用于单细胞克隆培养用培养板及其应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于单细胞克隆培养用培养板及其应用方法，培养板包括培养板盖和培养板底，培养板底上设置有细胞培养部，细胞培养部具有多个呈阵列状布置的细胞培养单室，细胞培养单室的周壁和底壁围成一容置细胞的培养孔，并且周壁的底部为培养孔内细胞不能通过并且非细胞物质可通过的通透膜，细胞培养部还具有多个与纵向成排或横向成排的细胞培养单室相对应的加液取液槽，该加液取液槽与相对应的纵向成排或横向成排的每个细胞培养单室的培养孔通过其上的通透膜依次相连通，培养板底上还设置有湿化槽，该湿化槽位于细胞培养部的四周。本发明提高了单细胞克隆纯度，消除了培养过程中换培养液困难和细胞容易损伤等培养困难的现象。
【专利说明】用于单细胞克隆培养用培养板及其应用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于单细胞克隆培养用培养板及其应用方法，属于生物细胞培养【技术领域】。
【背景技术】
[0002]目前，随着分子生物学研究的快速发展，细胞和组织的体外培养已成为生命研究中非常重要的研究内容，从人体细胞到动物细胞都成为人们培养研究的对象。研究发现:细胞的生长方式有多种，如:悬浮状态下生长、半悬浮状态下生长和贴壁生长等等。因此，为了满足不同细胞的生长状态，需要提供各种规格的细胞培养装置来满足从单细胞到单细胞克隆群的培养需要。
[0003]所谓单细胞克隆就是将一个细胞进行培养，使之不断分裂形成一个细胞群的过程，也就是说这一群细胞来源于一个共同的祖先细胞。以肿瘤细胞克隆群为例，肿瘤球培养是一种近年发展的一种肿瘤体外培养系统，是由肿瘤单细胞在培养中自发聚集而成的小细胞团块，它是一种类似肿瘤小结节的三维结构培养物，具有活体肿瘤组织的许多特点，如细胞紧密排列、延续性低氧细胞群以及异质性。它由于功能性细胞增生而生长，故存在一定数量肿瘤分化细胞。这些特征是其他体外培养系统所不具备的。
[0004]但目前为止，对于单细胞克隆培养，还没有专门的较为完善的细胞培养装置。目前最常用的单细胞克隆培养方法是将细胞进行无限稀释，达到一定的稀释浓度后在培养皿中培养或加入96孔板培养，以实现单个细胞的独立生长成为克隆。现有的培养方式具有以下几个缺陷:(I)由于单细胞占用空间相对较小，用一般的培养皿进行培养，使得细胞所处的环境非常大，细胞自身分泌的一些因子被极度稀释，影响了细胞的自我调节和生长速度，这样的生长方式不仅不利于细胞的生长，还造成培养液过度浪费；(2)以贴壁细胞为例，在培养皿中培养的细胞在贴壁前处于漂浮状态，很容易与另一个细胞接触或在同一个地方贴壁形成一个克隆，随着细胞增殖数目增多，处于分裂状态的细胞由于贴壁性较差，也会移动到别的细胞克隆里，形成了一个“串门”现象，不能完全保证克隆的单一来源性；(3)以悬浮和半悬浮细胞为例，为了保证细胞生长的营养需要，培养的过程中需要给细胞加入新鲜的培养液，但由于细胞呈悬浮或半悬浮状态，在换液时细胞很容易被不小心吸走，因此现有的培养皿对于培养液的更换难度较大大，且容易破坏细胞。(4)此外，在筛选转基因细胞时，由于部分细胞转染效率低下，当转染后只获得数量很少的阳性细胞时，进行常规药物筛选和单克隆培养具有很大的难度。现有的一些专利针对上述问题已做适当的改进，但还存在一些不足。例如:一种适用单细胞的细胞培养皿(中国专利申请号:201320486155.1)，该培养装置设计了生物膜使皿底的培养液进入培养室，同时阻止细胞通过，保证了单细胞的培养方式不被破坏，即便是悬浮细胞需要更换培养液也很方便，但该装置结构复杂对后续的研究观察不适合，如高通量筛选、后续的共聚焦和荧光显微镜观察等；一种盖玻片上生长细胞克隆求的方法(专利申请号:200710076533.8)和一种单细胞克隆培养方法(专利申请号:201410166605.8)，该两项专利中发明的培养方法相对简单实用，但也存在以下几点缺陷:(1)由于培养体系较小5-10 μ 1，细胞的培养周期在10天左右，培养装置放置在37°C的环境中培养，培养液很容易因为蒸发而干涸；(2)细胞克隆培养周期较长，在培养过程中为了给细胞添加营养多次更换新培养液，而这种简易装置使得培养的细胞很容易被污染；(3)仅适用于贴壁细胞培养；(4)无法同时实现多个样本的批量操作。下面一项发明专利:一种多孔单细胞观测板及其应用(专利申请号:201210299175.8)较前面二项专利已有较大的改进，设计了与排枪和液体自动点样仪匹配的孔间距，使得系统能够实现高通量与自动化。但该装置仅适合单细胞单层培养观察。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种用于单细胞克隆培养用培养板，它提高了单细胞克隆纯度，消除了培养过程中换培养液困难和细胞容易损伤等培养困难的现象。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是:一种用于单细胞克隆培养用培养板，它包括培养板盖和培养板底，培养板底上设置有细胞培养部，细胞培养部具有多个呈阵列状布置的细胞培养单室，细胞培养单室的周壁和底壁围成一容置细胞的培养孔，并且周壁的底部为培养孔内细胞不能通过并且非细胞物质可通过的通透膜，细胞培养部还具有多个与纵向成排或横向成排的细胞培养单室相对应的加液取液槽，该加液取液槽与相对应的纵向成排或横向成排的每个细胞培养单室的培养孔通过其上的通透膜依次相连通，培养板底上还设置有湿化槽，该湿化槽位于细胞培养部的四周。
[0007]进一步为了便于细胞定位，所述的多个呈阵列状布置的细胞培养单室的水平方向和垂直方向上编有编号以便细胞定位。
[0008]进一步为了使得本培养板可以与本领域常用的排枪和自动点样仪所适配，使得系统能够实现高通量与自动化，所述的多个培养孔之间为等间距布置。
[0009]进一步提供了一种细胞培养单室的具体结构，所述的细胞培养单室的周壁的上三分之二部分的材质与培养板底的材质相同，下三分之一部分由通透膜制成。
[0010]进一步使得贴壁细胞更易贴壁生长，所述的细胞培养单室的底壁上设置有多聚赖氨酸层。
[0011]进一步，培养板盖和培养板底均由聚丙烯或聚苯乙烯或聚乙烯或聚碳酸酯或聚酯或高密度聚乙烯材质制成。
[0012]进一步提供了一种细胞不能通过而非细胞物质例如细胞培养基、细胞因子、营养成分、二氧化碳、氧气等能够自由通过的通透膜结构，所述的通透膜为生物膜。
[0013]本发明还提供了一种该用于单细胞克隆培养用培养板的应用方法，该方法的步骤如下:
[0014](a)制备培养液微滴:预先对细胞培养部的所有培养孔中加入体积百分比浓度含20%的胎牛血清的细胞培养液，并在湿化槽中加入磷酸盐缓冲液，并放于细胞培养箱中温育平衡，等待放入目标细胞。
[0015](b)制备单细胞悬液，并从单细胞悬液中筛选出目标细胞；
[0016](c)将目标细胞逐一放入经过步骤(a)处理的培养孔的培养液内，进行目标细胞培养；
[0017](d)待目标细胞增殖至一定数量后，进行半量换液处理，然后继续培养；其中，半量换液处理方法为:将该培养板向有加液取液槽的一侧倾斜，吸出原有培养液总体积的一半，再加入一半新鲜的温育好的培养液；
[0018](e)扩大培养:取出经过步骤(d)处理后的培养孔内的目标细胞，将其移入至多孔细胞培养板中进行培养至长满，即获得单细胞克隆。
[0019]进一步，所述的步骤(b)包含如下步骤:
[0020](bl)准备显微操作系统:利用拉针仪拉制出细胞操作针，并安装到显微操作仪上；
[0021](b2)制备单细胞悬液:将处于对数生长期的目标细胞的细胞培养液吸干，用磷酸盐缓冲液清洗一遍，然后加入适量胰酶消化液消化处理，再加入适量含血清的培养液终止消化，再用Iml移液器吹打培养皿底，将所得细胞悬液移入离心管中离心，弃上清，最后加入适量细胞培养液悬浮细胞，制成单细胞悬液，并放置在细胞培养皿中；
[0022](b3)筛选单细胞:将步骤(b2)中准备好的单细胞悬液取出，利用步骤(bl)所述的显微操作系统根据筛选要求挑选目标细胞，将目标细胞逐一放入细胞操作针内。
[0023]进一步，所述的步骤(e)的具体步骤如下:将步骤(d)中培养的细胞的培养液吸干，在加液取液槽中加入磷酸盐缓冲液，用磷酸盐缓冲液清洗，再将磷酸盐缓冲液吸干，然后在加液取液槽加入适量胰酶消化液消化处理，接着再加入适量血清的培养液终止消化，再用100 μ I移液器吹打各培养孔，将所得细胞悬液移入离心管中离心，弃上清，最后加入适量细胞培养液悬浮细胞，并将其移入至多孔细胞培养板中进行培养至长满，即获得单细胞克隆。
[0024]采用了上述技术方案后，本发明具有以下的有益效果:
[0025]1、解决了单细胞克隆培养换液难和对细胞损伤的问题。
[0026]2、该培养板对于悬浮细胞、半悬浮细胞和贴壁细胞的单细胞克隆都适合。
[0027]3、解决了微量培养基的培养，使得细胞自分泌的细胞因子不被大量稀释问题，更利于细胞的生长。
[0028]4、可以实时动态观察细胞的生长，及时了解实验结果。
[0029]5、该培养板的各培养孔间为等间距，使得该培养板可以与本领域常用的排枪和自动点样仪所适配，使得系统能够实现高通量与自动化。
[0030]6、周围有湿化槽可以有效防止微量体积的单细胞克隆培养细胞被干涸的问题。
[0031]7、通透膜可以保证微环境的稳定，同时可以阻止细胞本身通过，保证了单细胞的培养方式不被破坏。
[0032]8、本研究利用显微操作系统和本培养板培养体系，可以在高倍镜下仔细的挑选优质待筛选的细胞，再逐个地放入培养孔中制作好的培养液中，由于细胞培养单室的周壁的下方由通透膜组成，使得培养孔中的细胞不会发生直接接触，保证了细胞克隆的单一性。
[0033]9、由于一排的培养孔呈串联排列，可以更好地模拟细胞生长的体内环境。例如在这一排培养孔中，可以分别放入肿瘤细胞、血管内皮细胞、纤维细胞等等肿瘤周边的基质细胞，更利于各细胞分泌的细胞因子间的信息交换。
[0034]10、由于是人为挑选，所以会对稀缺细胞可以实现高效筛选。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为本发明的用于单细胞克隆培养用培养板的培养板盖的结构图；
[0036]图2为本发明的培养板底的俯视图；
[0037]图3为本发明的培养板底的横断面图；
[0038]图4为本发明的细胞培养单室的结构示意图。
【具体实施方式】
[0039]为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
[0040]如图1?4所不,一种用于单细胞克隆培养用培养板,它包括培养板盖I和培养板底2，培养板底2上设置有细胞培养部，细胞培养部具有多个呈阵列状布置的细胞培养单室3，细胞培养单室3的周壁3-1和底壁3-2围成一容置细胞的培养孔31，并且周壁3-1的底部为培养孔31内细胞不能通过并且非细胞物质可通过的通透膜3-1-1，细胞培养部还具有多个与纵向成排或横向成排的细胞培养单室3相对应的加液取液槽4，该加液取液槽4与相对应的纵向成排或横向成排的每个细胞培养单室3的培养孔21通过其上的通透膜3-1-1依次相连通，培养板底2上还设置有湿化槽5，该湿化槽5位于细胞培养部的四周。
[0041]如图1、2所示，多个呈阵列状布置的细胞培养单室3的水平方向和垂直方向上编有编号以便细胞定位。
[0042]本培养板即包括培养板盖I和培养板底2的材质:与目前市场所用的96孔板、24孔板和6孔板相同，可以是PP聚丙烯或PS聚苯乙烯或PE聚乙烯或PC聚碳酸酯或PET聚酯或HDPE高密度聚乙烯等材料。
[0043]培养板盖1:大小与目前市场所用的96孔板相同，外部尺寸128*86mm。
[0044]培养板底2:外部尺寸与目前市场所用的96孔板相同，在培养板底2的四周设有湿化槽5，以防细胞长期培养被干涸。
[0045]培养孔31:培养孔31上口呈圆形，其直径大小在9mm左右，培养孔31与培养孔31间为等间距，使得该培养板可以与本领域常用的排枪和自动点样仪所适配，使得系统能够实现高通量与自动化。
[0046]细胞培养单室3的周壁3-1:上三分之二的材质与培养板底2的材质相同，下三分之一为通透膜3-1-1，该通透膜3-1-1具有:(1)对于细胞培养基而言是可通透的，它能够吸收、引导培养基进入本发明的细胞培养孔中；(2)对于细胞因子、信号分子而言是可以通透的；(3)对于细胞而言是不能通透的，即细胞本身不能穿过；(4)通透膜3-1-1为生物膜，可以为微孔膜，孔径大小使得细胞不能通过，而细胞培养基、细胞因子、营养成分、二氧化碳、氧气等能够自由通过，通透膜3-1-1的存在使得细胞能够方便地进行细胞通信等相互作用。
[0047]培养孔底，也就是底壁3-2:呈圆形，其直径大小在3mm左右，表面经Poly-D-Lysine处理,使得贴壁细胞更易贴壁生长。底面的材质可以是市售培养皿材质或
0.17mm的玻璃片(激光共聚焦、活细胞工作等细胞观察)等等，以便后续研究。
[0048]培养孔31的数目可根据不同的实验要求设计相应的个数。
[0049]加液取液槽4:纵向成排或纵向成排的各培养孔31与相对应的加液取液槽4呈一串连的连通器，在需要更换培养及时只要将培养板向有加液取液槽4的一侧倾斜，就可以很容易地将一纵排或以横排的所有培养孔31中的培养基吸掉，再向里面加入新的培养基，即可达到换液的目的，因此本装置解决了单克隆细胞培养换液难和对克隆球损伤的问题。另外该装置无论是贴壁细胞还是悬浮和半悬浮细胞都可以用该装置进行细胞的克隆培养，也就是说它的适用范围非常广泛。
[0050]一种用于单细胞克隆培养用培养板的应用方法，包括以下步骤:
[0051]步骤1:制备培养液微滴:预先对培养板除加液取液槽4之外的所有培养孔31中加入体积百分比浓度含20%的胎牛血清的细胞培养液，5-10 μ I/孔，在湿化槽5中加入无菌的磷酸盐缓冲液，并放于细胞培养箱中温育平衡，等待放入细胞。
[0052]步骤2:准备显微操作系统:利用拉针仪拉制出细胞操作针，并安装到显微操作仪上。
[0053]步骤3:制备单细胞悬液:将处于对数生长期的目的细胞培养液吸干，用磷酸盐缓冲液清洗一遍，然后加入0.2-lml胰酶消化液(磷酸盐缓冲液、胰蛋白酶和EDTA的混合液，其中胰蛋白酶0.25wt%, EDTA0.02wt% )消化1_2分钟，加入适量含血清的培养液终止消化，再用Iml移液器吹打培养皿底8-10次左右，将所得细胞悬液移入离心管中，离心2000rpmX5分钟，弃上清，最后加入3_5ml细胞培养液悬浮细胞，制成单细胞悬液，放入直径60mm细胞培养皿中制得单细胞悬液。
[0054]步骤4:筛选单细胞:将步骤3中准备好的单细胞悬液取出，利用步骤2中的显微操作系统根据筛选要求挑选目标细胞，将目标细胞逐一放入细胞操作针内。
[0055]步骤5:利用步骤4所述的显微操作系统将操作针内的目标细胞逐一放入步骤I的培养孔的培养液内，然后进行细胞培养。
[0056]步骤6:对步骤5培养的细胞经2-3天培养后，细胞数增殖至50个左右进行半量换液，即将培养板向有加液取液槽4的一侧倾斜，吸出原有培养液总体积的一半，加入一半温度为37°C的新鲜的温育好的培养液，继续培养2-3天。
[0057]步骤7:扩大培养:对步骤6中培养的细胞的培养液吸干，在加液取液槽4中加入磷酸盐缓冲液，用磷酸盐缓冲液清洗一遍，将磷酸盐缓冲液吸干，然后在加液取液槽加入0.3-0.5ml胰酶消化液(磷酸盐缓冲液、胰蛋白酶和EDTA的混合液，其中胰蛋白酶0.25wt %, EDTA0.02wt % )消化1_2分钟，接着加入适量含的含血清的培养液终止消化，再用100 μ I移液器吹打各培养孔8-10次左右，将所得细胞悬液移入离心管中，离心2000rpmX5分钟，弃上清，最后加入200 μ I细胞培养液悬浮细胞，并将其移入至96孔细胞培养板中进行培养，3天左右可长满，即获得单细胞克隆。
[0058]由上述步骤可知，通过本发明方法，单个的细胞被置于单个培养孔31中培养，克服了现有技术中的几大难题:(I)在本培养板中纵向或横向的培养孔31之间与加液取液槽4呈串联，只要将培养板向加液取液槽4侧倾斜，就可以实现本排所有培养孔31中的细胞换液，解决了单克隆细胞培养换液难的问题；(2)由于本培养板设有加液取液槽4，所以在给细胞换液时不会接触到细胞，因此不会对细胞克隆有损伤；(3)细胞扩大培养前的处理较现有技术方便，只需在加液取液槽41中加入磷酸盐缓冲液、胰酶、和培养基，然后再向相反方向倾斜，即可迅速实现相应的处理，大大可以节省研究人员的工作时间；(4)在培养板的四周设有湿化槽5，可以有效防止细胞长时间培养而发生干涸；(5)细胞培养初期，其培养液的量仅有5-10 μ I，细胞所处的环境较小，细胞自身分泌一些促进自我生长的营养因子和功能因子，能够更好的调节自身生长，而不会被过度稀释；(6)各培养孔31中培养的细胞不会发生移动到别的细胞克隆里，能够完全保证克隆的单一来源性；(7)本方法所获得的每一个单克隆，其细胞同源性(即遗传物质完全相同)均为100%，无需证明，而用常规方法所获得的单克隆，其细胞同源性从50% -100%，都有可能，需要进一步证明其同源性；
(8)无论是贴壁细胞，还是悬浮与半悬浮细胞本培养板都适合；(9)由于培养孔与培养孔间为等间距排列，设计与排枪和液体自动点样仪匹配的孔间距，使得系统真正能实现高通化与自动化。
[0059]用本方法进行单克隆培养，在72小时后一个细胞可增殖为近50枚细胞，120小时后可增殖为近800-1000枚细胞，此时消化后移入96孔板培养，3天后可长满，耗时约8左右；而用常规方法培养在96孔板中，细胞长满至少需10-15天，因此为单克隆细胞的获得的时间大大地被缩短。
[0060]下面详细描述一种应用该培养板培养LC3转染乳腺癌MCF-7细胞的应用方法，包括以下步骤:
[0061]步骤1:制备培养液微滴:预先对培养板除加液取液槽4之外的所有培养孔31中加体积百分比浓度含20%的胎牛血清的DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)细胞培养液，5-10 μ I/孔，在湿化槽5中加入无菌的磷酸盐缓冲液，并放于细胞培养箱中温育平衡，等待放入细胞。
[0062]步骤2:准备显微操作系统:利用拉针仪制作内径为20μπι前端钝口的细胞操作针，安装到显微操作仪(Eppendorf公司，型号ΝΚ2)
[0063]步骤3:将前一天转染绿色荧光蛋白LC3稳定转染的乳腺癌MCF-7细胞培养液吸干，用磷酸盐缓冲液清洗一次，然后加入0.5-lml的0.25%的胰酶消化液消化1_2分钟,力口入适量含血清的培养液终止消化，再用Iml移液器吹打培养皿底8-10次左右，将所得细胞悬液移入离心管中，离心2000rpmX5分钟，弃上清，最后加入l_2ml细胞培养液悬浮细胞，制成LC3稳定转染的乳腺癌MCF-7细胞单细胞悬液
[0064]步骤4:筛选单细胞:将待筛选单LC3稳定转染的乳腺癌MCF-7细胞悬液放入直径60_细胞培养皿，利用步骤2所述的显微操作系统，在荧光显微镜下挑选绿色、圆形、白光下胞质均匀的细胞逐个吸入显微操作针内，在吸入约10个细胞时进行下一步操作。
[0065]步骤5:利用步骤4所述的显微操作系统将操作针内的LC3稳定转染的乳腺癌MCF-7细胞逐一放入步骤I的培养孔31的培养液内，然后进行细胞培养；
[0066]步骤6:将培养LC3稳定转染的乳腺癌MCF-7单细胞每天进行观察，当细胞生长达到30-40%左右时，约48小时进行半量换培养液，即将培养板向有加液取液槽4的一侧倾斜,吸出原有培养液总体积的一半,再加入一半新鲜含20%胎牛血清的培养液中，继续培养;
[0067]步骤7:扩大培养:对步骤6中培养的LC3稳定转染的乳腺癌MCF-7单细胞培养达到90%汇合度时(100-120小时)，从加液取液槽4中吸去培养液，用37摄氏度预热的磷酸盐缓冲液轻柔洗涤3次，然后加入胰酶消化液消化处理，将培养孔31中消化出的细胞(1000枚左右)移入96孔板进行继续培养，3天后长满获得单细胞克隆。
[0068]以上所述的具体实施例，对本发明解决的技术问题、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种用于单细胞克隆培养用培养板，其特征在于:它包括培养板盖(I)和培养板底(2)，培养板底(2)上设置有细胞培养部，细胞培养部具有多个呈阵列状布置的细胞培养单室(3)，细胞培养单室(3)的周壁(3-1)和底壁(3-2)围成一容置细胞的培养孔(31)，并且周壁(3-1)的底部为培养孔(31)内细胞不能通过并且非细胞物质可通过的通透膜(3-1-1)，细胞培养部还具有多个与纵向成排或横向成排的细胞培养单室(3)相对应的加液取液槽(4)，该加液取液槽(4)与相对应的纵向成排或横向成排的每个细胞培养单室(3)的培养孔(21)通过其上的通透膜(3-1-1)依次相连通，培养板底(2)上还设置有湿化槽(5)，该湿化槽(5)位于细胞培养部的四周。
2.根据权利要求1所述的用于单细胞克隆培养用培养板，其特征在于:所述的多个呈阵列状布置的细胞培养单室(3)的水平方向和垂直方向上编有编号以便细胞定位。
3.根据权利要求1所述的用于单细胞克隆培养用培养板，其特征在于:所述的多个培养孔(31)之间为等间距布置。
4.根据权利要求1所述的用于单细胞克隆培养用培养板，其特征在于:所述的细胞培养单室(3)的周壁(3-1)的上三分之二部分的材质与培养板底(2)的材质相同，下三分之一部分由通透膜(3-1-1)制成。
5.根据权利要求1所述的用于单细胞克隆培养用培养板，其特征在于:所述的细胞培养单室(3)的底壁上设置有多聚赖氨酸层。
6.根据权利要求1或4所述的用于单细胞克隆培养用培养板，其特征在于:培养板盖(I)和培养板底(2)均由聚丙烯或聚苯乙烯或聚乙烯或聚碳酸酯或聚酯或高密度聚乙烯材质制成。
7.根据权利要求1所述的用于单细胞克隆培养用培养板，其特征在于:所述的通透膜(3-1-1)为生物膜。
8.—种如权利要求1至7中任一项所述的用于单细胞克隆培养用培养板的应用方法，其特征在于该方法的步骤如下: (a)制备培养液微滴:预先对细胞培养部的所有培养孔(31)中加入体积百分比浓度含20%的胎牛血清的细胞培养液，并在湿化槽(5)中加入磷酸盐缓冲液，并放于细胞培养箱中温育平衡，等待放入目标细胞。 (b)制备单细胞悬液，并从单细胞悬液中筛选出目标细胞； (c)将目标细胞逐一放入经过步骤(a)处理的培养孔(31)的培养液内，进行目标细胞培养； (d)待目标细胞增殖至一定数量后，进行半量换液处理，然后继续培养；其中，半量换液处理方法为:将该培养板向有加液取液槽(4)的一侧倾斜，吸出原有培养液总体积的一半，再加入一半新鲜的温育好的培养液； (e)扩大培养:取出经过步骤(d)处理后的培养孔内的目标细胞，将其移入至多孔细胞培养板中进行培养至长满，即获得单细胞克隆。
9.根据权利要求8所述的用于单细胞克隆培养用培养板的应用方法，其特征在于所述的步骤(b)包含如下步骤: (bl)准备显微操作系统:利用拉针仪拉制出细胞操作针，并安装到显微操作仪上； (b2)制备单细胞悬液:将处于对数生长期的目标细胞的细胞培养液吸干，用磷酸盐缓冲液清洗一遍，然后加入适量胰酶消化液消化处理，再加入适量含血清的培养液终止消化，再用Iml移液器吹打培养皿底，将所得细胞悬液移入离心管中离心，弃上清，最后加入适量细胞培养液悬浮细胞，制成单细胞悬液，并放置在细胞培养皿中； (b3)筛选单细胞:将步骤(b2)中准备好的单细胞悬液取出，利用步骤(bl)所述的显微操作系统根据筛选要求挑选目标细胞，将目标细胞逐一放入细胞操作针内。
10.根据权利要求8所述的用于单细胞克隆培养用培养板的应用方法，其特征在于所述的步骤(e)的具体步骤如下:将步骤(d)中培养的细胞的培养液吸干，在加液取液槽(4)中加入磷酸盐缓冲液，用磷酸盐缓冲液清洗，再将磷酸盐缓冲液吸干，然后在加液取液槽(4)加入适量胰酶消化液消化处理，接着再加入适量血清的培养液终止消化，再用100 μ I移液器吹打各培养孔(31)，将所得细胞悬液移入离心管中离心，弃上清，最后加入适量细胞培养液悬浮细胞，并将其移入至多孔细胞培养板中进行培养至长满，即获得单细胞克隆。
【文档编号】C12M3/00GK104232486SQ201410510490
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】周如鸿, 徐加英, 赵琳 申请人:浙江大学常州工业技术研究院