专利名称：用于肿瘤显像与治疗的配合物及其制备方法
技术领域：
本发明属于医用化合物领域，具体涉及一种放射性铼标记的二乙三胺五乙酸(DTPA)的酰基糖类衍生物及其制备方法。
背景技术：
癌症是严重危害健康的常见病，癌症成为第一位致死原因，癌症的防治与研究成为全世界科学家关注的课题。
恶性肿瘤糖酵解作用增强，葡萄糖类似物18F-FDG(18F-氟脱氧葡萄糖)能被肿瘤细胞摄取，肿瘤组织18F-FDG水平明显高于周围的正常组织和良性病变。18F-FDG PET(正电子计算机断层显像)无创性检测肿瘤糖代谢，在恶性肿瘤早期诊断，为临床医生制定肿瘤的治疗、疗效判断、预后评价等方面都发挥着重要的作用。18F-FDG药物需用回旋加速器生产，成本很高；半衰期短，仅110min；所用PET显像仪器价格昂贵；药物合成生产时间长。18F-FDG PET肿瘤显像临床应用二十多年，由于其成本和花费很高，大大限制其在各级医院临床普及推广应用。
后来，人们发现99mTc有理想的核物理性能，其半衰期为6.02h，发射140keV的γ射线，且99mTc发生器容易获得，99mTc的半衰期、能量和射线为最理想的γ显像放射性核素。如能用99mTc标记葡萄糖类似物，必将发挥重要临床意义，可望在医学基础研究和临床方面广泛应用，已成为核素显像剂研制的热点。在2003年Yang DJ首先报道合成双半胱氨酸(EC)-DG，并用99mTc标记；99mTc-ECDG分布研究提示肿瘤/脑和肿瘤/肌肉比值高于18F-FDG，99mTc-ECDG显像能清晰显示恶性肿瘤病灶。但99mTc-ECDG分布显示肿瘤/血液和肿瘤/肺比值小于1.0，低于18F-FDG；99mTc-ECDG还不是理想的99mTc标记DG显像剂，与18F-FDG有较大差距。
发明人完成了99mTc标记二乙三胺五乙酸(DTPA)的酰基糖类衍生物，标记率高，体外稳定性好，操作简便，早期无创性诊断肿瘤，显像成本低(见中国专利申请200510020334.6)。但99mTc标记DG显像剂只发射γ粒子，无法用于肿瘤治疗。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点而提供在一种具有优良治疗和显像性能的、体外稳定性好的用放射性铼标记的配合物。
本发明的另一目的在于提供一种新的放射性铼标记的配合物的制备方法，该制备方法简单，标记方法简单，标记率高。
发明人考虑到，186Re或188Re与99mTc一样，可发射适于显像的γ粒子，但与99mTc不同的是它们还可发射β粒子，其β粒子能量适中，可同时用于治疗，186Re和188Re半衰期都较长，其中188Re可由发生器提供，方便使用，是理想的治疗核素，但是，还必须找到一种适合于与放射性铼形成配合物的配合体化合物，才能用放射性铼标记的配合物标记脱氧葡萄糖，进而用于进行肿瘤靶向治疗及放射性显像研究。
为了使上述理论于实践中得意应用，在本发明人完成了如下配合体化合物的基础上，提出了用放射性铼标记的二乙三胺五乙酸(DTPA)的酰基糖类衍生物的技术思路，来寻找一种能够达到发明目的的配合物用于影像诊断的配合体化合物，为二乙三胺五乙酸(DTPA)的酰基糖类衍生物，结构如通式(II)所示 式(II)结构中的R1为五碳糖，六碳糖，多糖，及巯基、氨基、胺基、氰基、羧基或酯基取代的脱氧五碳糖、脱氧六碳糖、脱氧多糖结构，R2、R3分别为H，或者是五碳糖，六碳糖，多糖，及巯基、氨基、胺基、氰基、羧基或酯基取代的脱氧五碳糖、脱氧六碳糖、脱氧多糖结构。
经过无数次的实验，将放射性铼与上述配合体化合物相结合，得到了如下结构通式的配合物
式(I)中a为186或188，R1为糖或糖胺，R2和R3分别H和/或糖或糖胺。
该配合物采用如下方法制备在密闭反应容器中加入反应配体、弱络合剂、放射性铼和还原剂；调节反应体系pH 2-5.5之间；水浴加热使反应温度在20-100℃，放置反应30-180分钟；所用的反应配体为DTPA-DG、DTPA-2DG、DTPA-3DG中的任一种，所用弱络合剂为葡萄糖酸钠，所用还原剂为惰性气体饱和的SnCl2·2H2O溶液；反应在惰性气体保护下进行。
其中，还原剂SnCl2·2H2O溶液的用量为0.5-10mg/ml，其惰性气体为氮气；起反应保护作用的惰性气体为氦、氖、氩、氮气中的任意一种。
需要特别说明的是，弱络合剂为葡萄糖酸钠在其中是个中间配体。
上述配合物的制备过程，一般可采用1.二乙三胺五乙酸的酰基糖类衍生物的制备搅拌下将二卤亚砜(如最常用的SOCl2)于-30℃-0℃滴入二乙三胺五乙酸(DTPA)中，在-30℃-100℃搅拌，并将反应物回流12-28小时，减压蒸出过剩的二卤亚砜，得酰卤双酐中间化合物，可不经分离直接进行下步反应；在得到的酰卤双酐中，加入DMSO，吡啶和相应的糖或取代糖(如2-氨基D-葡萄糖盐酸盐等)，混合物于-50℃-196℃搅拌24-48小时。反应后的反应溶液用透析膜或葡聚糖凝胶(G10；G15；或G25)等方法进行分离纯化，即得到相应的结构产物。
2.配合物的制备本发明的医用放射性铼配合物，其化学结构通式(I)如下 式(I)中a为186或188，R1为糖或糖胺，R2和R3分别H和/或糖或糖胺。
本发明的医用放射性铼配合物在放射性高铼酸盐(ReO4-)与二乙三胺五乙酸的酰基糖类衍生物在还原剂的存在下反应制备得到所述的放射性铼标记二乙三胺五乙酸的酰基糖类衍生物。
其中反应体系中的配体可为DTPA-DG、DTPA-2DG、DTPA-3DG中的任一种。
铼以高铼酸盐(溶液中为ReO4-)的形式存在，铼为186Re或188Re。
弱络合剂葡萄糖酸钠溶液作为中间配体，一方面稳定Sn2+的作用，减少Sn2+的水解；另一方面可与188Re保持弱络合作用，使188Re处于稳定低价状态，保证取代反应顺利进行。
为防止反应产物被氧化，反应在氦、氖、氩、氮气保护下进行，通常采用氮气。
还原剂为二氯化锡，SnCl2·2H2O的用量为0.5-10mg。
用常用酸碱调节反应体系pH值为2-5.5之间。
适宜的反应温度为20-100℃。
符号说明Re代表元素铼，有或无放射性的同位素。
186Re和188Re分别代表原子量为186和188的铼的两种放射性同位素。
DTPA-DG代表二乙三胺五乙酸-2-氨基葡萄糖(脱氧葡萄糖)或其盐。
186Re或188Re-DTPA-DG分别代表铼-186或铼-188二乙三胺五乙酸-葡萄糖胺(脱氧葡萄糖)或其盐。
3.放射性铼标记的配合物的治疗、显像实验并99mTc-DTPA-DG对比的结果99mTc-DTPA-DG乳腺癌MCF-7裸鼠生物分布显示，肿瘤/血液比值1h、2h分别为1.29、3.13，肿瘤/肌肉比值1h、2h分别为2.63、5.01。乳腺癌MCF-7裸鼠静脉注射188Re-DTPA-DG后12h，肿瘤与周围肌肉的含量比值高达12.76。
99mTc-DTPA-DG荷MCF-7乳腺癌裸鼠显像示肿瘤组织摄取高，T/NT值0.5h、2h分别为2.46、3.54。188Re-DTPA-DG荷MCF-7乳腺癌裸鼠显像示肿瘤组织摄取高，T/NT值12h、24h分别为5.9、7.8。
188Re-DTPA-DG荷瘤小鼠体内生物分布和显像显示出较高的肿瘤摄取，肿瘤中的放射性比血液、肺、肌肉、脑组织的高，肿瘤/血液、肿瘤/肺、肿瘤/肌肉、肿瘤/脑比值均较高。
荷瘤小鼠尾静脉注射188Re-DTPA-DG后3周抑瘤率明显，肿瘤瘤体的体积明显低于高铼酸盐淋洗液组及生理盐水组。
本发明提供的放射性铼标记二乙三胺五乙酸的酰基糖类衍生物标记方法简单，容易制备，标记率高，成本低。生物实验结果表明其在肿瘤组织中有很高的摄取和很好滞留，具有较高的靶/非靶比值，适合用作肿瘤治疗剂和显像剂。
图1为188Re-DTPA-DG配合物注射后12小时乳腺癌MCF-7裸鼠前位平面图像；图2为188Re-DTPA-DG配合物注射后24小时乳腺癌MCF-7裸鼠前位平面图像。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明并不只限于这些例子实施例11)搅拌下将10ml二卤亚砜(SOCl2)于-30℃滴入3.94g二乙三胺五乙酸(DTPA)(IV)中，可在室温下继续搅拌3小时。试验结果显示，此过程在-30℃-100℃温度范围内进行对结果一般均未显示有显著的不利影响。接着将反应物回流20小时，减压蒸出过剩的SOCl2，得酰氯双酐的中间化合物淡黄色粉末3.76g，可不加分离直接进行下步反应。
2)在上步得到的酰氯双酐3.76g(0.010mol)中，加入30ml DMSO，5ml吡啶和2.85g(0.0132mol)2-氨基-D-葡萄糖盐酸盐，混合物一般可于室温下搅拌24小时(此过程的操作温度可允许为20℃-150℃)得透明棕色溶液。此溶液经透析膜或葡聚糖凝胶(G10)等分离纯化，得式(II)所示的DTPA与D-葡萄糖胺缩合物(DTPA-DG)。
MS(m/e)555(M+)，394，3511H-NMR(ppm)δ12.2(4H，b)；δ8.1(b)；δ5.2(1H)；δ4.6(1H，)；δ3.8(2H)；δ3.7(2H)；δ3.6(1H)；δ3.5(10H)；δ3.1(4H)；δ2.9(4H)；δ2.5(4H)3)制备188Re-DTPA-DG配合物取DTPA-DG 10mg，溶于400μL pH值5.5磷酸缓冲溶液的试管中，待完全溶解，加入0.5mol/L葡萄糖酸钠溶液100μL，加入放射性高铼酸盐188ReO4Na 100-200μL，混匀，溶液透明，加入SnCl2·2H2O4mg，调反应体系pH至5.5，立刻振荡混匀，充氮后封口，置于38℃恒温箱中，反应3小时，标记完成。
用TLC方法测定188Re配合物的放射化学纯度。TLC在10cm新华一号层析纸上进行。将1-2μL试样置于层析条的起点，分别用0.9％NaCl和丙酮溶液展开，展开后，空气中自然凉干，等分为11段，测定每段放射性记数。生理盐水上行展开，188Re-DTPA-DG和ReO4-的比移值Rf为0.9-1.0，ReO2的Rf为0；丙酮上行展开，186Re(或188Re)-DTPA-DG和ReO2的Rf为0，ReO4-的Rf为1.0。
DTPA-DG的188Re配合物的稳定性按照实施例1制备的188Re-DTPA-DG，于室温下放置，分别在放置1h、2h、3h、6h、12h点样，TLC分析，新华一号层析纸为支持体，分别用0.9％NaCl和丙酮溶液为展开剂，测定99Tcm-DTPA-DG的放射化学纯度。标记物188Re-DTPA-DG具有较好稳定性，室温放置12小时，放射化学纯度仍达89.2％。
对188Re-DTPA-DG的性能测定描述如下1.188Re-DTPA-DG乳腺癌MCF-7裸鼠生物分布选择体重25g左右的雌性裸鼠，在左大腿皮下接种人乳腺癌MCF-7细胞株，细胞用量0.2ml，约含瘤细胞1×107个，接种后约2周，待肿瘤直径长至约1.0cm时用于实验。乳腺癌MCF-7裸鼠9只，分3组，每组3只，经尾静脉注射Re-DTPA-DG3.7MBq/0.1ml，注射后3h、12h、24h断头处死裸鼠，取血、心、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、肌肉、肿瘤等组织器官，称重并测其放射性计数，计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g)、计算器官/血液比值和肿瘤/器官(T/NT)比值。
188Re-DTPA-DG荷瘤小鼠体内分布实验结果见表1、表2。表中显示当注射时间分别为3、12、24h时，188Re-DTPA-DG均显示出较高的肿瘤摄取。3、12、24h肿瘤的放射性分别占注射剂量的1.98±0.29ID％·g-1、2.89±0.43ID％·g-1、0.42±0.06ID％·g-1。188Re-DTPA-DG在肾脏放射性较高，胃无明显放射性分布，肠道放射性低，放射性药物在体内稳定，游离ReO4-形成极少。放射性示踪剂主要经肾脏排泄经尿液排入膀胱。脑组织中放射性分布低。脑组织中放射性分布低，由于DTPA-DG为水溶性，其分子量较FDG大，不易通过血脑屏障。
肿瘤中的放射性比血液、肺、肌肉、脑组织的高，在注射后12h，肿瘤/血液、肿瘤/肺、肿瘤/肌肉、肿瘤/脑比值分别为11.00、5.22、12.76、16.72。24h内肿瘤/血液比值、肿瘤/肌肉比值均较高。肿瘤组织摄取188Re-DTPA-DG高，可行肿瘤治疗和显像研究。
表1188Re-DTPA-DG荷瘤裸鼠体内组织分布(x±s)ID％·g-1
表2188Re-DTPA-DG荷瘤裸鼠体内的T/NT值
2.188Re-DTPA-DG乳腺癌MCF-7裸鼠显像实验选择体重25g左右的雌性裸鼠，在左大腿皮下接种人乳腺癌MCF-7细胞株，细胞用量0.2mL，约含瘤细胞1×107个，接种后约2周，待肿瘤直径长至约1.0cm时用于实验。乳腺癌MCF-7裸鼠3只，经尾静脉注射188Re-DTPA-DG 18.5MBq/0.1mL，注射后1、2、4、12、24h进行静态采集，观察188Re-DTPA-DG在肿瘤灶的浓聚情况，用ROI技术计算病灶和健侧大腿对应位置的放射性计数比值(T/B)。
188Re-DTPA-DG乳腺癌MCF-7裸鼠显像从图1、图2可以看出，肿瘤灶显示清晰，肉眼观察其放射性高于对侧。肾脏影可见，膀胱放射性逐渐增加，其余器官如脑、肺、小肠、肌肉无明显放射性分布高，未见甲状腺、胃显影。用ROI技术测得12h、24h T/B比值分别为5.9、7.8。188Re-DTPA-DG荷瘤动物显像能清晰显示肿瘤灶。188Re-DTPA-DG在肾脏放射性较高，胃无明显放射性分布，肠道放射性低。放射性示踪剂主要经肾脏排泄经尿液排入膀胱。荷瘤动物188Re-DTPA-DG显像能清晰显示肿瘤灶，用于诊断肿瘤。
3.MCF-7乳腺癌细胞摄取188Re-DTPA-DG实验取30只一次性试管，每管加100μl细胞悬液，设188Re-DTPA-DG组和ReO4-组，实验开始分别加入188Re-DTPA-DG和ReO4-淋洗液3.7kBq/10μL，置于37℃5％CO2孵箱中。分别于0.5h、1h、2h、3h、4h后离心(1000转/分)5分钟，用一次性棉签小心吸取上清液，用PBS洗涤两次，离心，弃去上清液，SN-695B型智能放免γ测量仪检测计数cpm，并测量总T管计数cpm。计算不同时段实验组和对照组肿瘤细胞摄取率，肿瘤细胞摄取率＝(每支试管计数/总T管计数)×100％，数值用x±s表示。
MCF-7乳腺癌细胞摄取188Re-DTPA-DG实验结果见表3。188Re-DTPA-DG组和ReO4-组在不同时段均有显著性差异(P＜0.05＝，对照组基本不摄取，实验组随着时间延长摄取率逐渐升高，且存在差异。肿瘤细胞摄取188Re-DTPA-DG高，188Re-DTPA-DG能进入细胞内用于诊断和治疗研究。
表3 肿瘤细胞摄取率(x±s)
4.188Re-DTPA-DG荷瘤裸鼠生长抑制实验6只裸鼠接种MCF-7乳腺癌细胞以1×107mL-1右前肢皮下，待瘤体直径约10mm时开始实验。分为生理盐水对照组、ReO4-组、188Re-DTPA-DG组。生理盐水对照组给予0.1mL生理盐水，ReO4-组和188Re-DTPA-DG组均采用尾静脉比活度92.5GBq/L(0.1mL)。每2-3天观察瘤体大小，连续观察3周肿瘤瘤体的体积变化。抑瘤率＝(1-实验组体积/对照组体积)×100％188Re-DTPA-DG组治疗21天后肿瘤体积明显比ReO4-组、生理盐水组小，分别823.6±50.58，1153.0±99.42，1162.7±73.08mm3。188Re-DTPA-DG组、高铼酸盐淋洗液组及生理盐水组之间差异有显著性(F＝13.893，P＜0.01)(表4)。188Re-DTPA-DG注射一次后3周的抑瘤率为29.2％。188Re-DTPA-DG能抑制肿瘤生长，发挥治疗作用。
表4 各组荷瘤裸鼠治疗3周后瘤体体积的比较(x±s)
表2阿色纳品马来酸盐微粉化
188Re-DTPA-DG注射后可高选择地被肿瘤组织摄取，而非肿瘤组织摄取低，可提高Re治疗肿瘤的靶向性，疗效好、副作用少，明显改善预后，为临床上多种恶性肿瘤治疗提供新的内照射治疗方法。188Re-DTPA-DG制备简单、使用方便、价格较低、能随时供应，将是一种较理想的肿瘤代谢内照射治疗新药，临床应用前景广。
因此，本发明放射性铼标记DTPA-DG配合物其具有制法简单，成本低，可以用于肿瘤显像与治疗，可望成为一种具有良好前景的新型肿瘤治疗剂和显像剂。
实施例2在按实施例1方式得到的酰氯双酐(0.010mol)中，加入40mlDMSO，8ml吡啶和7.55g(0.035mol)2-氨基-D-葡萄糖盐酸盐，混合物于20℃-140℃搅拌40小时，得透明棕色溶液。此溶液经透析膜或葡聚糖凝胶(G15)等分离纯化，得式(II)结构中R1、R2和R3均为D-葡萄糖胺-2的产物(DTPA-3DG)。
用所得DTPA-3DG产物备188Re-DTPA-3DG配合物的方法参照实施例3在按实施例1方式得到的酰氯双酐(0.010mol)中，加入30mlDMSO，6ml吡啶和2.35g(0.012mol)2-巯基-D-葡萄糖，混合物于-10℃-120℃搅拌40小时，得棕色溶液。此溶液经透析膜或葡聚糖凝胶(G10)等分离纯化，得R1、R2为2-巯基-D-葡萄糖，R3为H的式(II)结构产物(DTPA-2DG)。
用所得DTPA-2DG产物备188Re-DTPA-2DG配合物的方法参照实施例4按实施例1的方式得到DTPA-DG，用所得DTPA-DG产物备186Re-DTPA-DG配合物的方法参照实施例1，只是将SnCl2·2H2O改为5mg，放射性高铼酸盐改成100-500μL即可。
实施例5按实施例2的方式得到DTPA-3DG，用所得DTPA-3DG产物备186Re-DTPA-3DG配合物的方法参照实施例1，只是将SnCl2·2H2O改为5mg，放射性高铼酸盐改成100-500μL即可。
实施例6按实施例3的方式得到DTPA-2DG，用所得DTPA-2DG产物备186Re-DTPA-2DG配合物的方法参照实施例1，只是将SnCl2·2H2O改为5mg，放射性高铼酸盐改成100-500μL即可。
权利要求
1.一种用于肿瘤显像与治疗的配合物，化学结构通式如(I)所示 式(I)中a为186或188，R1为糖或糖胺，R2和R3分别H和/或糖或糖胺。
2.一种制备权利要求1中所述配合物的方法，其特征在于包括如下步骤在密闭反应容器中加入反应配体、弱络合剂、放射性铼和还原剂；调节反应体系PH值在2-5.5之间；水浴加热使反应温度在20-100℃，放置反应30-180分钟；所用的反应配体为DTPA-DG、DTPA-2DG、DTPA-3DG中的任意一种，所用弱络合剂为葡萄糖酸钠，所用还原剂为惰性气体饱和的SnC12·2H2O溶液；反应在惰性气体保护下进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于还原剂SnC12·2H2O溶液的用量为0.5-10mg/ml，惰性气体为氮气。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的惰性气体为氦、氖、氩、氮气中的任意一种。
全文摘要
本发明公开了一种标记率高、稳定性好的用于诊断和治疗的放射性铼标记二乙三胺五乙酸－脱氧葡萄糖(DTPA－DG)及其制备方法。本发明的制备方法特点是在反应器中加入适量反应配体、放射性铼、葡萄糖酸钠溶液和还原剂，调节反应体系一段时间，即得到所需产物。放射性铼－DTPA－DG可望用于实体肿瘤放射性诊断和治疗。本发明制备的制剂，配上
文档编号A61K51/02GK1861616SQ20061002109
公开日2006年11月15日 申请日期2006年6月1日 优先权日2006年6月1日
发明者陈跃, 熊青峰, 黄占文, 何菱, 李举联 申请人:泸州医学院附属医院, 四川大学