中任一权利要求所述的方法，其中所述植物是来自选自由以下组成的群组的物种本塞姆氏烟草(Nicotima benthamima)、埃塞俄比 M^f (Brassica carinata) λ^f^ (Brassica juncea) λ 1^^11 (Brassica napus) λS^f (Brassica nigra) λ(Brassica oleraceae) λ^Ρ^ ^Ρ (Brassica tournifortii)、白芥子(Sinapis alba)禾口萝卜(Raphanus sativus)。
69.根据权利要求38、39或42至66中任一权利要求所述的方法，其中所述植物是选自由以下组成的群组紫花苜蓿(alfalfa)、萝卜(radish)、芥菜(mustard)、绿豆(mung bean)、西兰花(broccoli)、/K 田序(watercress)、大豆(soybean)、小麦(wheat)、向日葵 (sunflower)、卷心菜(cabbage)、三叶草(clover)、矮牵牛(petunia)、西红棉(tomato)、马(potato)(tobacco) ^ (spinach)禾口/j、j^_M (lentil)。
70.根据权利要求38、39或42至66中任一权利要求所述的方法，其中所述植物为发芽的籽苗。
71.根据权利要求43至70中任一权利要求所述的方法，其中通过根据权利要求58所述的方法来进行步骤(a)。
72.—种植物细胞，其是通过根据权利要求58至71中任一权利要求所述的方法产生的。
73.一种植物，其包含根据权利要求72所述的植物细胞。
74.一种在个体中诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应的方法，所述方法包含向个体投予通过根据权利要求42、58至73中任一权利要求所述的方法产生的植物或植物细胞。
75.—种在个体中诱导或增强针对疟原虫多肽的免疫反应的方法，所述方法包含向所述个体投予治疗有效量的通过根据权利要求43至55中任一权利要求所述的方法产生的组合物。
76.根据权利要求41或75所述的方法，其中经口、鼻内、皮下、静脉内、腹膜内或肌肉内投予所述组合物。
77.根据权利要求41、74至76中任一权利要求所述的方法，其中所述个体为人类。
78.根据权利要求41、74至76中任一权利要求所述的方法，其中所述个体为非人类灵长类动物、鸟类或啮齿动物。
79.一种保护个体群体免受疟原虫感染的方法，所述方法包含向个体投予有效量的根据权利要求40所述的组合物。
80.一种减少疟原虫在个体群体中传播的方法，所述方法包含向一个或一个以上个体投予有效量的根据权利要求40所述的组合物。
81.一种减少疟原虫传播到处于疟原虫感染风险中的群体中的个体的方法，所述方法包含向所述群体中的一个或一个以上个体投予有效量的根据权利要求40所述的组合物。
82.—种减少疟原虫从个体传播的方法，所述方法包含向所述个体投予有效量的根据权利要求40所述的组合物。
83.根据权利要求79至82中任一权利要求所述的方法，其中所述个体为人类。
84.根据权利要求79至82中任一权利要求所述的方法，其中所述个体为非人类灵长类动物、鸟类或啮齿动物。
全文摘要
本发明涉及免疫学和蛋白质工程改造的交叉领域，且具体来说涉及适用于预防疟原虫属(Plasmodium)寄生虫感染的抗原和疫苗。提供重组蛋白抗原、组合物和在植物中产生所述抗原的方法。在一些实施例中，疟原虫抗原包括Pfs25多肽、Pfs28多肽、Pfs48/45多肽、Pfs230多肽和/或其组合。
文档编号C12N15/82GK102227444SQ200980147667
公开日2011年10月26日 申请日期2009年9月28日 优先权日2008年9月28日
发明者克里斯蒂娜·E·法兰斯, 康斯坦丁·穆西丘克, 瓦季姆·梅特, 维达季·尤西波夫 申请人:美国弗劳恩霍夫股份有限公司