专利名称：注射的凝胶型骨修复生物活性材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种注射的凝胶型骨修复生物活性材料及其制备方法，属于医学生物技术领域。
背景技术：
(1)可注射凝胶给药系统将药物与可降解材料复合，然后经注射送达体内特定部位，使之固化形成凝胶并释放出药物和发挥治疗作用是一种较好的给药系统。这种给药体系使用方便，可以延长药物在体内的作用时间，减少药物使用剂量以避免可能存在的副作用，而且不通过手术就将药物植入体内，减少了病人的痛苦。
(2)骨修复生物活性材料骨形态发生蛋白是一类细胞生长因子，它们能诱导未分化的间质干细胞分化为成骨细胞并增殖，形成软骨和新生骨，所以具有很强的骨诱导活性。虽然骨形态发生蛋白对骨缺损有明显的修复作用，但为了使其在病灶部位持久发挥作用，通常将它与多种不同性质的载体复合而制成各种类型的骨修复材料。这些骨修复材料可用于骨折、骨不连、骨缺损的修复，也可用于整形外科和牙科。现有的骨修复材料需要通过手术植入到创伤部位，不仅操作复杂，使用费用高，病人受到很大痛苦，而且不适合临床上出现最多的闭合性骨折和其他不需手术的骨科病例使用，发明内容本发明的目的是提供一种注射的凝胶型骨修复生物活性材料。
本发明的另一个目的是提供注射的凝胶型骨修复生物活性材料的制备方法。
本发明的注射的凝胶型骨修复生物活性材料，其特征是每个使用剂量由1毫升A组分和45～55mg B组分组成，其中，A组分的成分及其含量为每毫升蒸馏水中含有海藻酸钠 10～40mg骨形态发生蛋白 0.1～1mg甘露醇 10～20mg
B组分的成分及其含量为每mg中含有水难溶性钙化合物 0.05～0.15mg葡萄糖酸内酯 0.05～0.3mg聚乙烯吡咯烷酮 0.004～0.016mg甘露醇 余量上述的A组分可以是经过冷冻干燥的冻干品，B组分是过60目筛的颗粒。
注射的凝胶型骨修复生物活性材料的制备方法，包括以下步骤1)将1～4g的海藻酸钠溶于100ml水中，然后在每毫升海藻酸钠水溶液中加入0.1～1mg骨形态发生蛋白，再加入甘露醇10～20mg，冻干，此为A组分。
2)将500～1500mg水难溶性钙化合物和500～3000mg葡萄糖酸内酯混合，再加入稀释剂甘露醇至总重量为10g，混合均匀；3)在步骤(2)所得混合物中加入1～2ml的浓度为4～8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，润湿，混合，调制成软膏，挤压过20目筛成颗粒状，80℃烘干，过60目筛整粒，此为B组分；4)A、B两个组分分别用钴60(60Co)照射进行灭菌，照射剂量是6Kgy；5)将A组分和B组分分装成产品。
本发明中，所说的海藻酸钠为大连雅威特生物公司产品；骨形态发生蛋白是从动物骨中提取的天然骨形态发生蛋白或是用基因工程方法生产的重组骨形态蛋白，例如可采用杭州华东医药集团基因技术所生产的重组人骨形态发生蛋白无菌冻干粉末，葡萄糖酸内酯来自SIGMA，聚乙烯吡咯烷酮来上海伯奥生物技术公司，羟基磷灰石来自默克公司，碳酸钙、硫酸钙、甘露醇均为分析纯。
本发明的骨修复生物活性材料在治疗修复骨缺损中的应用。
使用时，将冻干的A组分用1ml无菌生理盐水溶解，吸入注射器中待用，根据治疗需要取B组分，并按1mg用1ul无菌生理盐水润湿，然后将注射器中A组分加入B组分中，均匀混合成混悬液，经注射器注入病灶部位。经过一定时间后在病灶部位形成凝胶。此后，凝胶中的骨形态发生蛋白缓慢释出并发挥诱导新骨生成的作用。其原理是组分A中的载体海藻酸钠是钙离子介导的凝胶剂，组分B中葡萄糖酸内酯在缓慢水解过程中产生的葡萄糖酸能控制水难溶性钙化合物中钙离子的释放。被释放的钙离子则与海藻酸钠反应而使它形成凝胶，将骨形态发生蛋白保留在一定部位。
本发明将骨形态发生蛋白和载体以液体形式通过注射器注入病灶部位，经一定时间后在体内形成凝胶，将骨形态发生蛋白固着在需要修复的骨损伤部位并发挥诱导骨生成的作用，这个骨修复材料生物相容性好，不仅使用简单，可避免手术造成的新的创伤，减轻病人的痛苦，而且可以根据治疗需要调整用量，多次注射。本发明中的载体无毒害作用，植入体内无不良反应。经动物实验证明本发明的成骨活性和含骨形态发生蛋白的固态骨修复材料相当，治疗效果确切。
具体实施例方式
以下结合实施例从几个方面对本发明作进一步的详细描述。
实施例11)将1.5g海藻酸钠溶于100ml水中，配置成浓度为1.5％的水溶液，在100ml该溶液中加入10mg骨形态发生蛋白，加入2g甘露醇，混匀，冻干，此为A组；2)取367mg碳酸钙和436mg葡萄糖酸内酯，加入4197mg甘露醇，混合均匀；3)在2)所得混合物中加入800ul浓度为8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，润湿后混合均匀，调制成软膏，挤压过20目筛成颗粒状，80℃烘干，过60目筛整粒。此为B组分；4)用60Co照射A组分和B组分，进行灭菌，照射剂量为6KGy；5)将A组分和B组分分装成产品。
实施例21)将1.5g海藻酸钠溶于100ml水中，配置成浓度为1.5％的水溶液，在100ml该溶液中加入50mg骨形态发生蛋白，加入甘露醇2g，混匀，冻干，此为A组分；2)440mg硫酸钙，436mg葡萄糖酸内酯，加入4124mg甘露醇，混合均匀。
3)在2)所得混合物中加入800ul 8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，润湿后混合均匀，调制成软膏，挤压过20目筛成颗粒状，80℃烘干，过60目筛整粒。此为B组分。
4)用60Co照射A组分和B组分，进行灭菌，照射剂量为6KGy。
5)将A组分和B组分分装成产品。
实施例31)将1.5g海藻酸钠溶于100ml水中，配置成浓度为1.5％的水溶液，在100ml该溶液中加入100mg骨形态发生蛋白，加入甘露醇1.5g，混匀，冻干，此为A组分；2)220.2mg碳酸钙，261.6mg葡萄糖酸内酯，加入2518.2mg甘露醇，混合均匀；3)在2)所得混合物中加入480ul 8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，润湿后混合均匀，调制成软膏，挤压过20目筛成颗粒状，80℃烘干，过60目筛整粒。此为B组分；4)用60Co照射A组分和B组分，进行灭菌，照射剂量为6KGy；5)将A组分和B组分分装成产品。
实施例41)将4g海藻酸钠溶于100ml水中，配置成浓度为4％的水溶液，在100ml该溶液中100mg骨形态发生蛋白，加入甘露醇2g，混匀，冻干，此为A组分；2)368.4mg羟基磷灰石，1307.3mg葡萄糖酸内酯，加入3324.3mg甘露醇，混合均匀；3)在2)所得混合物中加入800ul 8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，润湿后混合均匀，调制成软膏，挤压过20目筛成颗粒状，80℃烘干，过60目筛整粒。此为B组分；4)用60Co照射A组分和B组分，进行灭菌，照射剂量为6KGy；5)将A组分和B组分分装成产品。
实施例5细胞毒性实验将实施例1和实施例4制得的A、B两种组分，按照使用剂量1毫升A组分和50mg B组分的配比，混合成3ml混悬液，铺到T-25细胞培养瓶中，在37℃，5％CO2培养箱中放置半小时。在凝固后，向瓶中轻轻加入10ml 1640培养液。继续置于培养箱中，浸提24小时。然后，取出培养液，2000g离心，直径为0.22um的滤膜过滤，所得滤液就是浸提液。浸提液用1640培养基稀释一倍后按GB/T16886.5.2003中规定的体外细胞毒性试验方法进行。其结果应符合该标准中4.6.5要求。
评价标准(采用L929细胞测试)
结果
细胞毒性实验结果均为合格。说明此骨修复材料生物相容性好，无毒、安全。
实施例6异位成骨活性实验试剂与材料1.5％戊巴比妥钠，75％酒精，0/5#缝合线，15#手术刀片，止血钳，缝合针，1ml注射器；18-22g ICR小鼠，同一性别。
操作1.对照组骨形态发生蛋白与明胶、卵磷脂复合材料——用1.5％戊巴比妥钠麻醉小鼠，将左后肢剃毛和酒精消毒后，在肌肉陷窝表皮处割开一个长度为0.5cm的切口，用止血钳分离皮肤，钝性分离肌肉，暴露肌肉陷窝，植入含0.1mg重组人骨形态发生蛋何(rhBMP-2)的复合材料，缝合。
2.实验组本发明的注射的凝胶型骨修复材料——用1.5％戊巴比妥钠麻醉小鼠，在其左后肢剃毛和酒精消毒后，将1毫升A组分和50mg B组分混合好的注射混悬剂注射到后肢肌肉陷窝内，每个小鼠注射含1mg/ml rhBMP-2的凝胶型骨修复材料0.1ml。
3.21天后，解剖，取鲜骨，称重。
成骨活性定义为每毫克rhBMP-2诱导产生的新骨重量，若1mg rhBMP-2诱导产生的新骨重量为1000mg时，其成骨活性就是1000U。
实验结果如下表新骨重量以mg计
实验结果表明本发明注射的凝胶型骨修复材料具有较好的诱骨活性。
权利要求
1.注射的凝胶型骨修复生物活性材料，其特征是，每个使用剂量由1毫升A组分和45～55mg B组分组成，其中，A组分的成分及其含量为每毫升无菌生理盐水中含有海藻酸钠10～40mg骨形态发生蛋白 0.1～1mg甘露醇 10～20mgB组分的成分及其含量为每mg中含有水难溶性钙化合物0.05～0.15mg葡萄糖酸内酯0.05～0.3mg聚乙烯吡咯烷酮 0.004～0.016mg甘露醇 余量
2.根据权利要求1所述的注射的凝胶型骨修复生物活性材料，其特征是所说的水难溶性钙化合物为碳酸钙、硫酸钙或羟基磷灰石。
3.根据权利要求1所述的注射的凝胶型骨修复生物活性材料，其特征是所说的骨形态发生蛋白是从动物骨中提取的天然骨形态发生蛋白或是用基因工程方法生产的重组骨形态蛋白。
4.根据权利要求1所述的注射的凝胶型骨修复生物活性材料，其特征是所说的A组分为冻干品。
5.根据权利要求1所述的注射的凝胶型骨修复生物活性材料，其特征是所说的B组分是过60目筛的颗粒。
6.根据权利要求1所述的注射的凝胶型骨修复生物材料的制备方式，其特征是包括以下步骤1)将1～4g的海藻酸钠溶于100ml水中，然后在每毫升海藻酸钠水溶液中加入0.1～1mg骨形态发生蛋白，再加入甘露醇10～20mg，冻干，此为A组分；2)将500～1500mg水难溶性钙化合物和500～3000mg葡萄糖酸内酯混合，再加入稀释剂甘露醇至总重量为10g，混合均匀；3)在步骤2)所得混合物中加入1～2ml的浓度为4～8％的聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液，润湿，混合，调制成软膏，挤压过20目筛成颗粒状，80℃烘干，过60目筛整粒，此为B组分；4)A、B两个组分分别用钴60照射进行灭菌，照射剂量是6Kgy；5)将A组分和B组分分装成产品。
全文摘要
本发明公开了一种注射的凝胶型骨修复生物活性材料及其制备方法，该材料每个使用剂量由1毫升A组分和45～55mg B组分组成，其中，A组分的组成为每毫升无菌生理盐水中含有海藻酸钠10～40mg，骨形态发生蛋白0.1～1mg，甘露醇10～20mg，B组分的组成为每mg中含有水难溶性钙化合物0.05～0.15mg，葡萄糖酸内酯0.05～0.3mg，聚乙烯吡咯烷酮0.004～0.016mg，余量为甘露醇。此注射型骨修复材料生物相容性好，使用简便安全，无须手术就可以植入骨科患者需要治疗的部位。动物实验证明其成骨活性与需要通过手术植入的含骨形态发生蛋白的固态骨修复材料相当。
文档编号A61L27/44GK1586621SQ20041005324
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者徐放, 潘绵立 申请人:徐放