脱脂蚕蛹渣用于产油微生物培养的预处理方法及其产物和应用的制作方法
【专利摘要】脱脂蚕蛹渣用于产油微生物培养的预处理方法及其产物和应用，由下述步骤组成：超声波-离子液体预处理蚕蛹渣：取粗脱脂蚕蛹与离子液体混合，用蒸馏水洗脱、离心，除去离子液体；将预处理好的蚕蛹渣用蒸馏水配制，加入蛋白酶，调节溶液pH值分别到所加蛋白酶的最适pH，并且在反应过程中加酸或加碱维持调节，参照所加蛋白酶的最适反应温度，再搅拌水解，水解结束后，用沸水浴对酶灭活，离心，取上清备用。本发明以离子液体为反应介质，超声波场致强化预处理蚕蛹渣，以蛋白酶为催化剂制备蛋白水解液，用于产油微生物培养，旨在提高蚕蛹资源的利用率，增加油脂的产率。
【专利说明】脱脂蚕蛹渣用于产油微生物培养的预处理方法及其产物和 应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物资源与环境【技术领域】，具体涉及一种脱脂蚕蛹渣用于产油微生物 培养的预处理方法及其产物和应用。
【背景技术】
[0002] 传统的化石燃料，如石油、煤和天然气，仍然在全球范围内占据主导地位。近年来， 随着这些传统的不可再生燃料的消耗以及其对环境造成的多种不利影响，人们将目光投向 新型燃料，生物柴油因其碳中性和环境友好性吸引了社会各界广泛的兴趣。传统的生物柴 油原料来源主要为植物油（菜籽油、玉米、大豆、棕榈油、椰子）。然而，如果这些原料如果要 持续供给必然会与粮争地，同时原材料的收获期过程也较长。亟需寻找一个可持续供给、成 本低及具有潜在促进产油微生物生长的生物质原料。Zhanyou Chi等人提出了利用生物柴 油生产中的副产物一粗甘油作为碳源培养产油微生物，实现了生物质的循环利用（Process Biochemistry，2007,42 (11) :1537-1545)。发明 CN 102080119A 公开了利用工业废水共培 养酵母和藻类，能够更有效地降解废水的C0D，也促进了营养成分的合理利用，利于油脂的 合成。除了直接利用废弃物培养微生物，也可以将难降解的生物质处理后用于微生物培养， 发明专利CN 102061318A提出利用诸如甘蔗渣、木屑、秸杆等农林废弃物，利用纤维素酶将 其水解成单糖或寡糖，用于发酵生产生物油脂。同时，发明专利CN 102451829A公开了利用 餐厨垃圾利用酵母发酵和萃取获得微生物油脂。因此，生物废弃物资源在微生物油脂生产 上具有广阔的利用空间。
[0003] 蚕蛹是缫丝行业中的主要副产物之一，通常缫制I t生丝产生I. 5t的干蚕蛹 (Engineering Fracture Mechanics. 2007, 74 (12): 1953-1962)。作为香蛹的主要生产地， 我国每年生产的蚕蛹占全球的75%，同时，蚕蛹中含有丰富的蛋白质、脂肪酸、几丁质等成 分，其中，蚕蛹蛋白产量约为51%?59%，由于存放不当和缺乏相应的深加工技术，大量 蚕蛹仅被用作肥料和饲料。少数被用作化妆品和食品的添加剂，发明专利CN 102308973A 公开了一种利用将蚕蛹添加酱油中，提高其营养价值。今年来，随着人们对保健的愈发重 视，蚕蛹因其丰富的蛋白质及氨基酸组成，被用作生物活性多肽生产的又一重要原料，专 利CN 102604747A和CN 10100826A等都指出了蚕蛹多肽的制备工艺。同时，发明专利CN 102584430A公开了一种利用废弃茧丝蛋白制造氨基酸鱼塘肥水剂的方法。然而，蚕蛹本 身所具有的特殊气味以及易腐败的特质以及缫丝过程使得蚕蛹蛋白功能特性丧失，使得 大量的蚕蛹资源仍然被当做废弃物得不到合理的利用，并且造成了相应的环境问题。如果 将富含蛋白的蚕蛹资源加以水解，微生物的大规模，低成本培养就可以解决，所以将其用作 氮源培养微生物具有良好的前景。但是，蚕蛹渣侧链基团对肽的屏敝作用（蚕蛹蛋白的 水解工艺研究.粮油加工.2008(11) :116-119)以及蛋白质分子结构的复杂性（食品科 技.2004 (02) : 35-39)，蚕蛹蛋白的水解较为困难。目前，对于蚕蛹蛋白的水解方法主要有酶 法、酸法和碱法。复合酶法（CN 102604747A)和超声波-离子液体复合法（CN 103571903A) 都公开了酶法生成蚕蛹多肽的工艺，然而酶法催化由于其水解条件较为温和，耗时较长，不 能够满足工业上生产蛋白质水解液的要求。同时，酸法和碱法也会带来一些环境问题。为 了提高蛋白的水解程度，超声波辅助热水法、双酶法、酶-离子液体复合法和超声波-酶法 等都被用来促进蛋白质的水解。专利CN 1039844A公开了一种单纯利用酶法处理蚕蛹蛋白 制备氣基酸的方法，其水解度只有15%，为了提1?香蛹蛋白水解度及提1?水解液的品质，发 明专利CN 102584430A公开了一种利用酶-酸复合处理废弃蚕蛹蛋白制备氨基酸的方法。 但是该处理方法达到21 %的水解度就需要耗时5h，不利于工业生产蚕蛹蛋白的水解液。因 此，如果能寻找合适的处理条件，实现提高水解度的同时缩短处理时间，那将蚕蛹这一生物 质应用于产油微生物的工业化培养将具有广阔的市场前景。
[0004] 离子液体是一种环境友好型的低温熔融盐，在室温条件下完全由特定的离子构成 的化学物质，具有溶解能力强、熔点低、不挥发及灵活地可设计性等优点，被认为是一种新 型的生物质预处理介质，近几年已逐渐发展成为化学制备、工程技术及材料科学等众多领 域的研究溶剂。如 H Xie (Green Chemistry. 2005, 7 (8) :606-608)等利用 1-丁基-3-甲基 咪唑氯盐溶解角蛋白，发现该离子液体对角蛋白具有良好的溶解性；而杜一松（北京服装 学院，2010)也可验证了 1-甲基-3-(2-甲基烯丙基）咪唑对于蚕丝蛋白具有良好的溶解 性。目前已知的某些咪唑类离子液体对蛋白质、纤维素和甲壳素等具有很强的溶胀/溶解 能力，可以用来对蛋白质改性，潜在的提高酶的水解效果。发明专利CN 103571903A就指出 利用超声波-离子液体耦合制备蚕蛹源ACE抑制肽。这些研究结果都表明采用酶法、离子 液体甚至辅以超声波对预处理脱脂蚕蛹都有增强水解效果的可能性，同时，离子液体对蚕 蛹渣含有的蛋白质类组分具有一定的增溶作用。通过初步的水解实验，我们发现，使用超声 波强化离子液体-酶法预处理蚕蛹渣中蚕蛹蛋白，整个过程只需lh，水解度就可达到22 % 以上。同时利用该法获得水解液，将其用于产油微生物的培养还未见报道。
[0005] 因此，本发明旨在提供一种利用超声强化离子液体-酶法预处理蚕蛹渣，用于产 油微生物培养的方法。该方法操作简便，反应条件温和，耗时短，离子液体可回收，为推动蚕 蛹生物质资源的广泛应用具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0006] 解决的技术问题：本发明提供一种脱脂蚕蛹渣用于产油微生物培养的预处理方法 及其产物和应用，旨在建立以离子液体为反应介质，超声波场致强化预处理蚕蛹渣，以蛋白 酶为催化剂制备蛋白水解液，用于产油微生物培养，旨在提高蚕蛹资源的利用率，增加油脂 的产率。
[0007] 技术方案：脱脂蚕蛹渣用于产油微生物培养的预处理方法，由下述步骤组成：
[0008] (1)超声波-离子液体预处理蚕蛹渣：取粗脱脂蚕蛹与离子液体按蚕蛹渣占混合 体系5?30% (w/w)混合，超声波功率为120?200W，反应的温度为40?90°C，反应时间 为0. 5?5h ;用蒸馏水洗脱、离心，除去离子液体；
[0009] (2)利用预处理的蚕蛹渣酶法制备水解液：将预处理好的蚕蛹渣用蒸馏水配制成 底物浓度1. 〇%?5. 0% (w/v，g/mL)，加入蛋白酶浓度为蚕蛹渣质量的0. 5%?5%，调节 溶液PH值分别到所加蛋白酶的最适pH6. 5?8. 0,并且在反应过程中加酸或加碱维持调节， 参照所加蛋白酶的最适反应温度，在50?60°C之间搅拌水解10?90min，水解结束后，用 沸水浴IOmin对酶灭活，离心，取上清备用。
[0010] 上述离子液体的阳、阴离子类型组合中阳离子类型为[Bmim]、[Hmim]、[Emim]、
[C6mim]或[Omim] 〇
[0011] 上述离子液体的阳、阴离子类型组合中阴离子类型为[HSOJ、[PF6]、[BF 4]或
[C1]。
[0012] 上述使用的蛋白酶种类为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白 酶、复合蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶。所述酶活力均大于10000U/g。
[0013] 上述脱脂蚕蛹渣用于产油微生物培养的预处理方法制备得到的产物。
[0014] 所得产物在培养藻类（小球藻、寇氏隐甲藻、裂殖壶菌、双鞭甲藻和雨生红球藻）、 酵母（弯隐球酵母、斯达氏油脂酵母、解脂耶罗维亚酵母、胶粘红酵母和类酵母红冬孢）和 霉菌（卷枝毛霉、土霉菌、紫瘫麦角菌、高梁褶抱黑粉菌、深黄被孢霉）中的应用。
[0015] 本发明使用的蚕蛹渣中蛋白质含量通过凯氏定氮法测得（GB/T 5009. 5-1985)。
[0016] 本发明使用的蚕蛹蛋白水解度的测定采用茚三酮法。其实验步骤如下：吸取 0. 2mL水解液，加蒸馏水至2mL，加入ImL茚三酮溶液。在沸水中反应15min，等反应液温度 降到室温后加入5mL的40 %乙醇溶液，在570nm处测定吸光值，根据标准曲线计算蚕蛹蛋白 的水解度。
[0017] 本发明使用的菌体材料实际油脂产量参照文献（Enzyme Microb. Technol.，2007, 41，312-317)的方法测定。
[0018] 有益效果：在酶促水解蚕蛹渣的体系中选择合适的离子液体作为反应介质，附加 超声波场来强化水解效果，该方法反应条件温和，对环境友好，预处理使用的离子液体可回 收再利用，预处理提高了酶促反应的效率，极大的缩短了水解反应的时间。蚕蛹蛋白的水解 度可达到30%以上，将其用于产油微生物的培养，生物量与油脂产量都能达到组合培养基 条件下的水平。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1为本处理体系的流程图。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0021] 首先将获得的蚕蛹粉碎后与石油醚按照1:1 (v/v)混合，超声波功率为150W，温度 保持在50°C处理lh，每隔20min摇匀。多次萃取后过滤除去有机溶剂，收集蚕蛹渣。放入 鼓风干燥箱内，80°C烘干至恒重，获得实验用原料粗脱脂蚕蛹。
[0022] 实施例1蚕蛹渣预处理
[0023] 称取0. 5g制得的粗脱脂蚕蛹与9. 5g的[Bmim] Cl混合，超声波功率为150W，反应 的温度为65°C，反应Ih后用少量蒸馏水多次洗脱、离心，除去离子液体。然后加入20mL水 及调节pH值到6. 5,然后加入0. 005g的风味蛋白酶在50°C之间搅拌水解60min，并且在反 应过程中加碱调节，使pH保持在6. 5左右，水解结束后，用沸水浴IOmin对酶灭活，8000r/ min离心lOmin，取上清。测得水解度为28. 54%。
[0024] 实施例2蚕蛹渣预处理
[0025] 称取0. 5g制得的粗脱脂蚕蛹与2. 8g的[Emim] [PF6]混合，超声波功率为120W，反 应的温度为60°C，反应Ih后用少量蒸馏水多次洗脱、离心，除去离子液体。然后加入50mL 水及调节pH值到8. 0,并且在反应过程中加碱调节，使pH保持在8. O左右，然后加入0. 015g 的胰蛋白酶在55°C之间搅拌水解90min，水解结束后，用沸水浴IOmin对酶灭活，8000r/min 离心lOmin，取上清。测得水解度为26. 73%。
[0026] 实施例3蚕蛹渣预处理
[0027] 称取0. 5g制得的粗脱脂蚕蛹与2g的[Omim] [BF4]混合，超声波功率为150W，反应 的温度为60°C，反应Ih后用少量蒸馏水多次洗脱、离心，除去离子液体。然后加入20mL水 及调节PH值到7. 0,并且在反应过程中加酸或加碱调节，然后加入0. 005g的中性蛋白酶在 50°C之间搅拌水解40min，水解结束后，用沸水浴IOmin对酶灭活，8000r/min离心lOmin，取 上清。测得水解度为23.78%。
[0028] 实施例4蚕蛹渣预处理
[0029] 称取0. 5g制得的粗脱脂蚕蛹与9. 5g的[Hmim] Cl混合，超声波功率为200W，反应 的温度为65°C，反应Ih后用少量蒸馏水多次洗脱、离心，除去离子液体。然后加入30mL水 及调节pH值到7. 0,并且在反应过程中加酸或加碱调节，使pH保持在7. O左右，然后加入 0. 005g的中性蛋白酶在50°C之间搅拌水解60min，水解结束后，用沸水浴IOmin对酶灭活， 8000r/min离心lOmin，取上清。测得水解度为27. 89%。
[0030] 实施例5蚕蛹渣预处理
[0031] 称取0. 5g制得的粗脱脂蚕蛹与2. Og的[Hmim] Cl混合，超声波功率为120W，反应 的温度为65°C，反应Ih后用少量蒸馏水多次洗脱、离心，除去离子液体。然后加入20mL水 及调节PH值到7. 0,并且在反应过程中加酸或加碱调节，然后加入0. 005g的碱性蛋白酶在 50°C之间搅拌水解40min，水解结束后，用沸水浴IOmin对酶灭活，8000r/min离心lOmin，取 上清。测得水解度为23. 46%。
[0032] 实施例6蚕蛹渣预处理
[0033] 称取0. 5g制得的粗脱脂蚕蛹与0. 75g的[Omim] [BF4]混合，超声波功率为120W，反 应的温度为65°C，反应Ih后用少量蒸馏水多次洗脱、离心，除去离子液体。然后加入20mL水 及调节PH值到7. 0,并且在反应过程中加酸或加碱调节，然后加入0. 020g的碱性蛋白酶在 50°C之间搅拌水解40min，水解结束后，用沸水浴IOmin对酶灭活，8000r/min离心lOmin，取 上清。测得水解度为25. 83%。
[0034] 实施例7蚕蛹渣预处理
[0035] 称取0. 5g制得的粗脱脂蚕蛹与9. 5g的[Bmim] Cl混合，超声波功率为150W，反应 的温度为65°C，反应Ih后用少量蒸馏水多次洗脱、离心，除去离子液体。然后加入20mL水 及调节pH值到8. 0,然后加入0. 015g的胰蛋白酶在55°C之间搅拌水解60min，并且在反应 过程中加碱调节，使pH保持在8. O左右，水解结束后，用沸水浴IOmin对酶灭活，8000r/min 离心lOmin，取上清。测得水解度为34. 42%。
[0036] 实施例8蚕蛹渣预处理
[0037] 称取0. 5g制得的粗脱脂蚕蛹与I. 5g的[Bmim] [PF6]混合，超声波功率为120W，反 应的温度为60°C，反应Ih后用少量蒸馏水多次洗脱、离心，除去离子液体。然后加入30mL 水及调节pH值到8. 0,并且在反应过程中加碱调节，使pH保持在8. 0左右，然后加入0. 015g 的胰蛋白酶在55°C之间搅拌水解30min，水解结束后，用沸水浴IOmin对酶灭活，8000r/min 离心lOmin，取上清，测得水解度为22. 73%。
[0038] 实施例9蚕蛹渣预处理
[0039] 称取0. 5g制得的粗脱脂蚕蛹与0. 5g的[Omim] [BF4]混合，超声波功率为200W，反 应的温度为65°C，反应Ih后用少量蒸馏水多次洗脱、离心，除去离子液体。然后加入30mL水 及调节PH值到7. 0,并且在反应过程中加酸或加碱调节，然后加入0. 020g的碱性蛋白酶在 50°C之间搅拌水解40min，水解结束后，用沸水浴IOmin对酶灭活，8000r/min离心lOmin，取 上清。测得水解度为25.58%。
[0040] 实施例10产油微生物的培养
[0041] 1)菌种活化：将保藏的解脂耶罗维亚酵母（ATCC 20794)在28°C下活化12h ;
[0042] 2)用接种针刮一环经步骤1)活化的斜面菌种，将其接种于50mL无菌的种子液培 养基（YH)培养基）中，在25°C、150r/min下振荡培养12h，得到种子液；
[0043] 3)摇床培养：将实施例7中得到的蛋白水解液按20% (v/v)添加量作为微生物氮 源，添加到解脂耶罗维亚酵母的培养基中（YEro培养基，不添加蛋白胨），按?ο% (v/v)的 接种量，在25°C、180r/min下振荡下培养96h。
[0044] 4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法 (GB/T5009. 6-1985)提取微生物油脂。测得生物量为14. 62g/L，与对照相比提高54. 38%， 油脂产量为8. 87g/L，与对照相比提高76. 69 %。
[0045] 实施例11产油微生物的培养
[0046] 1)菌种活化：将保藏的解脂耶罗维亚酵母（ATCC 20794)在28°C下活化12h ;
[0047] 2)用接种针刮一环经步骤1)活化的斜面菌种，将其接种于50mL无菌的种子液培 养基（YH)培养基）中，在25°C、150r/min下振荡培养12h，得到种子液；
[0048] 3)摇床培养：将实施例3中得到的蛋白水解液按20% (v/v)添加量作为微生物氮 源，添加到解脂耶罗维亚酵母的培养基中（YEro培养基，不添加蛋白胨），按?ο% (v/v)的 接种量，在25°C、180r/min下振荡下培养96h。
[0049] 4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法 (GB/T 5009. 6-1985)提取微生物油脂。测得生物量为9. 94g/L，与对照相比提高4. 96 %，油 脂产量为5. 34g/L，与对照相比提高6. 37 %。
[0050] 实施例12产油微生物的培养
[0051] 1)菌种活化：将保藏的解脂耶罗维亚酵母（ATCC 20794)在28°C下活化12h ;
[0052] 2)用接种针刮一环经步骤1)活化的斜面菌种，将其接种于50mL无菌的种子液培 养基（YH)培养基）中，在25°C、150r/min下振荡培养12h，得到种子液；
[0053] 3)摇床培养：将实施例2中得到的蛋白水解液按20% (v/v)添加量作为微生物氮 源，添加到解脂耶罗维亚酵母的培养基中（YEH)培养基，不添加蛋白胨），按10% (v/v)的 接种量，在25°C、180r/min下振荡下培养96h。
[0054] 4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法 (GB/T5009. 6-1985)提取微生物油脂。测得生物量为10. 73g/L，与对照相比提高13. 31%， 油脂产量为6. 07g/L，与对照相比提高20. 92 %。
[0055] 实施例13产油微生物的培养
[0056] 1)菌种活化：将保藏的裂殖壶菌（ATCCMYA-1381)在25°C下活化24h ;
[0057] 2)用接种针刮一环经步骤1)活化的斜面菌种，将其接种于50mL无菌的种子液培 养基（790+培养基）中，在25°C、150r/min下振荡培养24h，得到种子液；
[0058] 3)摇床培养：将实施例7中得到的蛋白水解液按20% (v/v)添加量作为微生物氮 源，添加到裂殖壶菌的培养基中（790+培养基，不添加蛋白胨），按10% (v/v)的接种量，在 22°C、180r/min下振荡下培养144h。
[0059] 4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法 (GB/T5009. 6-1985)提取微生物油脂。测得生物量为6. 12g/L，与对照相比提高149. 80%， 油脂产量为3. 01g/L，与对照相比提高146. 72%。
[0060] 实施例14产油微生物的培养
[0061] 1)菌种活化：将保藏的裂殖壶菌（ATCCMYA-1381)在25°C下活化24h ;
[0062] 2)用接种针刮一环经步骤1)活化的斜面菌种，将其接种于50mL无菌的种子液培 养基（790+培养基）中，在25°C、150r/min下振荡培养24h，得到种子液；
[0063] 3)摇床培养：将实施例3中得到的蛋白水解液按20% (v/v)添加量作为微生物氮 源，添加到裂殖壶菌的培养基中（790+培养基，不添加蛋白胨），按10% (v/v)的接种量，在 22°C、180r/min下振荡下培养144h。
[0064] 4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法 (GB/T 5009.6-1985)提取微生物油脂。测得生物量为4. 19g/L，与对照相比提高71. 02%， 油脂产量为2. 37g/L，与对照相比提高94. 26 %。
[0065] 实施例15产油微生物的培养
[0066] 1)菌种活化：将保藏的裂殖壶菌（ATCCMYA-1381)在25°C下活化24h ;
[0067] 2)用接种针刮一环经步骤1)活化的斜面菌种，将其接种于50mL无菌的种子液培 养基（790+培养基）中，在25°C、150r/min下振荡培养24h，得到种子液；
[0068] 3)摇床培养：将实施例2中得到的蛋白水解液按20% (v/v)添加量作为微生物氮 源，添加到裂殖壶菌的培养基中（790+培养基，不添加蛋白胨），按10% (v/v)的接种量，在 22°C、180r/min下振荡下培养144h ;
[0069] 4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法 (GB/T5009. 6-1985)提取微生物油脂。测得生物量为2. 65g/L，与对照相比提高8. 16%，油 脂产量为I. 38g/L，与对照相比提高13. 14%。
[0070] 实施例16产油微生物的培养
[0071] 1)菌种活化：将保藏的卷枝毛霉（ATCC 90680)接到PDA斜面培养基上在30°C培 养 72 ?120h。
[0072] 2)活化菌种以少量无菌水洗入装有50mL种子液培养基（PDA培养基）的250mL三 角瓶中，30°C、160r/min 培养 48 ?72h。
[0073] 3)摇床培养：将实施例3中得到的蛋白水解液按20% (v/v)添加量作为微生物氮 源，添加到卷枝毛霉的培养基（PYG培养基）中，30°C、160r/min条件下培养144h。
[0074] 4)发酵后处理：发酵结束后，用的确良布过滤收集，适量蒸馏水洗涤3次，60°C 下真空干燥。研磨后用索氏提取法（GB/T 5009.6-1985)提取微生物油脂。测得生物量为 I. 67g/L，与对照相比提高81. 52%，油脂产量为0. 37g/L，与对照相比提高94. 74%。
[0075] 实施例17产油微生物的培养
[0076] 1)菌种活化：将保藏的卷枝毛霉（ATCC 90680)接到PDA斜面培养基上在30°C培 养 72 ?120h。
[0077] 2)活化菌种以少量无菌水洗入装有50mL种子液培养基（PDA培养基）的250mL三 角瓶中，30°C、160r/min 培养 48 ?72h。
[0078] 3)摇床培养：将实施例2中得到的蛋白水解液按20% (v/v)添加量作为微生物氮 源，添加到卷枝毛霉的培养基（PYG培养基）中，30°C、160r/min条件下培养144h。
[0079] 4)发酵后处理：发酵结束后，用的确良布过滤收集，适量蒸馏水洗涤3次，60°C下 真空干燥。研磨后用索氏提取法（GB/T 5009.6-1985)提取微生物油脂。测得生物量为 I. 26g/L，与对照相比提高36. 96 %，油脂产量为0. 35g/L，与对照相比提高84. 21 %。
[0080] 实施例18产油微生物的培养
[0081] 1)菌种活化：将保藏的卷枝毛霉（ATCC 90680)接到PDA斜面培养基上在30°C培 养 72 ?120h。
[0082] 2)活化菌种以少量无菌水洗入装有50mL种子液培养基（PDA培养基）的250mL三 角瓶中，30°C、160r/min 培养 48 ?72h。
[0083] 3)摇床培养：将实施例7中得到的蛋白水解液按20% (v/v)添加量作为微生物氮 源，添加到卷枝毛霉的培养基（PYG培养基）中，30°C、160r/min条件下培养144h。
[0084] 4)发酵后处理：发酵结束后，用的确良布过滤收集，适量蒸馏水洗涤3次，60°C下 真空干燥。研磨后用索氏提取法（GB/T 5009.6-1985)提取微生物油脂。测得生物量为 I. 02g/L，与对照相比提高10. 87%，油脂产量为0. 21g/L，与对照相比提高10. 53%。
[0085] 实施例19其他微生物的培养
[0086] 1)菌种活化：将实验室保藏的一株黏红酵母（CICMY0148)在YEH)斜面培养基中 28°C下活化48h。
[0087] 2)用接种环挑取一环活化菌种接入装有50mL种子液培养基（YEH)培养基）的 250mL三角瓶中，30°C、160r/min培养48h，得种子液。
[0088] 3)摇床培养：将实施例7中得到的蛋白水解液按20% (v/v)添加量作为微生物氮 源，添加到黏红酵母的培养基中（YEH)培养基），按10% (v/v)的接种量，在30°C、200r/min 下振荡下培养144h。
[0089] 4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、准确称取菌体0. Ig 和石英砂0. 05g,充分研磨，加入6mL丙酮：石油醚=I :1 (v/v)的混合液,28°C振荡浸提 30min，然后8000r/min离心15min，上清液即为胡萝卜素浸提液。
[0090] 类胡萝卜素含量（μ g/g 干基）=(AXmaxXDXVV(0· 16XW)
[0091] 式中：A λ max为类胡萝卜素浸提液最大波长处的吸光度；D为色素浸提液稀释倍 数；V为浸提所用丙酮和石油醚的总体积（mL) ;W为提取所用的发酵培养物重量（g) ;0. 16 为胡萝卜素的摩尔消光系数。实验测得生物量为7. 46g/L，与对照相比提高24. 96%，类胡 萝卜素产量为9. 2lmg/L，与对照相比提高24. 46%。
[0092] 实施例20其他微生物的培养
[0093] 1)菌种活化：将实验室保藏的一株黏红酵母（CICMY0148)在YEH)斜面培养基中 28 °C下活化48h。
[0094] 2)用接种环挑取一环活化菌种接入装有50mL种子液培养基（YEH)培养基）的 250mL三角瓶中，30°C、160r/min培养48h，得种子液。
[0095] 3)摇床培养：将实施例2中得到的蛋白水解液按20% (v/v)添加量作为微生物氮 源，添加到黏红酵母的培养基中（YEH)培养基），按10% (v/v)的接种量，在30°C、200r/min 下振荡下培养144h。
[0096] 4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、准确称取菌体0. Ig 和石英砂0. 05g,充分研磨，加入6mL丙酮：石油醚=I :1 (v/v)的混合液,28°C振荡浸提 30min，然后8000r/min离心15min，上清液即为胡萝卜素浸提液。
[0097] 类胡萝卜素含量（μ g/g 干基）=(AXmaxXDXVV(0· 16XW)
[0098] 式中：A λ max为类胡萝卜素浸提液最大波长处的吸光度；D为色素浸提液稀释倍 数；V为浸提所用丙酮和石油醚的总体积（mL) ;W为提取所用的发酵培养物重量（g) ;0. 16 为胡萝卜素的摩尔消光系数。实验测得生物量为7. 16g/L，与对照相比提高19. 93%，类胡 萝卜素产量为9. 26mg/L，与对照相比提高25. 14%。
[0099] 实施例21其他微生物的培养
[0100] 1)菌种活化：将实验室保藏的一株黏红酵母（CICMY0148)在YEH)斜面培养基中 28°C下活化48h。
[0101] 2)用接种环挑取一环活化菌种接入装有50mL种子液培养基（YEH)培养基）的 250mL三角瓶中，30°C、160r/min培养48h，得种子液。
[0102] 3)摇床培养：将实施例3中得到的蛋白水解液按20% (v/v)添加量作为微生物氮 源，添加到黏红酵母的培养基中（YEH)培养基），按10% (v/v)的接种量，在30°C、200r/min 下振荡下培养144h。
[0103] 4)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、准确称取菌体0. Ig 和石英砂0. 05g,充分研磨，加入6mL丙酮：石油醚=I :1 (v/v)的混合液,28°C振荡浸提 30min，然后8000r/min离心15min，上清液即为胡萝卜素浸提液。
[0104] 类胡萝卜素含量（μ g/g 干基）=(AXmaxXDXV)八0· 16XW)
[0105] 式中：A λ max为类胡萝卜素浸提液最大波长处的吸光度；D为色素浸提液稀释倍 数；V为浸提所用丙酮和石油醚的总体积（mL) ;W为提取所用的发酵培养物重量（g) ;0. 16 为胡萝卜素的摩尔消光系数。实验测得生物量为6. 22g/L，与对照相比提高4. 18%，类胡萝 卜素产量为8. 67mg/L，与对照相比提高17. 16%。
[0106] 对照实验
[0107] 表1不同菌种常规培养基下的生长情况
[0108]
【权利要求】
1. 脱脂蚕蛹渣用于产油微生物培养的预处理方法，其特征在于由下述步骤组成： (1) 超声波-离子液体预处理蚕蛹渣：取粗脱脂蚕蛹与离子液体按蚕蛹渣占混合体系 5?30% (w/w)混合，超声波功率为120?200W，反应的温度为40?90°C，反应时间为 〇. 5?5h ;用蒸馏水洗脱、离心，除去离子液体； (2) 利用预处理的蚕蛹渣酶法制备水解液：将预处理好的蚕蛹渣用蒸馏水配制成底物 浓度1.0%?5.0% (w/v，g/mL)，加入蛋白酶浓度为蚕蛹渣质量的0.5%?5%，调节溶液 pH值分别到所加蛋白酶的最适pH6. 5?8.0,并且在反应过程中加酸或加碱维持调节，参照 所加蛋白酶的最适反应温度，在50?60°C之间搅拌水解10?90min，水解结束后，用沸水 浴lOmin对酶灭活，离心，取上清备用。
2. 根据权利要求1所述脱脂蚕蛹渣用于产油微生物培养的预处理方法，其特征在于 所述离子液体的阳、阴离子类型组合中阳离子类型为[Bmim]、[Hmim]、[Emim]、[C 6mim]或 [Omim] 〇
3. 根据权利要求1或2所述脱脂蚕蛹渣用于产油微生物培养的预处理方法，其特征在 于所述离子液体的阳、阴离子类型组合中阴离子类型为[HSOJ、[PF 6]、[BFJ或[C1]。
4. 根据权利要求1所述脱脂蚕蛹渣用于产油微生物培养的预处理方法，其特征在于所 述使用的蛋白酶种类为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白 酶或枯草杆菌蛋白酶。
5. 根据权利要求4所述脱脂蚕蛹渣用于产油微生物培养的预处理方法，其特征在于所 述酶活力均大于10000U/g。
6. 权利要求1?5任一所述脱脂蚕蛹渣用于产油微生物培养的预处理方法制备得到的 产物。
7. 权利要求6所述产物在培养藻类、产油酵母和霉菌中的应用。
【文档编号】C12N1/14GK104277975SQ201410510411
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月28日 优先权日:2014年9月28日
【发明者】王俊, 史馨怡, 李泰莹, 吴福安, 张健 申请人:江苏科技大学