专利名称：用于肿瘤显像和治疗的联合物及其制备方法
技术领域：
本发明属于一种用于肿瘤显像和治疗的联合物，具体地说是一种采用聚酰胺-胺型树状聚合物(PAMAM)为核心，连接一种以上能与神经内分泌肿瘤受体或亚类选择性结合，用于肿瘤显像和治疗的PAMAM-多肽-核素联合物及其制备方法。
背景技术：
众所周知，肿瘤特别是恶性肿瘤已成为人类最大杀手之一，由于尚无特效的医治方法，致使人们谈“癌”色变。所以人们都在探索肿瘤早发现和早治疗的有效方。
一种方法是采用肿瘤靶向治疗。在肿瘤靶向治疗中。靶向肿瘤制剂有抗体，抗体片段，抗原，生物反应调节剂。目前，以这些肿瘤制剂作为靶向的治疗效果并不令人十分满意。如单克隆抗体的分子量较大，其进入肿瘤组织的量一直受限，一般每克人肿瘤组织的进入量只有0.001％～01％的注射量，这是因为1)血循环中的单抗在和肿瘤组织结合前需通过内皮细胞层和纤维性的间质；2)肿瘤细胞紧密分布及与内皮细胞的紧密连接影响抗体在肿瘤中的迁移；3)肿瘤组织中缺乏淋巴管，间质中压力高，阻止单抗向肿瘤中心部位流入；4)进入肿瘤的单抗和周围血管区域的细胞首先结合，防碍血管中的单抗进步深入肿瘤。
利用肿瘤表面受体为靶点进行治疗是靶向治疗的另一种方法。在神经内分泌肿瘤中存在肿瘤相关受体，如生长抑素(somatostatin)受体，血管活性肠多肽(VIP)受体、胆囊收缩素(CCK)受体和蛙皮素受体(bombesin receptor)。生长抑素受体在小肠、胰腺和肺部的存在，成为肿瘤诊断和治疗的靶点。各种生长抑素的类似物经放射性核素标记已被用于靶向治疗。由于生长抑素有五种亚类，结果表明其成功程度非常依赖于肿瘤细胞表面亚类受体的数目及与标记物之间的亲和力。同样，VIP受体有VPAC1和VPAC2二种亚类，CCK受体有CK1和CCK2二种亚类，蛙皮素受体有BB1～BB3三种亚类。不同种类的神经内分泌肿瘤细胞有不同程度亚类受体的表达，其结果直接影响了神经内分泌肿瘤显像和靶向治疗效果。
利用核素的β射线是肿瘤治疗的一种方法。不同核素的β射线，射程不一致，适合不同大小的肿瘤治疗。有报道，在胃泌素瘤的病人中，联合运用177Lu标记的生长抑素类似物和188Re或90Y标记的蛙皮素BB2类似物能有效地治疗大小不等的多处胃泌素瘤转移灶。
此外，在以PAMAM为核心的肿瘤核素靶向治疗中，2003年美国俄亥俄州大学的Shukla S等人报道了PAMAM连接叶酸和10硼进行荷人肉瘤小鼠靶向中子俘获治疗工作。叶酸受体在肿瘤细胞表面存在，但叶酸不属于多肽，在肿瘤细胞表面无“多种受体共同表达的特点”。美国DOW化学公司于1987年公开了将PAMAM同时与放射性核素铼及靶向肿瘤制剂相连接，获得复合体用于放射成像及肿瘤治疗的方法(欧洲专利EP271180)。此项专利未提及利用肿瘤细胞存在多种受体共同表达这一特点和利用这一特点进行神经内分泌肿瘤的治疗，所以效果不尽人意。
综上所述，要实现肿瘤早发现，早治疗，并大大提高诊治效果，就必须针对人体不同种类的神经内分泌肿细胞有多种受体共同表达及不同程度亚类受体表达的特点，筛选多肽对内分泌肿瘤细胞选择的最佳组合，并针对不同核素的β射线射程不一致的特点，可采用二种以上核素组合，这样就能克服现有技术不能有效表达之不足，大大提高了对肿瘤的发现和治疗效果。
发明内容
本发明目的是根据肿瘤特别是神经内分泌肿瘤细胞有多种受体共同表达的特点，选用聚酰胺-胺型树状聚合物(PAMAM)为核心，连接一种以上能与肿瘤细胞受体选择性结合的多肽-核素联合物，制成靶向肿瘤制剂，特别是用于神经内分泌肿瘤显像和治疗，可以大大提高对肿瘤的诊治效果。
本发明是通过下列方案来实施的第一步选用树状大分子PAMAM为核心材料。PAMAM是一种中心向外对称发散而高度分枝的新型纳米大分子化合物，可通过化学合成得到1～10代的PAMAM。其尺寸为2～13nm，可通过控制其生长代数得到不同大小的PAMAM；表面活性基团数也与生长代数有关，可表示为2G+2，其中G表示代数。以第五代为例，每个分子表面带有128个氨基。对其表面活性基团的修饰可得到不同的化学功能性，如氨基，羧基，羟基等。易于进入肿瘤细胞内。此外PAMAM还具有对人体细胞毒性相对较小的特点。因此它是肿瘤靶向联合物很好的基础材料。一般情况下最常用为4～6代。
第二步对PAMAM表面进行活化处理。PAMAM表面基团很多，经恰当处理后可和大量的配体结合。如PAMAM可以用双功能交联剂戊二醛活化，由于其表面基团很多，可以同时连接多个配体，包括多肽、氨基酸或螯合剂，使其具有多功能性。
第三步参考文献报导，选择一个以上能与神经内分泌肿瘤受体或其亚类选择性结合的多肽，它包括生长抑素和血管活性肠多肽。
第四步选择具有β射线的核素或β射线射程有互补作用的一个以上放射性核素，最常用的方法是将通过螯合剂与核素连接，制成螯合物或核素和组氨酸连接。然后再和PAMAM连接。
第五步按一定的摩尔比，将经活化处理的PAMAM，核素标记的组氨酸或螯合物，及能与神经内分泌肿瘤受体或亚类选择性结合的多肽(包括生长抑素和血管活性肠多肽)进行缩聚反应，使其成为肿瘤显像和治疗的联合物。
第六步为优化“联合物”在体内分布和降低其可能对细胞存在的毒性，采用聚乙二醇等对“联合物”表面进行修饰。最后生成PAMAM-多肽-核素其表面用乙二醇等修饰的联合物，它的通式可以表示为{(R)*(P)n*(M)x}-W。
具体实施例方式
用于靶向肿瘤诊断和治疗联合物的通式可表示为联合物{(R)*(P)n*(M)x}-W式中R为放射性核素，可为99mTc，188Re，90Y，177Lu，166Ho，153Sm111In，186Re等金属核素及131I中的一种或二种以上的组合；常用的组合物有177Lu与188Re或90Y组合，99mTc与90Y组合等。
P为聚酰胺-胺型树状聚合物，表面带氨基(PAMAM)的分子结构示意图 n为1～10)；
(P)n代表第1～10代的聚酰胺-胺型树状聚合物，最佳选用4～6代，也可为其它代数；(R)*(P)n表示第1～10代的PAMAM和放射性核素连接；M为能与神经内分泌肿瘤受体选择性结合的多肽1)针对生长抑素受体的可为[亮氨酸，D-色氨酸，酪氨酸]-生长抑素，2)针对血管活性肠多肽(VIP)受体的为血管活性肠多肽，3)针对胆囊收缩素(CCK)受体的为胆囊收缩素，4)针对蛙皮素受体(bombesin)的蛙皮素5)针对胃泌激素释放多肽(GRP)受体的胃泌激素释放多肽6)胰高血糖素样多肽(GLP)受体的胰高血糖素样多肽7)神经多肽Y(NPY)受体的神经多肽Y8)针对肿瘤新生血管整合素的多肽(RGD)x大于或等于2；(P)n*(M)x，表示第1～10代PAMAM中的某一代PAMAM上同时连接2个以上能与神经内分泌肿瘤受体选择性结合的多肽MW为聚乙二醇、明胶或壳聚糖等多聚物本发明制备方法为以功能基团为氨基的PAMAM(P)，经戊二醛(a)活化后为b，b上的部分醛基与多肽(M)缩合反应结合形成c；b上另外部分醛基与氨基酸(d)或鳌合剂(e)连接，提供放射性核素标记基团，经放射性核素R标记后形成f。带有核素及多肽的PAMAM由W修饰，形成最后的联合物。合成步骤示意如下
2) b+d/e→ f3c/f+w→联合物({(R)*(P)n*(M)x}-W)4)d为组氨酸或色氨酸；f为螯合剂，包括DPTA，DOTA，HYNIC等本发明的实施举例多肽组合
(2)核素组合177Lu与188Re或90Y组合；99mTc与90Y组合(3)99mTc-PAMAM-生长抑素(Octreotide)-血管活性肠多肽(VIP)的合成1)99mTc与组氨酸连接a)水合羰基锝制备16mg Na2CO3，12mg酒石酸钠，22mg NaBH4加到干净的10ml西林瓶。
瓶内通CO气体(1.2L/min)10min然后塞紧瓶塞。用注射器加入1ml99mTcO4-淋洗液，置于75～100℃水浴加热20～40分钟。冷却至室温后，插入针管放出西林瓶内剩余气体，加入200～300μl HCl溶液(2mol/L)，将多余的NaBH4清除，再用磷酸盐缓冲液(PBS)调节PH至7.4。该方法也可以用于制备其它水合羰基核素。
b)99mTc组氨酸标记物制备羰基锝中加入1-2mg组氨酸，75℃～95℃水浴加热5～10分钟。
2)PAMAM和组氨酸、生长抑素、血管活性肠多肽连接a)PAMAM(第五代)由戊二醛活化修饰取25％的戊二醛溶液8～10μl，加入PAMAM 40μl，用PBS缓冲液稀释至1ml(戊二醛溶液浓度为0.2％)。充分混匀，室温下反应1～2小时。
b)PAMAM与组氨酸、生长抑素、血管活性肠多肽结合取200μl经戊二醛活化修饰的PAMAM溶液，分别加入99mTc组氨酸标记物、生长抑素、血管活性肠多肽各100μl，若用分子摩尔比表示，那么PAMAM、组氨酸、生长抑素、血管活性肠多肽的分子摩尔数比为1∶3～5∶5～10∶5～10。反应在磷酸盐溶液(PBS)中进行。pH值调节在6左右。在室温下充分混匀，反应1～2小时，然后中和洗涤而得成品。
3)带有核素标记的组氨酸、生长抑素、血管活性肠多肽的PAMAM联合物由PEG修饰将200μl带有核素的组氨酸、生长抑素、血管活性肠多肽的PAMAM联合物和100μl的2μmol胺基化的PEG于500μl，0.2M，Na2HPO4，pH9中，按PAMAM联合物∶PEG为1～5∶1的摩尔数比加入，充分混匀，室温下反应1～2小时。
(4)最后产物PEG修饰的99mTc-PAMAM-生长抑素(Octreotide)-血管活性肠多肽(VIP)的联合物，即通式所表示{(R)*(P)n*(M)x}-W，经静脉注射后，可达到肿瘤治疗目的。通过咖吗照相机，可对肿瘤显像。
本发明的优点目前，利用多肽进行肿瘤神经内分泌肿瘤核素显像和治疗主要采用单一多肽标记单种核素的方法。由于肿瘤细胞有多种受体共同表达的特点，且不同种受体与核素标记多肽的亲和力不一致，因此肿瘤的核素显像与治疗效果不令人满意。采用联合物“{(R)*(P)n*(M)x}-W”能有效提高肿瘤放射性核素显像和治疗的效率。
权利要求
1.一种用于肿瘤显像和治疗的联合物，其特征在于该联合物为PAMAM—多肽—核素联合物，并用聚乙二醇等进行表面修饰，它的通式可表示为{(R)*(P)n*(M)x}-W式中的R为放射性核素，可为99mTc，188Re，90Y，177Lu，166Ho，153Sm，111In，186Re等金属核素及131I中的一种或一种以上的组合；常用的组合物有177Lu与188Re或90Y组合，99mTc与90Y组合；P为聚酰胺-胺型树状聚合物，表面可为羟基；羧基或氨基(PAMAM)；n为1～10；(P)n代表第1～10代的聚酰胺-胺型树状聚合物，最佳选用4～6代，也可为其它代数；(R)*(P)n表示第1～10代的PAMAM和放射性核素连接；M为能与肿瘤，特别为神经内分泌肿瘤受体选择性结合的多肽1)针对生长抑素受体的可为[亮氨酸，D-色氨酸，酪氨酸]-生长抑素，2)针对血管活性肠多肽(VIP)受体的为血管活性肠多肽，3)针对胆囊收缩素(CCK)受体的为胆囊收缩素，4)针对蛙皮素受体(bombesin)的蛙皮素5)针对胃泌激素释放多肽(GRP)受体的胃泌激素释放多肽6)胰高血糖素样多肽(GLP)受体的胰高血糖素样多肽7)神经多肽Y(NPY)受体的神经多肽Y8)针对肿瘤新生血管整合素的多肽(RGD)x大于或等于2；(P)n*(M)x，表示第1～10代PAMAM中的某一代PAMAM上同时连接2个以上能与神经内分泌肿瘤受体选择性结合的多肽M；W为聚乙二醇、明胶或壳聚糖等多聚物。
2.如权利要求1所述的肿瘤显像和治疗的联合物其特征在于多肽组合，参照如下用于回肠类癌生长抑素与血管活性多肽结合；用于胰岛细胞癌生长抑素与胆囊收缩素、胰高血糖素样多肽结合；用于胃泌激素瘤生长抑素与胰高血糖素样多肽、胃泌激素释放多肽结合；用于支气管类癌生长抑素与血管活性肠多肽结合；用于乳房癌与肺癌生长抑素与RGD结合；
3.如权利要求1所述的肿瘤显像和治疗的联合物的制备方法，其特征在于第一步将PAMAM进行活化，第二步制备核素-组氨酸的标记物，第三步选择能和肿瘤细胞受体选择性结合的多肽，第四步按一定摩尔比将活化后的PAMAM，核素-组氨酸标记物，多肽，进行缩聚反应制成联合物；第五步，用聚乙二醇对联合物进行表面修饰。
4.如权利要求3所述的肿瘤显像和治疗的联合物的制备方法，其特征在于选用第五代PAMAM并由戊二醛进行活化修饰。具体修饰方法为取25％的戊二醛溶液8-10ml，加入PAMAM 40ml，用PBS缓冲液稀释至1ml(戊二醛溶液浓度为0.2％)，在室温下反应1～2小时，充分混合均匀为止。
5.如权利要求3所述的肿瘤显像和治疗联合物的制备方法，其特征在于核素-组氨酸标记物的制备方法如下称取6mgNaCO3，12mg酒石酸钠，22mgNaBH4将它们加入到干净的10ml西林瓶内，瓶内通入CO气体(1.2L/min)10min，然后塞紧瓶塞，用注射器加入1mCi99mTc的淋洗液，置于75～100摄氏度水浴加热20～40分钟，冷却后插入针管放出西林瓶内剩余气体，加入200～300μl HCl溶液(2mol/L)，将多余的NaBH4清除，再用磷酸盐缓冲液(PBS)调节PH至7.4左右，该方法也可以用于制备羰基铼(188Re或186Re)等，制得羰基锝与组氨酸反应，即在羰基锝溶液中加入1～2mg组氨酸，在75～95℃水浴加热，反应5～10分钟，便可制得核素99mTc标记的组氨酸。
6.如权利要求3所述的肿瘤显像治疗联合物的制备方法，其特征在于联合物的制备方法为称取200μl经戊二醛活化修饰的PAMAM溶液，分别加入99mTc标记的组氨酸，生长抑素，血管活化肠多肽各100μl，若按摩尔比，PAMAM∶99mTc组氨酸标记物∶生长抑素∶血管活化肠多肽的分子摩尔比数为1∶3～5∶5～10∶5～10反应，在磷酸盐缓冲溶液中，PH值调节在6左右，室温下反应1～2小时，洗涤即成。
7.如权利要求3所述的肿瘤显像和治疗联合物制备方法，其特征在于联合物采用聚乙二醇(PEG)修饰，其方法为，取200μl混合物，与100μl的2μmol胺基化的PEG于500μl，0.2M，Na2HPO4，pH9，调节PH值至9，若按摩尔比，PAMAM联台物∶PEG＝1～5∶1，在充分搅拌下反应1～2小时，最后生成物的通式可示为{(R)*(P)n*(M)x}-W，其中W为PEG的修饰物。
全文摘要
本发明涉及一种用于肿瘤显像和治疗的联合物及其制备方法，系选用聚酰胺－胺型树状聚合物(PAMAM)为核心，连接一种以上能与肿瘤细胞受体选择性结合的多肽和1个或1个以上核素的PAMAM—多肽—核素联合物，其表面用聚乙二醇进行修饰，它的通式为{(R)*(P)n*(M)
文档编号A61K51/00GK1586625SQ20041005305
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月21日 优先权日2004年7月21日
发明者李培勇, 朱以华 申请人:上海第二医科大学附属瑞金医院