F1t4(VEGFR－3)作为肿瘤显像和抗肿瘤治疗的靶的制作方法

专利名称：F1t4(VEGFR－3)作为肿瘤显像和抗肿瘤治疗的靶的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及受体的基因，尤其是受体酪氨酸激酶的基因，它们向重组DNA载体中的插入，以及在宿主微生物菌株和宿主真核细胞中结果蛋白的产生。更具体而言，本发明涉及Flt4这种受体酪氨酸激酶；编码Flt4的核苷酸序列；产生Flt4的编码DNA及其基因产物的方法；特异性识别(杂交)这些受体的编码核酸的核酸探针；特异性识别这些受体的抗体；应用这些探针和抗体以及其它Flt4结合化合物的方法，例如用于在动物和人体组织中鉴定淋巴管和高内皮小静脉(HEV)以及用于促进或预防病理状态下Flt4表达细胞的生长。
背景负责分化细胞和组织的发育、维持和修复的细胞行为很大一部分是通过生长因子和类似的配体及它们的受体间所传递的细胞间信号来调节。所述受体位于应答细胞的表面，它们结合已知为生长因子以及其它激素样配体的肽或多肽。该相互作用导致应答细胞中迅速的生物化学改变以及细胞基因表达的迅速和长期的再调整。与各种细胞表面相关的若干受体可以结合特定的生长因子。
酪氨酸磷酸化是跨质膜信号传递的关键方式之一。若干酪氨酸激酶基因编码肽生长因子和激素的跨膜受体，例如表皮生长因子(EGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子受体I(IGF-I)、血小板衍生生长因子(PDGF-A和B)及成纤维细胞生长因子(FGFs)[Heldin等，细胞调节，1555-566(1990)；Ullrich等，细胞，61243-54(1990)]。几种造血生长因子的受体都是酪氨酸激酶；这些包括c-fms和c-kit，c-fms是集落刺激因子1受体[Sherr等，细胞，41665-676(1985)]，c-kit为始祖造血生长因子受体[Huang等，细胞，63225-33(1990)]。
这些受体的特异性和亲和性存在差异。通常，受体酪氨酸激酶是糖蛋白，其包括，胞外结构域(能结合特异生长因子)，跨膜结构域(通常为蛋白质α螺旋部分)；近膜结构域(该受体可通过例如蛋白磷酸化进行调节的部位)；酪氨酸激酶结构域(为该受体的酶性组分)和羧基端尾部(在许多受体中参与酪氨酸激酶底物的识别和结合)。
在几个受体酪氨酸激酶中，选择性剪切和选择性腺苷酸化过程可以从相同的基因中产生几个不同的多肽。这些可以包括或不包括上述的各种结构域。因此一些胞外结构域可以作为细胞分泌的独立蛋白而表达，而且所述受体的一些形式可以缺乏酪氨酸激酶结构域并且仅含有通过跨膜结构域和短羧基端尾部插入到质膜的胞外结构域。
血管系统、胚胎血管发生和血管生成、凝血、伤口愈合和再生以及几种疾病的生理学涉及排列于血管内壁的血管内皮。血管树的发生通过血管发生产生，而且根据一些理论，淋巴系统的形成紧接着动脉和静脉的发育，始于从静脉出芽。见Sabin FR，Am JAant，943(1909)；和van der Putte，S.C.J.Adv Anat Embryol Cell Biol，513(1975)。
胎儿期之后，除了在与新血管形成相关的血管发生期间外，内皮细胞增殖非常缓慢。刺激血管发生的生长因子通过特异性内皮细胞表面受体酪氨酸激酶发挥其作用。
在受体酪氨酸激酶的配体中，血小板衍生生长因子(PDGF)在鸡尿囊绒膜中显示了血管生成性，虽然很弱。转化生长因子α(TGFα)是由几种肿瘤细胞和巨噬细胞分泌的血管生成因子。肝细胞生长因子(HGF)，即c-met原癌基因编码的受体的配体，也具有强血管生成性，包括在培养的内皮细胞中与TGFα作用相似的反应。
有证据表明存在内皮细胞特异性生长因子和受体，其可能主要负责刺激内皮细胞生长、分化以及确定分化的功能。最广泛研究的生长因子是血管内皮生长因子(VEGF)，其为PDGF家族成员。血管内皮生长因子是两个23kDa亚单位通过二硫键连接的二聚体糖蛋白，因其对内皮细胞的有丝分裂活性和其诱导血管渗透的能力(因此其又被称为血管渗透因子)而被发现。报道的VEGF的其它作用包括细胞内钙离子动员、诱导纤溶酶原刺激因子和纤溶酶原刺激因子抑制剂-1的合成、刺激内皮细胞中已糖转移和在体外促进单核细胞迁移。由不同的mRNA剪切变体编码的四种VEGF异构体表现出相同的刺激内皮细胞有丝分裂的能力。VEGF的121个和165个氨基酸的异构体以可溶的形式分泌，而189个和206个氨基酸残基异构体仍然与细胞表面结合，并且与肝素有强亲和力。可溶性非肝素结合和肝素结合形式还被描述为相关胚胎生长因子(PIGF，分别为131和152个氨基酸)，其在人胚胎、滋养细胞肿瘤和培养的内皮细胞中表达。
VEGF表达模式表明其涉及正常血管系统的发育和维持以及肿瘤的血管发生。在小鼠发育期间，交配后全部7.5天，内胚层表达VEGF，并且在毛细血管向内生长阶段室神经外胚层产生VEGF。在鹌鹑发育的第二天，在卵黄囊的血管形成区域和整个胚胎均表达VEGF。另外，在成年小鼠中紧靠穿通内皮的内皮细胞持续表达VEGF，提示其在这个特异性内皮的表型和功能的维持中起作用。
两个VEGF的高亲和力受体，VEGFR-1/Flt1(fms样酪氨酸激酶-1)和VEGFR-2/Kdr/Flk-1(含受体/胎儿肝激酶-1的激酶插入结构域)，其特性已经被描述。这些受体分类为PDGF受体家族。然而，VEGF受体在其胞外结构域中具有7个免疫球蛋白样环(而PDGF家族成员有5个环)而且具有较大的激酶插入片段。虽然一些VEGF受体可以在单核细胞和黑色素瘤细胞系中出现，VEGF受体的表达主要发生在血管内皮细胞中。据报道只有内皮细胞应答VEGF时发生增殖，而且不同来源的内皮细胞显示不同的应答。因此，通过VEGFR-1和VEGF-2介导的信号表现出细胞类型特异性。
VEGFR-1和VEGFR-2以高亲和力结合VEGF165(Kd分别约为20pM和200pM)。Flk-1受体也已经表明在应答VEGF时发生自我磷酸化，但是几乎不能检测到Flt1的磷酸化。VEGFR-2介导的信号引起显著的形态学变化、肌动蛋白重组和过量表达这种受体的猪主动脉内皮细胞的膜波动。在这些细胞中，VEGFR2还介导配体诱导的趋化作用和有丝分裂发生作用；而VEGFR-1转染的细胞缺乏对VEGF的有丝分裂应答。相反，VEGF对大鼠中表达VEGFR-1的窦状隙内皮细胞具有强生长刺激作用。用VEGFR-1和VEGFR-2进行的磷酸蛋白共沉淀存在差别，表明不同的信号分子与受体特异性细胞内序列相互作用。
在原位杂交研究中，小鼠VEGFR-2mRNA的表达可见于卵黄囊和胚胎内中胚层(对交配后(p.c.)7.5天的胚胎进行评估，内皮细胞衍生于该胚胎)，而后见于可能的成血管细胞、心内膜和大的与小的血管内皮(12.5天p.c.)。血管芽、胚胎期的分支血管和出生后早期的脑中增殖的内皮细胞中富含VEGFR-2mRNA，在成年脑中它为低表达，这表明VEGFR-2是血管发生和血管生成的主要调节因子。VEGFR-1表达同样与小鼠胚胎中的早期血管发育和皮肤伤口愈合时的新血管生成相关联。然而，在成年器官中检测到高水平的VEGFR-1表达，表明VEGFR-1在成熟血管的静止内皮细胞中具有功能，其与细胞生长无关。VEGFR-2的鸟类同系物从原肠胚形成开始就在中胚层中发现，而VEGFR-1同系物首先在共表达内皮标记的细胞中发现。在鹌鹑外胚层体外培养中，这些细胞的血管发生性分化所必需的FGF-2上调VEGFR-2的表达。发现在发育后期两种VEGF受体的表达均更受限制。在人胚胎组织中，VEGFR-1和VEGFR-2表现出重叠的但略有差异的表达模式。这些资料表明VEGF及其受体以旁分泌方式发挥作用，来调节内皮细胞的分化和组织的新血管发生。
最近表明VEGF是低氧诱导型内皮细胞生长和血管发生的刺激因子，而且利用特异性单克隆抗体抑制VEGF的活性以显示可以降低实验肿瘤的生长及其血管密度[Ferrara等，内分泌综述，184-25(1997)；Shibuya等，癌症研究进展，67281-316(1995)；Kim等，自然，362841-844(1993)]。
大小超过几立方毫米的实体肿瘤的生长依赖于血管供应，使得血管发生成为抗癌治疗的诱人靶点。已经报道用内源性血管发生抑制剂或含有血管他丁(纤溶酶原的片段)和内膜他丁(胶原18的片段)的“抑制素”治疗肿瘤获得令人鼓舞的结果[O′Reilly等，细胞，79315-328(1994)；O′Reilly等，细胞，88277-85(1997)]。两种因子均由原发肿瘤正常分泌，而且保持转移静止。在动物模型中，任一种抑制素的全身给药均显示还可诱导并维持原发肿瘤的休眠。抑制素的受体和由抑制素介导的信号传递，以及激活它们的蛋白酶尚有待鉴定。需要其它治疗性分子用于在癌症和其它病理状态的治疗中控制血管生成。
已知原发乳腺癌表达几种血管发生多肽，其中VEGF的表达最丰富[见例如Relf等，癌症研究，57963-969(1997)]。在浸润型和非浸润型导管型(原位)乳腺癌中，肿瘤细胞包括高水平的VEGFmRNA[Brown等，人类病理学，2686-91(1995).]。靠近原位瘤的内皮细胞表达VEGFR-1和VEGFR-2mRNA。VEGF及其受体可以有助于恶性乳腺肿瘤的血管发生进程，因为在几个独立的研究中，发现了肿瘤血管密度和疾病预后之间的相关性[Weidner等，J.Natl.CancerInst，841875-1887(1992)]。需要针对乳腺癌和乳腺癌相关血管发生的其它标记物，来改进诊断和普查并作为干预治疗的靶点。
淋巴系统的主要功能是提供组织中液体回流，并且将许多血管外物质运送回血液。另外，在其成熟过程中，淋巴细胞离开血液，通过淋巴器官和其它组织进行迁移并且进入淋巴管，然后通过胸导管返回血液。特化小静脉，即高内皮小静脉(HEV)，再一次结合淋巴细胞并使其外渗到组织中。因此淋巴管和尤其是淋巴结在免疫和不同肿瘤转移性的发展中发挥重要作用。
自从20世纪初，出现了三个不同的关于淋巴系统胚胎起源的理论。然而，由于缺少已知的可用于淋巴管的特殊标记物，难于鉴定淋巴管。
对淋巴管的研究通常借助于淋巴照影进行。在淋巴照影中，将X-射线对照介质直接注射到淋巴管中。该对照介质沿淋巴系统的离心导液管方向分布。对照介质在淋巴结中汇集，在此其停留达半年，这期间X-射线分析允许监控淋巴结的大小和结构。该诊断在带有淋巴结转移的肿瘤患者和恶性淋巴瘤患者(如淋巴瘤)中尤其重要。然而，在本领域中，需要对淋巴组织成像的材料和方法进行改进。
发明概述本发明提供了位于5号染色体的新受体酪氨酸激酶基因，其被鉴定为人白血病细胞中未知的酪氨酸激酶同源性PCR-cDNA片段[Aprelikova等，癌症研究，52746-748(1992)]。该基因及其编码的蛋白命名为Flt4。该简称来源于fms-样酪氨酸激酶4一词。
Flt4是一种结构上与VEGFR-1和VEGFR-2基因的产物密切相关的受体酪氨酸激酶。由于这种相似性和随后发现的这三种受体之配体间的相似性，Flt4又命名为VEGFR-3。Flt4和VEGFR-3这两个名称在本文中可以互换。尽管这三个受体之间存在相似性，Flt4的成熟形式与几种VEGFR存在差别该差异是Flt4的胞外区被水解成两个二硫键连接的多肽，125/120kD和75kD。Flt4基因编码具有可任选的3′外显子的4.5kb和5.8kbmRNA，分别编码190kD和195kD的多肽。
另一差异是VEGF不显示与Flt4的特异性结合而且不诱导其自我磷酸化。
对Flt4、Fltl和KDR/Flk-1受体mRNA信号的比较表明在被研究的组织中存在重叠但不相同的表达模式。Kaipainen等，实验医学杂志，1782077(1993)。Flt4基因表达显得比VEGFR-1和VEGFR-2的表达受到更多的限制。首次检测到Flt4的表达是在小鼠交配后8.5天，在其胚胎的头部间质、主静脉以及胚外尿囊中对成血管细胞进行原位杂交之时。在交配后12.5天的胚胎中，Flt4信号可见于发育中的静脉内皮及假定的淋巴内皮，但动脉内皮表现为阴性。在发育后期，F1t4mRNA只见于发育中的淋巴管。在成人组织中仅有淋巴内皮和一些高内皮小静脉表达Flt4mRNA，而且在转移性淋巴结的淋巴窦和淋巴管瘤中其表达增加。这些结果支持淋巴管起源于静脉的理论。
从人红白血病细胞系中克隆的Flt4受体酪氨酸激酶cDNA的蛋白产物已N-糖基化并且在其胞外结构域中包括7个免疫球蛋白样环。Flt4的细胞质酪氨酸激酶结构域与Fltl和KDR的相应结构域在氨基酸水平上大约有80％的同一性，而与血小板衍生生长因子、集落刺激因子-1、干细胞因子和Flt3受体有大约60％的同一性。见Pajusola等，癌症研究，525738(1992)。
本发明提供了分离的编码Flt4受体酪氨酸激酶的多核苷酸(例如具有指定结构的DNA或RNA片段)，其可用于制备Flt4蛋白及其肽段并回收其它来源的相关基因。
本发明提供了包含编码上述Flt4受体酪氨酸激酶或相关蛋白的外源性片段的重组DNA载体，其可插入到微生物或真核细胞并能表达编码的蛋白。
本发明提供了真核细胞，其能够产生有效量的Flt4受体酪氨酸激酶和来源于许多物种的功能相似的蛋白。
本发明提供了可以在实验室合成或通过微生物产生的肽，所述肽模拟天然Flt4受体酪氨酸激酶蛋白的活性。在另一个实施方案中，本发明涉及抑制Flt4受体酪氨酸激酶蛋白活性的肽。
尤其优选的肽选自(a)短Flt4形式，其核苷酸序列和推导的氨基酸序列见SEQ ID No 1和2；(b)在其羧基末端具有不同的核苷酸和相应氨基酸残基的第二种形式，即长Flt4形式，其核苷酸序列和推导的氨基酸序列见SEQID No 3和4。长Flt4形式具有1363个氨基酸残基。
DNA和RNA分子、重组DNA载体、及包含上述任一种蛋白或多肽之核苷酸序列的修饰型微生物或真核细胞也是本发明的一部分。具体而言，含下述两种DNA序列之部分或全部的序列，互补DNA或RNA序列，或相应RNA序列均尤其优选(a)诸如SEQID NO1的DNA序列，其编码短Flt4形式(SEQ ID NO2)，(b)诸如SEQ ID NO3的DNA序列，其编码的Flt4中SEQ ID NO1的核苷酸3913-4416已改变，其编码长Flt4形式[SEQ IDNO4]。
本发明还提供了包括较大序列之片段的DNA和RNA分子，用于进行本发明关于利用基因工程技术制备这类肽和制备寡核苷酸探针的优选方面。
因为在此确定了编码Flt4蛋白的DNA序列，所以可以利用市售的仪器通过例如聚合酶链式反应或通过化学合成的方法，制备编码Flt4蛋白的DNA，其后可以利用已知的重组DNA技术将该基因插入到任何可用的DNA载体中。而且，还可以应用自动化仪器，使任何在此公开的多肽的直接合成可以容易地完成。
本发明还涉及Flt4肽和其它构建体，并且涉及将Flt4作为淋巴内皮细胞的特异标记的应用。
在特定的实施方案中，本发明涉及识另 Flt4的核酸探针和抗体，尤其是单克隆抗体和包含此抗体的组合物。
在特定的实施方案中，本发明涉及用于在组织样品和生物体中监控淋巴管的方法。而且，本发明的目的是提供可表示生物中淋巴组织尤其是淋巴管的状态(炎症、感染、创伤、生长等)的临床检测方法，并且提供用于检测淋巴管和淋巴管形成的方法。
本发明的另一个目的是提供特异性识别Flt4受体蛋白或其各种抗原决定簇的单克隆抗体。本发明的目的是应用这些诊断性单克隆抗体检测和测定组织中，尤其是在淋巴组织中FIt4受体的量。在抗Flt4抗体的章节中，术语“特异性识另 Flt4”、“特异性结合Flt4”、“对Flt4特异”等等意指与其它内皮细胞表面受体(包括VEGFR-2/Kdr/Flk-1和VEGFR-1/Fltl)相比抗体优先结合Flt4(与之发生免疫反应)。因此，抗Flt4抗体或其它对Flt4“特异”的Flt4结合化合物可用于，经本发明所述方法(如医学影象、检测、筛查或靶向治疗)对在组织或生物样品中的Flt4进行鉴定和/或标记，因为它们根本就不能结合其它抗原的抗原决定簇，或者与其它抗原结合的亲和力与Flt4的亲和力相比足够低，低到在这些情况下可以忽略不计。
本发明的另一个方面涉及检测细胞样品中Flt4受体的存在的方法，其步骤包括(a)将细胞样品暴露于本发明的抗体，尤其是单克隆抗体；(b)检测该单克隆抗体与Flt4受体的结合。
本发明进一步涉及在淋巴管生成中及在炎症、感染和免疫状态中调节(例如拮抗或促进)Flt4功能的方法。例如，在一个实施方案中，这类方法包括通过提供足够量Flt4结合化合物以阻断参与此反应的Flt4内皮细胞位点，抑制Flt4介导的淋巴管生成，尤其当Flt4功能与诸如转移癌、淋巴瘤、炎症(慢性或急性)、感染和免疫性疾病等疾病相关时。
本发明进一步涉及特异性激活Flt4的配体和单克隆体及它们在激活淋巴内皮中的应用，并且涉及从对配体的研究中得到的片段和多肽以及抗体，以其用来在需要的时候，例如在涉及Flt4功能的各种疾病状态中，抑制Flt4的功能。
本发明为Flt4受体酪氨酸激酶的配体提供了细胞系来源。利用这些细胞的条件培养基，Flt4配体可经本领域常规方法纯化并克隆。利用此条件培养基或纯化的配体，可得到用于Flt4和二聚作用抑制剂以及Flt4信号传导抑制剂的检测系统，其可用于鉴定和制备这些抑制剂。
在本发明的优选实施方案中，PC-3细胞系的条件培养基包括蛋白或其片段，其能够激活Flt4受体并且调节特定内皮细胞的生长和分化以及其分化功能。Flt4配体或其肽或其衍生物有助于调节内皮细胞的生长、分化和它们的分化功能，而且有助于制备针对此配体的激动剂和拮抗剂。Flt4配体尤其有助于调节淋巴内皮。然而纯化的或重组产生的Flt4配体也可以激活相关的KDR/Flk-1受体。
激活Flt4的配体的鉴定使得直接检测该配体的抑制剂或Flt4功能的抑制剂成为可能。将这些抑制剂简单地加到含Flt4配体的条件培养基中，如果它们能抑制自我磷酸化，那么就将其作为Flt4信号抑制剂。例如，可以分析重组或合成的肽(包括但不限于Flt4胞外结构域的片段)对Flt4-配体相互作用或Flt4二聚作用的抑制。这些推测的Flt4抑制剂和抗Flt4配体的抗体、阻断Flt4受体-配体相互作用的肽或其它化合物、以及与编码Flt4配体的mRNA序列互补的反义寡核苷酸，均有助于调节内皮细胞并且有助于治疗与内皮细胞功能相关的疾病。
命名为VEGF-C的Flt4配体的详细特征见1998年2月2日提交的PCT专利申请PCT/US98/01973，即国际公开号WO98/33917；1996年8月1日提交的PCT专利申请PCT/FI96/00427，即国际公开号WO97/05250；以及作为上述专利的优先权的美国专利申请优先权文献，所有这些在此引入本文作为参考。推导的前VEGF-C氨基酸序列见SEQ ID NO21所示。
对命名为VEGF-D的另一种Flt4配体的详细叙述见Achen等，美国国家科学院院刊，95(2)548-553(1998)和Genbank登记号AJ000185，二者在此引入本文作为参考。推导的前体VEGF-D氨基酸序列见SEQ ID NO22所示。
本发明还涉及治疗哺乳动物的方法，该哺乳动物患有以在细胞中表达Flt4酪氨酸激酶为特征的疾病，所述方法的步骤包括给哺乳动物施用组合物，该组合物包括可有效抑制Flt4配体蛋白与该生物体细胞中表达的Flt4结合的化合物，从而抑制Flt4的功能。所述疾病可以是上述已经提及的疾病，例如以不希望有的淋巴管生成为特征的疾病。另外，已经发现Flt4表达还在相关于至少部分乳腺癌(可能还其它癌症)的血管中发生(即其表达水平大大超过在相应正常(健康)组织的血管系统中几乎不可检测或完全不可检测的表达水平)。因此在优选的实施方案中，所述细胞包括(淋巴管或血管的)内皮细胞。在另一个实施方案中，所述细胞包括肿瘤细胞，例如表达F1t4的某些淋巴瘤。尤其考虑对人的治疗。
“可有效抑制Flt4配体蛋白与生物体细胞中表达的Flt4结合的化合物”意指抑制与在此描述为血管内皮生长因子C的Flt4配体(其可从PC-3条件培养基中分离到)结合的任何化合物。据信这类化合物还可有效抑制血管内皮生长因子D与Flt4的结合。化合物的实例包括如下的肽(a)包含抗-Flt4抗体的抗原结合片段的多肽；(b)包含可溶性Flt4片段(例如胞外结构域片段)的多肽，其中所述片段和多肽可与Flt4配体结合；(c)包含脊椎动物血管内皮生长因子C(VEGF-C)多肽的片段或类似物的多肽，其中所述多肽或片段或类似物可结合天然宿主细胞(即在其表面表达天然Flt4蛋白的生物体细胞)表达的Flt4，但是不能激活Flt4；和(d)包含脊椎动物血管内皮生长因子D(VEGF-D)多肽的片段或类似物的多肽，其中所述多肽或片段或类似物可结合天然宿主细胞(即在其表面表达天然Flt4蛋白的生物体细胞)表达的Flt4，但是不能激活Flt4。还考虑了常规体外筛选检测中用诸如VEGF-C和重组表达的Flt4)可鉴定的小分子抑制剂。高度优选含抗-Flt4抗体的抗原结合片段的多肽。这些肽包括例如特异性结合Flt4的多克隆抗体和单克隆抗体；这些抗体的片段；嵌合或人源化抗体；特异性结合Flt4并且还特异性结合另一抗原的双特异性抗体等等。还考虑了与循环的Flt4配体结合并且因此抑制该配体与Flt4结合的化合物。这类化合物包括抗VEGF-C或抗VEGF-D抗体或包含其抗原结合片段的多肽。在相关的变化中，本发明考虑了阻断下游细胞内Flt4信号传导并因此抑制Flt4功能的治疗方法。
在优选的变化中，所述化合物还包括可检测标记(如本文他处所述)或细胞毒试剂。细胞毒试剂包括植物毒素(例如蓖麻毒蛋白，皂草素)，细菌或真菌毒素，放射性同位素(例如211-砹、212-铋、90-钇、131-碘、99m-锝和本文所述的其它同位素)，抗代谢药(例如氨甲喋呤，5-氟尿嘧啶)，烷化剂(例如苯丁酸氮芥)，抗有丝分裂药(例如长春花生物碱)和DNA嵌入剂(例如阿霉素)。
同样，为了改进给药，组合物优选还包括可药用的稀释剂、佐剂或载体媒介。
如本文所详述，尽管Flt4的表达主要限定于健康成人的淋巴管内皮，在至少某些肿瘤周围的血管中发现了Flt4的表达。因此本发明还包括治疗哺乳动物肿瘤患者的方法，所述肿瘤以在血管内皮细胞中表达Flt4酪氨酸激酶(Flt4)为特征，所述方法包括如下步骤给需要该治疗的哺乳动物施用组合物，所述组合物包括可有效抑制Flt4配体蛋白与该生物体的血管内皮中表达的Flt4结合，因此抑制了Flt4介导的血管内皮增生的化合物。
特别考虑了对选自癌(例如乳腺癌)、鳞状细胞癌、淋巴瘤、黑色素瘤和肉瘤等肿瘤的治疗。然而，很显然在本文中详细叙述的检查技术可以鉴定其它以在其血管内皮细胞中表达Flt4为特征的肿瘤，所述肿瘤均对本文中叙述的抗Flt4治疗方法敏感。特别考虑了以其血管内皮细胞表达Flt4为特点的乳腺癌的治疗。以在血管内皮细胞中表达Flt4受体酪氨酸激酶为特征的恶性肿瘤意指一种疾病，其中在血管中可以检测到Flt4，其水平大大超过在健康组织中的几乎不可检测或完全不可检测的水平，如本文中的例证。
可利用本领域公认的剂量递增试验和剂量反应试验，根据经验决定化合物的有效治疗量。肿瘤治疗的有效治疗量是指可以有效减缓肿瘤生长、或有效终止肿瘤的生长、或有效缩小或消除肿瘤，并且对接受肿瘤治疗的患者不产生不可接受的副作用的剂量。当所述化合物包括抗体或其它多肽时，优选其剂量为约0.1-100mg抗体每公斤体重，更优选1-10mg/kg。对通常具有较长血液半衰期的人源性抗体，优选从每天给药到每隔一个月给药，更优选每周或每隔一周或每三周一次给药。监控治疗的进展、患者的副作用和循环抗体的水平将给最佳剂量方案提供额外的指导。在以其它抗体(如抗HER2，抗EGF受体)为基础的癌症治疗方面，所发表的资料和正在进行的临床实验也可有效指导所述剂量方案。
在本文所述治疗方法中，优选的化合物包括含抗Flt4抗体之抗原结合片段的多肽和含可溶性Flt4胞外结构域片段的多肽。高度优选人和人源化抗Flt4抗体。
预计本发明治疗方法的优点在于，Flt4在健康组织的血管中通常没有明显的表达。在高度优选的实施方案中，治疗化合物包括双特异性抗体或其片段，其中所述抗体或片段特异性结合Flt4并特异性结合一种血管内皮标记抗原。“血管内皮标记抗原”是指任何在增殖的血管内皮细胞中表达的细胞表面抗原，并且优选不在淋巴管内皮细胞中表达的表面抗原。血管内皮标记的实例包括PAL-E[deWaal等，美国病理杂志，1501951-1957(1994)]，VEGFR1和VEGFR2[Ferrara等，内分泌综述，184-25(1997)]，Tie[Partanen等，分子细胞生物学，121698-1707(1992)]，endoglin[美国专利号5776427，在此全文引入作为参考]和von Willebrandt因子。预计这些双特异性抗体优先定位于同时表达Flt4和血管内皮标记物的肿瘤相关血管。在高度优选的实施方案中，所述化合物还包括与该双特异性抗体偶联的抗肿瘤试剂或细胞毒试剂，其目的是杀伤肿瘤细胞和/或杀伤为肿瘤细胞供血的血管。试剂实例包括上述的那些，还包括在宿主体内激活肿瘤免疫应答的治疗性蛋白，例如抑制素、细胞因子、趋化因子等等。
在另一个实施方案中，所述化合物包括抗体(或双特异性抗体)，其识别一个(或多个)包含Flt4/Flt4配体复合物(例如Flt4与VEGF-C或VEGF-D结合的复合物)的抗原决定簇。
还进一步考虑了治疗性化合物与可有效抑制血管生成因子的广谱药物偶联或共同给药。这类试剂有肝素结合药物(例如戊聚糖和苏拉明类似物，其可以抑制与肝素结合的血管生成因子)，以及阻断内皮细胞生长和迁移的化学试剂，例如烟曲霉素类似物。
还考虑了将抗Flt4化合物与药物前体结合，使药物前体通过所述抗Flt4化合物靶向肿瘤血管，然后在肿瘤生长部位被局部激活(例如通过放射)。应用这些药物前体的策略预计具有减少药物对表达Flt4之健康淋巴管的副作用的优点。
同样，本发明包括治疗患有恶性肿瘤的哺乳动物的方法，所述恶性肿瘤的特点是在血管内皮细胞中表达Flt4酪氨酸激酶(Flt4)，该方法包括如下步骤鉴别患有以在血管内皮细胞中表达Flt4为特点的恶性肿瘤的哺乳动物体，并且给需要该治疗的所述哺乳动物施用组合物，该组合物包括有效抑制Flt4配体蛋白与在该生物体血管内皮细胞中表达的Flt4结合，从而抑制Flt4介导的血管内皮细胞增殖的化合物。
本发明还提供了检查生物样品中Flt4受体酪氨酸激酶蛋白(Flt4)的存在的方法，包括如下步骤(a)使怀疑含有Flt4的生物样品与包含Flt4结合化合物的组合物进行接触，其条件可使该化合物与该生物样品中的Flt4结合；(b)在可以除去未与生物样品中Flt4结合的Flt4结合化合物的条件下，洗涤生物样品；并且(c)在洗涤步骤之后，通过检测与生物样品中Flt4受体酪氨酸激酶结合的Flt4结合化合物，筛选存在Flt4的生物样品。所述化合物优选包括选自如下多肽的多肽(a)包含抗Flt4抗体之抗原结合片段的多肽；和(b)包括Flt4配体或Flt4结合片段或其类似物的多肽。高度优选特异性结合Flt4并且还包括可检测标记的抗体。
本发明还涉及使可能含有表达Flt4受体酪氨酸激酶蛋白(Flt4)之细胞的脊椎动物组织显像的方法，其包括如下步骤(a)将脊椎动物组织与包含Flt4结合化合物的组合物接触；并且(b)通过检测与该组织结合的Flt4结合化合物使该组织显像。所述组织优选人的组织，并且所述方法还包括在接触步骤之后而在显像步骤之前洗涤组织的步骤，其条件可以从组织中除去未与Flt4结合的Flt4化合物。
在相关的变化中，本发明提供了使哺乳动物组织中肿瘤显像的方法，其包括如下步骤(a)将疑含肿瘤的脊椎动物组织与含有Flt4结合化合物的组合物接触；(b)检测与该组织中细胞结合的Flt4结合化合物；并且(c)通过鉴定被Flt4结合化合物结合的血管内皮细胞使实体肿瘤显像，其中表达Flt4的血管与组织中肿瘤的存在和定位相关。在一个优选的实施方案中，所述方法还包括将所述组织与第二个化合物(例如抗体)接触的步骤，该第二个化合物特异性结合在淋巴管内皮中实质上不出现的血管内皮标记(例如PAL-E、VEGFR-1、VEGFR-2)；并且检测与组织中细胞结合的所述第二种化合物；其中显像步骤包括鉴别被所述Flt4结合化合物和所述第二种化合物标记的血管，并且其中被所述Flt4结合化合物和所述第二种化合物标记的血管与组织中肿瘤的存在和定位相关。应当理解应用第二种化合物有助于开业医生更迅速区分在其表面表达Flt4的血管和正常淋巴管。
本发明进一步涉及监测恶性肿瘤状态的方法，其包括如下步骤(a)将疑有恶性肿瘤状态的哺乳动物组织与包含特异性结合Flt4受体酪氨酸激酶的抗体或抗体片段的组合物接触；(b)检测与所述哺乳动物细胞结合的抗体或抗体片段；并且(c)根据与所述哺乳动物细胞结合的抗体的量和分布而筛查恶性肿瘤。如同在本文中的叙述，Flt4(其通常在血管中不可检测或几乎不可检测)在至少一些肿瘤的血管中被强染色。因此在一个实施方案的筛选步骤中，与血管内皮细胞结合的抗体或抗体片段的发现与恶性肿瘤的存在相关。在本方法中，应该理解“发现”意指发现高水平的Flt4，其水平显著高于在相应正常组织中的几乎不可检测或完全不可检测的水平，如本文中叙述的一样。通过与用健康生物体组织进行的对照实验比较可以确证所述差异表达。尤其优选筛查哺乳动物组织的肿瘤。如上所述，通过给该哺乳动物施用与血管内皮标记特异性结合的第二种化合物，可以使所述方法容易进行，其中检测步骤包括检测与血管生成性内皮细胞结合的所述第一种化合物和所述第二种化合物。
由上述还可知，本发明方法中所用的各种化合物也属于本发明。例如，所述化合物包括上述的抗Flt4抗体和双特异性抗体。同样，本文所述任何化合物在生产本文所述治疗或诊断或显像所用药物中的的应用(单独或联合)也属于本发明。所述药物还包括可以药用的稀释剂、佐剂、或载体等等。
类似地，本发明包括试剂盒，其内含本发明的化合物或组合物，其包装方式有利于实施本发明的方法。在最简单的实施例中，这类试剂盒包括由密封瓶或罐等容器容纳的本发明化合物或组合物，描述实施本发明方法时化合物或组合物之用途的标签贴在该容器上或含在包装中。优选将化合物或组合物以单位剂量的形式进行包装。在另一个实施方案中，本发明的试剂盒将Flt4结合化合物与第二种化合物包装在一起，所述第二种化合物能结合血管内皮细胞表面所表达的、淋巴管内皮中实质上不出现的标记物(抗原)。
根据本申请的全文(包括详细的说明书)，本发明的其它特点和变化对本领域技术人员是显而易见的，且所有这些特点均为本发明的方面。同样，本文所述本发明的特点可以重新组合成其它的实施方案，这也被认为属于本发明，不管这些特点的联合是否在上面的叙述中作为本发明的一个方面或实施方案而被具体提及。另外，仅有本文中作为本发明的关键而被叙述的限制才被视为限制；本文未作为关键来描述的本发明的无限制改动也被认为属于本发明。
除上述以外，本发明另包括在任何意义上比上述具体变化范围更小的本发明所有实施方案。虽然申请人发明了所附权利要求的全部，但其并不想包含其它人在此领域已作的工作。因此，当专利局或其它实体或个人提请申请人注意某项权利要求包括了法定的现有技术时，申请人保留根据专利法进行修改的权利，以重新定义该权利要求的主体，使之特别排除上述法定现有技术或使之与现有技术相比有明显改变。经这类权利要求的修改而定义的本发明改变也认为属于本发明。
附图简述

图1A是Flt4cDNA克隆的结构示意图。
图1B是Northern杂交凝胶的照片复印件。
图2A-F表示Flt4的结构特点示意图和其与Fltl酪氨酸激酶序列进行比较的示意图。
图3A是克隆子J.1.1和I.1.1的cDNA插入片段的3’末端示意图。
图3B是与反义RNA探针和Flt4RNA的长片段形式和短片段形式杂交的放射自显影照片的复印件。
图3C是与反义RNA探针和Flt4 RNA的长片段形式和短片段形式杂交的放射自显影照片的复印件。
图4是凝胶的照片复印件，描述对不同物种的DNA样品中Flt4序列的杂交分析。
图5A-5H描绘了导管内肿瘤中表达VEGFR-3的血管的免疫组化特点。在相邻的切片(图5A，B)中，VEGFR-3和PAL-E在充满癌细胞的导管周围染色成形状相似的“项链”状血管(箭头)。另一套相邻的切片对应VEGFR-3(图5C)、层粘连蛋白(图5D)、胶原XVIII(图5E)和SMA(图5F)的染色。PAL-E和VEGFR-3双染色的切片(图5G)与VEGFR-3染色的相邻切片(图5H)进行比较。与受侵袭的导管相邻的血管为双阳性(箭头)，而VEGFR-3阳性血管出现在距离受侵袭导管一小段距离的导管间基质中(箭头)。值得注意的是在双染色方法中，基底层为PAL-E阳性。放大倍数图5A、B为400×，图5C、D、E、F为320×，图5E、F为480×。
详细描述被称为Flt4的新型受体酪氨酸激酶的克隆、测序和表达如下。Flt4基因位于染色体5q35区，许多生长因子和生长因子受体定位于此。Flt4的胞外结构域由包括12个强效糖基化位点的7个免疫球蛋白样环组成。根据结构的相似性，Flt4与先前已知的Fltl和KDR/FLK1受体可以组成III类酪氨酸激酶的亚家族。Flt4基因表达产物为5.8kb和4.5kb mRNA，它们的区别在于3’端序列，以及在HEL和DAMI白血病细胞中的不同表达。
Wilm’s肿瘤细胞系、视网膜母细胞瘤细胞系和非分化畸胎瘤细胞系可表达Flt4，而分化的畸胎瘤细胞系则为阴性。大部分胎儿组织也表达Flt4mRNA，其中脾脏、脑中间区和肺以最高水平表达。在成人组织中表达水平最高的是胎盘，肺、肾、心脏和肝脏的表达依次递减。在原位杂交中，Flt4的放射自显影颗粒分布于胎儿肺的内皮细胞。胎儿组织中Flt4的免疫组化染色证实了内皮细胞的染色。在18周龄的人胎儿组织中Flt4的表达模式与Fltl和KDR相比存在很大差异。见Kaipainen等，实验医学杂志，1782077(1993)。
实施例4和11叙述了含所述Flt4cDNA的表达载体的产生及在COS和NIH3T3细胞中的表达。
本发明的Flt4DNA和多肽可用于Flt4配体的纯化和各种器官中内皮细胞生长和分化的调节。它们还被证实可用于某些疾病的诊断/治疗。
在下面的叙述中，大量应用了重组DNA(rDNA)技术的很多术语。为了使说明书和权利要求书(包括这些术语的范围)明确并一致，给出下述定义。
基因.包含RNA聚合酶的模板的DNA序列。从基因转录的RNA能或不能编码蛋白。编码蛋白的RNA称为信使RNA(mRNA)，并且在真核生物中由RNA聚合酶II进行转录。然而，已知如何构建包括RNA聚合酶II模板的基因，其中具有与特定mRNA序列互补但通常不翻译的RNA序列被转录。这样的基因构建体在本文中称为“反义RNA基因”并且将这样的转录本称为“反义RNA”。由于在反义RNA中存在翻译的终止密码子，反义RNA通常不翻译。
“互补DNA”或“cDNA”基因包括通过逆转录缺少插入序列(内含子)的mRNA而合成的重组基因。
克隆载体.质粒或噬菌体DNA或其它DNA序列，其可以在宿主细胞中自主复制，并且其特征在于具有一个或几个内切酶识别位点，可以用可确定的方式在这些位点切割所述DNA序列而不损害载体的基本生物学功能，并且为引起其复制和克隆可以将DNA剪接入该位点。所述克隆载体可以还包括适合在克隆载体所转染细胞的鉴定中应用的标记物。例如标记物为四环素抗性标记或氨苄青霉素抗性标记。单词“载体”有时指“克隆载体”。
表达载体.与克隆载体相似的载体，转化了宿主细胞后，其可以表达克隆到该载体的基因。通常将克隆基因置于如启动子序列等调控序列的控制(即与调控序列可操作的连接)之下。表达调控序列可以变化，其依赖于设计载体是用来在原核宿主细胞中还是在真核宿主细胞中表达可操作的连接的基因，并且其还可以另外包括如转录元件如增强子元件、终止序列、组织特异性元件和/或翻译起始和终止位点。
本发明涉及重组Flt4蛋白(短和长形式)的表达，并且涉及这些蛋白的功能性衍生物。
功能性衍生物.Flt4蛋白的功能性衍生物为拥有与非重组Flt4蛋白非常相似的生物活性(功能的或结构的)的蛋白。Flt4蛋白的功能性衍生物可以包括或不包括如共价连接的碳水化合物等翻译后修饰，这取决于实现特定功能时这些修饰的必要性。术语“功能性衍生物”被认为包括分子的“片段”、“变体”、“类似物”和“化学衍生物”。
与在本文中应用的一样，当一种分子包含通常并非其部分的其它化学部分时，其被称为另一个分子的“化学衍生物”。这些部分可以改进分子的可溶性、吸收性、生物半衰期等。所述部分也可降低分子的毒性并且消除或降低分子的任何不良副作用等。在Remington′s药理学(1980)中公开了能够介导所述作用的部分。用于将这些部分与分子结合的方法在本领域中众所周知。
片段Flt4蛋白等分子的片段意指分子的任何部分，例如肽核心或肽核心的变体。
变体Flt4蛋白等分子的变体意指在结构和生物活性上与完整分子或其片段基本相似的分子。因此，如果两个分子拥有相似的活性，即使其中一个分子的组成或次级、三级或四级结构与另一个分子不同或者氨基酸序列不同，它们也被认为是在此作为术语的变体。
类似物Flt4蛋白或基因序列的类似物意指在功能上与本文中Flt4蛋白或基因序列非常相似的蛋白或基因序列。
优选实施方案描述本发明涉及被申请人命名为“Flt4”的酪氨酸激酶的受体、编码Flt4的核苷酸分子(例如cDNA、基因组DNA、RNA、反义RNA等)、由Flt4基因序列及其产物制备Flt4肽或Flt4蛋白产物、重组Flt4表达载体、Flt4类似物和衍生物以及应用Flt4和相关蛋白、Flt4配体、Flt4拮抗剂和抗Flt4抗体进行诊断和/或治疗。
重组体Flt4的制备通过在适当的宿主细胞中克隆和表达Flt4编码序列或其功能等价物，可以制备具有生物活性的Flt4。
为了便于叙述，可以将利用重组DNA技术制备Flt4的方法分成下列步骤(1)分离或制备目的Flt4编码序列(基因)；(2)构建能够指导目的Flt4合成的表达载体；(3)转染或转化能够复制并表达所述Flt4基因，和/或加工该基因产物来产生目的Flt4的适当宿主细胞；和(4)鉴定并纯化目的Flt4产物。
分离或制备所述Flt4基因Flt4的核苷酸编码序列或其功能等价物可以被用来构建重组表达载体，该载体可指导目的Flt4产物的表达。在本发明方法的实施中，在本文中描述的核苷酸序列或者其片段或功能等价物可以被用来制备能指导重组Flt4产物在适当宿主细胞中表达的重组分子。Flt4编码序列可以从各种产生Flt4样活性和/或表达Flt4mRNA的细胞来源中获得。申请者鉴定了大量的对Flt4适合的人细胞来源，包括人胎盘白血病细胞以及一些肿瘤细胞系。
Flt4编码序列可以通过从这些细胞来源中分离并纯化的RNA的cDNA克隆获得或通过基因组克隆获得。例如利用本领域中熟知的技术，通过聚合酶链式反应可以从cDNA或基因组DNA材料中扩增Flt4序列。可以利用本领域熟知的技术制备克隆子的cDNA或基因组文库，并且用与Flt4基因的任何部分基本互补的核苷酸探针针对特定的Flt4DNA筛选文库。全长克隆，即包含目的Flt4的完整编码区域的那些克隆，可以被筛选用于构建表达载体。或者，可用本领域标准技术化学合成全部或部分Flt4编码DNA。由于核苷酸编码序列固有的简并性，在本发明方法的实施中，可以应用编码基本相似或功能上等价的氨基酸序列的其它DNA序列。这些Flt4核苷酸序列的变化包括缺失、插入或不同核苷酸的替代，其导致得到编码相同的或在功能上等价的基因产物的序列。所述基因产物可以包括导致沉寂改变的该序列内氨基酸残基的缺失、插入或代替，因此产生具有生物活性的蛋白。根据相关氨基酸的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性的相似性，可以产生此类氨基酸替代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；带有具有相似亲水性值之无电荷极性头部基团或非极性头部基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷胺酰胺；丝氨酸、苏氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。
构建Flt4表达载体利用此信息，可得到能够提供适当量Flt4受体酪氨酸激酶的各种重组DNA载体。利用标准的重组DNA技术，可以从所述Flt4受体酪氨酸激酶cDNA制备具有相关结构的其它重组DNA载体，其编码具有在此鉴定的关键结构特点的合成蛋白及编码其它来源的相同家族的蛋白。本技术的实例是Flt4受体酪氨酸激酶的转化表达(见实施例3和4)。通过转染真核细胞，所述新发现的序列和结构信息可以用来制备用于生物学目的的Flt4受体酪氨酸激酶及其各种结构域。
鉴定表达Flt4基因产物的转染体或转化体通过至少下列四种常用的方法可以鉴定包含重组编码序列并表达具有生物活性的成熟产物的宿主细胞(a)DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-反义RNA杂交；(b)“标记”基因功能的存在或缺乏；(c)通过检测宿主细胞中Flt4mRNA转录本的表达来评估转录水平；(d)通过免疫检测并最终通过其生物活性测定成熟基因产物。
在第一种方法中，利用包含与Flt4编码序列同源的核苷酸序列的探针，通过DNA-DNA杂交可以检测插入到表达载体中之Flt4编码序列的存在。
在第二种方法中，根据特定“标记”基因功能(例如胸腺嘧啶核苷激酶活性、抗生素抗性、氨甲喋呤抗性、转化表型、杆状病毒中包涵体形成等等)的存在或缺失，可以鉴定并筛选所述重组表达载体/宿主系统。例如，如果所述Flt4编码序列插入到载体的标记基因序列之内，可以通过检测标记基因功能的缺失鉴定包含该编码序列的重组体。或者将所述标记基因与所述Flt4序列串联排列，处于相同或不同的用于调控所述Flt4编码序列表达的启动子控制之下。应答诱导或筛选的所述标记物的表达提示Flt4编码序列的表达。
在第三种方法中，Flt4编码区的转录活性可以通过杂交实验进行检测。例如，利用与所述Flt4编码序列或其特殊部分同源的探针，通过Northern杂交可以分离并分析多腺苷酸RNA。或者，可以提取所述宿主细胞的总核酸并用这类探针进行杂交检测。
在第四种方法中，Flt4的表达可以用免疫学方法进行检测，例如Western杂交、放射免疫沉淀等免疫检测、酶联免疫检测等等。然而，成功的表达系统的最终检测包括对生物活性Flt4基因产物的检测。所述宿主细胞分泌该基因产物时，从培养的转化宿主细胞中获得的无细胞培养物可以用于Flt4活性的检测。基因产物不被分泌时，可分析细胞裂解物的这类活性。在这两种情况中，可以检测与Flt4结合的配体或Flt4的其它生物活性。
Flt4衍生物、类似物和肽还考虑了与Flt4相关的衍生物、类似物和肽的制备和应用，而且其在本发明范畴之内。与天然Flt4相比，这些衍生物、类似物或肽可以增加或降低生物活性，这依赖于具体应用。本发明的Flt4相关衍生物、类似物和肽可以通过各种本领域中熟知的方法制备。基因水平和蛋白水平上的方法和操作属于本发明的范畴。本领域中标准的肽合成法可以用来获得Flt4肽。在蛋白水平上，通过本领域熟知的技术，多种化学修饰可以用来制备Flt4样衍生物、类似物或肽，所述技术包括但不限定于内肽酶(例如溴化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶、V8蛋白酶等等)或外肽酶的特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、氧化等。
优选那些保留Flt4配体结合活性的衍生物、类似物和肽。那些与Flt4配体结合但不能传导其应答信号的衍生物、类似物和肽被用作为Flt4抑制剂。那些与Flt4配体结合且传递其应答信号(例如通过涉及细胞内Flt4自我磷酸化的过程)的衍生物、类似物和肽以天然Flt4相同的方式应用。用于这类结合和/或自我磷酸化检测的优选Flt4配体是可从本文所述之PC-3条件培养基中分离的包含约23kd多肽的配体。在下列PCT专利中详细叙述了这个命名为血管内皮生长因子-C(VEGF-C)的配体的特点，PCT/F196/00427，1996年8月1日提交，其国际公开号为WO97/05250；和其要求优先权的美国专利申请优先权文本，所有这些在此全文引入作为参考。
抗Flt4抗体识别Flt4蛋白或相关蛋白的多克隆和单克隆抗体的制备也属于本发明的范畴。
可用在本领域中已知的各种方法制备针对Flt4抗原决定簇的多克隆抗体。对于抗体的制备，可以通过注射Flt4或合成的Flt4肽免疫各种宿主动物(包括但不限定于兔、小鼠、大鼠等)。可以依宿主的种类应用各种佐剂来增强免疫应答，佐剂包括但不限定于弗氏(完全或不完全)佐剂、氧化铝等矿物胶、如溶血卵磷脂等表面活性物质、pluronic多元醇、聚阴离子、乳胶油、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和如BCG(Bacillus Calmette-Guerin)和小棒状杆菌等可能有用的人佐剂。
利用通过细胞系连续培养制备抗体分子的任何技术，可以制备针对Flt4抗原决定簇的单克隆抗体。这些技术包括但不限定于最初由Kohler等，自然，256495-497(1975)描述的杂交瘤技术，和更近期的人B细胞杂交瘤技术[Kosbor等，Immunocology Today，472(1983)]及EBV杂交瘤技术[Cole等，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R Liss，Inc，pp.77-96(1985)]。还可以在细菌中从克隆的免疫球蛋白cDNA制备抗Flt4抗体。利用重组噬菌体抗体系统，可在细菌培养中迅速产生并筛选抗体，还可对其结构进行遗传操作。
包含分子独特型的抗体片段可以用已知的技术制备。例如，这些片段包括但不限于F(ab′)2片段，其可以用胃蛋白酶消化抗体分子来产生；Fab′片段，其可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键来产生；两个Fab片段，它们可以通过用木瓜蛋白酶和还原试剂处理抗体分子来产生。
Flt4抗体可用于成熟Flt4和Flt4前体以及亚成分形式的定性和定量检测、Flt4多肽的亲和纯化和Flt4生物合成、代谢及功能的说明。Flt4酪氨酸激酶活性的检测可以作为此类试验中Flt4特异性信号之产生和扩增的酶方法。Flt4抗体还可以用作为诊断和治疗药物。
Flt4、编码Flt4的核酸分子和抗Flt4抗体的应用申请者考虑了本发明组合物的各种广泛应用，包括Flt4、Flt4类似物和衍生物、编码Flt4的核酸分子、反义核酸分子和抗Flt4抗体的诊断和/或治疗应用。
编码Flt4的核酸分子或其片段可以作为用来检测和定量编码Flt4的mRNA的探针。应用核酸探针来检测已知基因的全部或部分序列的检测方法在本领域众所周知。Flt4mRNA水平可以提示恶性肿瘤的出现和/或存在以及提示其它人类疾病的开始和/或发展。因此，能检测并定量Flt4mRNA的试验可以为此提供有价值的诊断工具。
可在以消除Flt4的存在或下调其水平为目的的治疗中，用反义Flt4RNA分子有效抑制编码Flt4之mRNA的翻译。例如，当Flt4与致病有关(如由于其过表达)时，对这类疾病的治疗可用Flt4反义RNA作为Flt4拮抗剂。
另外，Flt4反义RNA有助于解释Flt4的功能机制。Flt4的核酸分子可以用于产生本文分别论述的重组Flt4蛋白和相关分子。
抗Flt4抗体可以在多种情况中用于诊断和定量Flt4。例如，抗Flt4各种结构域的抗体可以作为Flt4免疫分析或免疫组化评估的基础。Flt4的酪氨酸激酶活性可以有助于这些检测，因为可将Flt4信号的的产生用酶反应扩大化。抗Flt4抗体还有助于研究细胞表面Flt4的量。
可以制备作为Flt4配体激动剂或拮抗剂的抗体，并因此使Flt4活性的调节成为可能。另外，可合成或从随机寡核苷酸中重组产生随机肽，并可利用Flt4胞外结构域筛选与所述Flt4受体特异性结合的随机肽。还可用Flt4胞外结构域按本领域的标准方法从噬菌体展示文库中筛选此类肽片段。这类肽可能具有激动或拮抗活性。与各种用于在体内使表达Flt4的细胞和组织或肿瘤显像的化合物结合后，Flt4抗体还提供了有用的诊断工具。
抗Flt4的单克隆抗体可以与适当的超磁、顺磁、电子密集、产生回波的(echogenic)或放射活性试剂以共价键或非共价键结合，制备靶向显像试剂。可以用通过蛋白水解或化学处理产生的抗体片段或利用单克隆抗体的抗原决定簇结合结构域制备的分子替代完整的抗体。然后此显像试剂将作为对照试剂用于诊断目的的人体X-射线、磁共振、超声或闪烁显像。
Flt4的分子生物学SEQ ID No1和3所示Flt4cDNA克隆的完整序列，依据两种不同的剪接分别延伸4195或4795个核苷酸并包括1298或1363个氨基酸的开放阅读框架。所述核苷酸和推导的Flt4氨基酸序列(短形式)见SEQ ID Nos1和2所示。图2描绘了Flt4氨基酸序列与Fltl酪氨酸激酶氨基酸序列的比较。见Shibuya等，癌基因，5519-524(1990)。
在起始甲硫氨酸之后为推测的大部分是疏水氨基酸的信号肽序列。相应ATG周围的序列与共有的转录起始序列一致[Kozak，核酸研究，158125-8135(1987)]。预测的两个Flt4多肽的细胞外部分长度均为775个氨基酸，并且包括12个用于天冬酰胺连接的糖基化(NXS/T)的潜在位点。其还包括显示免疫球蛋白超家族几个成员的间距模式的几个氨基酸残基[Willams等，免疫学年鉴(Annu Rev Immunol)，6381-405(1988)]。其有12个半胱氨酸残基并且它可以组织成7个免疫球蛋白样结构域。预测的Ig样结构域IV缺少半胱氨酸残基。图2还显示了Fltl胞外结构域(SEQ ID No.5)，其为与Flt4最相似的人型同系物。从此图中可以看到半胱氨酸残基的排列和非常相似的Ig样区域的组成。
由23个疏水氨基酸残基组成的推测的跨膜结构域域将胞浆结构域与胞外结构域分离。该序列在细胞质一侧为一个碱性区，它提示跨膜结构域与胞浆结构域的结合。酪氨酸激酶同源结构域起始于残基843，包括ATP结合口袋，并在Y1068上推测有与c-src之Y416同源的自我磷酸化位点(图2)。Flt4的酪氨酸激酶催化结构域被包含65个氨基酸的一个序列(氨基酸944-1008)分成两个亚结构域，所述65个氨基酸序列大部分是亲水性氨基酸并且与Flt1没有同源性。与Flt1不一样，Flt4在其激酶插入片段中不包括酪氨酸残基。
第二种Flt4mRNA具有另一种3′末端，其编码更长形式的Flt4蛋白。
在图3A-3C中，说明了通过两种不同剪接产生的短形式和长形式Flt4mRNA。图3A给出了克隆J.1.1和I.1.1之cDNA插入片段3′末端的结构示意图。指出了克隆J.1.1的TAG终止密码子以及聚腺苷酸化(polyA)位点。克隆I.1.1与克隆J.1.1的不相同区域用阴影表示(分别为长形式和短形式Flt4mRNA)。TAA和polyA表明克隆I.1.1的终止密码子和聚腺苷酸位点。另外，还指出了EcoRI和AvaI的酶切位点。下面给出的是克隆I.1.1中用于cDNA保护性分析的256 bp EcoRI-AvaI插入片段。浓阴影部分表明用于在体外转录反义链的线性化正义RNA模板中多接头的序列。还显示了在RNA酶保护性分析之后被保护片段的结构示意图。图3B和3C显示了256bp35S标记的反义RNA探针以及211和124bp消化片段的放射自显影图，所述两片段分别为Flt4 RNA在特定细胞系(Tera-2为恶性畸胎瘤细胞系，在此用或不用视黄酸(RA)处理10天后对其进行分析)中受到聚腺苷酸化RNA保护时的长形式和短形式。(阴性)对照泳道显示了用转移RNA进行保护的结果。可见Tera-2细胞分化期间Flt4mRNA的下调。Tera-2细胞系的克隆13由C.F.Granham博士(牛津大学动物学系，英国)提供。在本研究中应用传代18-40代的细胞。在含10％胎牛血清和抗生素的Eagle′s基本培养基(MEM)中培养细胞。为了诱导分化，将细胞平铺于明胶覆盖的组织培养级培养皿中，其密度为1.5X1013细胞/cm2。在第二天，向培养基中加入2×10-6MRA。在RA存在的条件下培养细胞直到10天。
图3A-C所示结果表明经两种不同剪接产生Flt4的这两种形式(短和长)的羧基末端。
根据Flt4推导的氨基酸序列，其属于III类RTK。更具体地说，Flt4属于RTK亚家族，其胞外部分包括7个Ig环，因此它不同于III类RTK中包含5个Ig环的其它成员。Flt4与FLT家族的原型受体Flt1以及小鼠KLK1受体具有最高特异性，其中Flt1是从一个人类基因组DNA文库中克隆的v-ros相关DNA[Shibuya等，癌基因，5519-524(1990)]，KLK1是从富含造血干细胞的小鼠肝脏级分中克隆的[Matthews等，细胞，651143-1152(1991)；Matthews等，美国国家科学院院刊，889026-9030(1991)]。Flt4的胞外结构域与人Flt1和小鼠FLK1分别有33％和37％的氨基酸序列同一性。与Flt4一样，Flt1和FLK1在各种正常组织中有广泛的表达，例如肺、心脏和肾脏等。另外，最近鉴定的人内皮细胞受体酪氨酸激酶KDR[Terman等，癌基因，61677-1683(1991)]显示与Flt4和Flt1家族成员具有相当的同源性。从可用的序列资料中计算发现KDR与Flt4在酪氨酸激酶(TK)结构域有81％同一性。另外，KDR的胞外结构域也有7个Ig环结构并且其TK1和TK2结构域与小鼠FLK1受体的相应结构域有95％和97％的同一性。这表明KDR是小鼠FLK1的人类同系物。
虽然Flt4TK结构域与Flt1和FLK1/KDR的TK结构域大约有80％相同，但是其与III类RTK的其它受体的TK结构域只有大约60％相同。因为这些其它受体在胞外结构域中仅具有5个Ig样结构域，可将Flt4、Flt1和FLK1/KDR划归III类RTK家族中一个独立的FLT亚家族。
在PDGFR、c-fms和c-kit的激酶插入片段中位于D/E-D/E-Y-M/V-P/D/E-M[Cantley等，细胞，64281-302(1991)](SEQ ID NO.6)序列中的酪氨酸残基为自我磷酸化位点，其在磷酸化时结合磷脂酰肌醇3′激酶(PI-3K)的SH2结构域[Reedijk等，EMBO J.111365-1372(1992)]。有趣的是，与这些III类RTK不同，FLT亚家族成员或Flt3/FLK2受体不包含这些保守的基序。
8个人类III类RTK基因集结在3个不同的染色体上。4号染色体上含有c-kit、PDGFR-α和KDR基因[Yarden等，EMBO J.，63341-3351(1987)；Stehman等，基因、染色体、癌症，1155-158(1989)；Terman等，癌基因，61677-1683(1991)1。Flt1和Flt3位于13号染色体的q12区[Satoh等，日本癌症研究杂志，78772-775(1987)；Rosnet等，基因组学(Genomics)，9380-385(1991)]，而Flt4位于5号染色体q35带[Aprelikova等，癌症研究，52746-748(1992)]；靠近fms和PDGFR-β基因[warrington等，基因组学，11701-708(1991)]。5号染色体的长臂与在白血病细胞中发现的易位有关。在顽固性贫血和巨红细胞症患者骨髓细胞中发现5号染色体长臂的部分缺失[Van Den Berghe等，自然，25l437-439(1974)]。在几个其它骨髓增生性疾病中发现5q染色体异常，如拌有过量胚细胞的顽固性贫血[Swolin等，血液，58986-993(1981)]，原因不明的髓样化生[Whang-Peng等，白血病研究，241-48(1978)]，慢性髓源性白血病[Tomiyasu等，癌症遗传学.细胞遗传学，2309-315(1980)]，原发性脾大性红细胞增多(polycythemia vera)[VanDen Berghe等，癌症遗传学.细胞遗传学，1157-162(1979)]和特发性血小板增多[Nowell等，癌症，422254-2260(1978)]。
关于Flt4mRNA表达的发现表明其蛋白产物为某些白血病细胞特有。已表明成巨核细胞和内皮细胞间存在几个共同的分化抗原，例如血小板糖蛋白IIIa[Ylanne等，血液，721478-1486(1988)；Kieffer等，血液，721209-1215(1998)；Berridge等，血液，6676-85(1985)]。另外，胚胎期某些内皮细胞，如肺和肾的内皮细胞表达Flt4。
为了进一步理解Flt4在发育期间的作用，克隆了小鼠Flt4的部分cDNA。在原位杂交中应用这些探针分析了小鼠发育期间Flt4mRNA的表达。确定了在淋巴系统的淋巴管发生和淋巴管生成期间表达Flt4。还在正常的和病理状态的成人组织中证实了这些发现的关联性，例如在正常和病理条件下的成人组织的淋巴管内皮及一些高内皮小静脉(HEVs)中均发现了Flt4。
小鼠Flt4cDNA片段的克隆表明其推导的氨基酸序列与人的相应序列几乎相同(在所研究的两个片段中氨基酸同源性大约96％)。从Northern杂交实验中获得了对于小鼠Flt4cDNA同一性的进一步证据，其中两个物种的探针均在小鼠组织中产生典型的5.8kb mRNA信号。对从成年小鼠组织中分离的RNA的分析表明Flt4在肝脏、肺、心脏、脾和肾脏中表达，而在脑组织和睾丸中没有或有非常少的杂交。此模式与早期由Galland等，癌基因，81233(1993)中报道的模式相似。RNA酶保护实验的结果表明，小鼠发育期间，从交配后8.5天开始就需要Flt4基因，其相对表达水平较稳定。
为了进行原位杂交，筛选了两个编码胞外结构域序列的小鼠Flt4cDNA片段。这可使Flt4与相关的FLK-1和Flt1受体(其与Flt4在胞外区的序列同一性很低)的杂交模式明确区分。见Millauer等，细胞，72835(1993)；Yamaguchi等，发育，118489(1993)；Peters等，美国国家科学院院刊，908915(1993)；Finnerty等，癌基因，82293(1993)。
与FLK-1、Flt1、Tie和Tek内皮受体酪氨酸激酶基因相似，Flt4在交配后(p.c.)7.5天的胚胎中不表达。在交配后8.5天的胚胎中，最强的Flt4信号位于尿囊、脑间充质的成血管细胞、背侧大动脉和主静脉。在心内膜中可见弱信号。相反，与FLK-1和Flt1、Tie和Tek不同的是，Flt4在卵黄囊的成血管细胞中为阴性。见Korhonen等，癌基因，8395(1993)；和Peters等，美国国家科学院院刊，908915(1993)。Flt4表达限定于静脉系统的现象在11.5天小鼠胚胎样品中更清楚，而此时Tie mRNA在动脉中也表达。在交配后12.5的胚胎中，Flt4信号分布于发育中的静脉和可能的淋巴管内皮中，但是与内皮的Tie受体酪氨酸激酶不同的是，其在动脉内皮中为阴性。在发育后期，Flt4mRNA仅限于不含血细胞的血管丛(其代表发育中的淋巴管)中。在成人组织中，只有淋巴管内皮和一些高内皮小静脉表达Flt4mRNA。表达的增加可见于淋巴窦和高内皮小静脉、转移性淋巴结，以及淋巴管瘤。
由于解释来自小鼠胚胎的资料有困难，研究了人的内皮，因为人的淋巴系统更明确。还可以在细胞培养中研究从各种内皮中建立的细胞，以验证在体外条件下是否保持特异性Flt4表达。已知内皮细胞系在体外培养中将失去分化特点。因此，预计它们为Flt4mRNA阴性。培养的动脉内皮细胞也无Flt4mRNA。然而，人的微脉管系统、股动脉和脐静脉的内皮细胞中也获得了信号。因此，Flt4表达的特异性在细胞培养中至少保留了部分。
成人组织的原位杂交分析证实了在发育的小鼠胚胎中见到的Flt4限定于淋巴系统的现象。在人淋巴结的淋巴内皮和窦中发现Flt4表达。有趣的是部分HEVs也为Flt4阳性，它们具有方状内皮，在白细胞到淋巴结的运输中起作用。而且，平行杂交分析表明，与正常淋巴结相比，在转移性淋巴结的这些结构中Flt4mRNA水平增加。Flt4在淋巴管瘤中也非常明显，所述淋巴管瘤为良性肿瘤，其由结缔组织基质和正生长的内皮状排列的淋巴管道组成。Flt4mRNA被限定于这些肿瘤的淋巴管内皮中，而且在其动脉、静脉和毛细血管中缺乏。在人肺中，仅淋巴结构被鉴定为Flt4阳性脉管。
上述的结果表明Flt4是成人组织中淋巴管和一些高内皮小静脉的新标记物。这些结果还支持淋巴管起源于静脉的理论。作为生长因子受体，Flt4可能参与这些脉管的分化和功能。在1996年8月1日提交的PCT/FI96/00427(国际公开号WO97/05250)中提供了Flt4与Flt4配体(VEGF-C)所介导的生物效应的详细特征。
根据这些结果，以及本发明的Flt4结合化合物，可以选择性标记淋巴内皮，尤其可利用与放射活性、电子密度或其它可视受体物质偶联的本发明抗体。可向淋巴系统中注射含有诱导Flt4受体内在化的单克隆抗体或配体的物质，并因此将指定分子导入淋巴内皮中。还可用本发明的Flt4结合化合物检测高内皮小静脉，尤其是Flt4受体表达水平增高的活化HEV。据我们了解，目前针对淋巴管内皮尚无如此特异性的标记物。
以下实施例仅为举例说明本发明，并非对发明范围的限制。
实施例1编码Flt4的cDNA克隆的分离及鉴定材料和方法以oligo-dT为引物，在噬菌体λgtll中的人HEL细胞cDNA文库[Mortimer Poncz博士惠赠，费城儿童医院；Poncz等，血液，69219-223(1987)]用来自相同文库的经过PCR扩增的cDNA片段进行筛选[Aprelikova等，癌症研究，52746-748(1992)]。按[Sambrook等，分子克隆-实验室指南，冷泉港实验室出版社(1989)]中叙述的方法，鉴定并纯化阳性噬菌斑。分离λ噬菌体的cDNA插入子作为EcoRI片段并将其亚克隆到GEM3Zf(+)质粒(Promega)。分离完整的Flt4蛋白编码区域。根据所获序列设计寡核苷酸引物，用于经双脱氧链终止法对从HEL-文库中分离的三个重叠克隆(如图1所示)测序。对所述cDNA两条链的所有部分均进行测序。用GCG软件包进行序列分析[Devereux等，核酸研究，12387-395(1984)和Prosite programs forApple MacIntosh]。
图1A为所分析的Flt4cDNA克隆的结构示意图。箭头表示亚克隆的限制性片段(其单位为kb)，其用于探测图1B所示的Northern印迹。E＝EcoRI位点，S＝SphI位点。图1B为用图1A所示探针对DAMI和HEL白血病细胞RNA的Northern杂交分析。
结果通过PCR克隆法从HEL细胞cDNA文库中分离的210bp长Flt4cDNA片段被用作分子探针以筛选oligo-dT为引物的人红白血病cDNA文库。
对克隆子的核酸序列分析揭示了包含1298个氨基酸残基的一个开放阅读框架(SEQ ID NO2，图2)。在图中标出的翻译起始点甲硫氨酸被一个常见的保守序列[Kozak，核酸研究，12857-872(1984)]包围并且其后跟着一个疏水性氨基酸序列，该序列具有转位到内质网的信号序列的特征。
Flt4的胞外结构域可以排列成7个免疫球蛋白样环(图2)。此图还给出了Flt4与结构非常相似的Flt1的比较。Flt1的氨基酸序列见SEQ ID NO5所示。
氨基酸775-798构成序列的疏水性区域，其功能可能是作为受体的跨膜结构域，其后跟着若干碱性残基，它们位于所述序列的推测细胞质侧。酪氨酸激酶同源序列始于氨基酸842处，它前面为44个残基的近膜结构域。一段65个氨基酸的激酶插入片段使同源序列在所述受体羧基端的1175氨基酸处首次中断同源性。在氨基酸序列数据库(Swissprot & NBRF)中对相关酪氨酸激酶结构域的搜索发现，Flt4和PDGRB酪氨酸激酶在催化性酪氨酸激酶结构域中分别具有约80％和60％的同源性。
实施例2抗Flt4抗血清的制备将657 bp EcoRI片段(其编码预测的Flt4短形式的C末端)与谷胱甘肽-S-转移酶编码区克隆到pGEX-1λT细菌表达载体中的同一阅读框架内，以便在大肠杆菌中产生GST-Flt4融合蛋白。所得融合蛋白在细菌中产生，并且按说明书用谷胱甘肽亲和层析法纯化。用此蛋白免疫家兔以制备抗Flt4多克隆抗体。在第三次加强免疫后，取抗血清备用。
实施例3COS细胞中Flt4的表达材料和方法将全长Flt4蛋白编码序列(由3个克隆组合而成，图1)插入SVpoly哺乳动物表达载体[Stacey等，核酸研究，182829(1990)]构建体SV14-2的HindIII-BamHI位点。通过DEAE-葡聚糖转染法[McCutchan等，J.Natl.CancerInst，41351-357(1968)]，将表达载体(短SV-FLT4和长SV-FLT4，包括相应形式的Flt4 cDNA)导入COS细胞。在转染两天后，用磷酸缓中液(PBS)洗涤细胞并将其刮到免疫沉淀缓中液中(10mM Tris pH7.5，50mM NaCl，0.5％去氧胆酸钠，0.5％Nonidet P40，0.1％SDS，0.1 TIU/ml抑酶肽)。超声处理细胞裂解物，10000×g离心15分钟并与3ml抗血清在冰上保温过夜。加入蛋白A sepharose并继续旋转保温30分钟。在SDS-PAGE分析之前，用免疫沉淀缓冲液洗涤沉淀物四次，用PBS和水各洗涤一次。
结果通过将全长Flt4短及长形式蛋白编码区克隆到pSVpoly表达载体的HindIII-BamHI位点并将这些表达载体转染到COS细胞中，检测了Flt4cDNA序列的结构预测。通过这两个构建体制备的蛋白在C末端存在差异长形式包含额外的65个氨基酸。在转染两天后，裂解细胞并利用抗GST-Flt4融合蛋白抗体进行免疫沉淀，其中GST-Flt4融合蛋白包括预测的Flt4蛋白短形式的40个羧基末端氨基酸(即Flt4的短形式和长形式共有的部分)。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析免疫沉淀的多肽。免疫前的血清未发现任何特异性条带，而Flt4特异性抗体识别大约170KD和190KD的两条条带。这两条带可以代表Flt4蛋白的不同糖基化形式。
实施例4NIH3T3细胞中Flt4的表达材料和方法将全长Flt4cDNA(短形式)亚克隆至包含Moloney鼠类白血病病毒长末端重复的启动子的LTRpoly载体(见Makela等，基因，118293-294(1994)，其公开了pLTRpoly载体，其ATCC登记号为77109，Genebank登记号为X60280)。此LTR-FLT4表达载体与pSV2neo标记质粒共转染到NIH3T3细胞，分析G418抗性克隆的Flt4表达。
为了进行Western免疫杂交分析，将一个大融合平板上的细胞在2.5％SDS、125mM Tris、pH6.5中裂解。将细胞裂解物在SDS-PAGE上进行电泳并电转到硝酸纤维素膜上。将此膜与抗Flt4羧基末端肽的抗血清一起保温，用偶联辣根过氧化物酶的猪抗兔抗血清(Dako)和ECL试剂(Amersham)使结合的抗体显色。为了对代谢进行标记，用100μCi/ml35S-甲硫氨酸标记所述培养物1小时。标记之后，洗涤细胞两次并在其生长培养基中温育1或2小时，裂解细胞，用抗Flt4抗体进行免疫沉淀，并且通过SDS-PAGE和荧光自显影进行分析。
结果在Flt4短形式转染的NIH3T3细胞中可以检测到170KD和190KD多肽，而在仅转染pSV2neo的细胞中则未检测到。除了这两条带，在产生Flt4的克隆中发现了约120Kd的一条明显带。代谢标记和脉冲追踪实验表明此蛋白短形式Flt4多肽翻译后加工的产物。
实施例5 Flt4基因座的染色体定位因为已发现一些III类受体基因簇，故确定Flt4的染色体位置非常重要。因此分析了啮齿类动物-人类细胞的杂交细胞，表明Flt4连锁于人的5号染色体。
利用携带部分染色体5s的杂交细胞确定Flt4基因位于5q33-＞5qter区。通过膜杂交检测这些杂交细胞是否存在Flt4基因座。Flt4阳性杂交细胞共有而在Flt4阴性杂交细胞中缺陷的5号染色体区域是5q33.1-qer。因此杂交细胞中人类染色体5q33-qer的存在与Flt4序列的存在相关。所述区域定位结果表明Flt4基因座与CSGlR/血小板衍生生长因子受体β(PDGFRB)基因座以及β肾上腺素能受体(ADRBR)基因座相对应(is telomeric to)，因为这些基因座在Flt4阴性的杂交细胞GBl3中均存在。
实施例6肿瘤细胞系和内皮细胞中Flt4mRNA的表达在本研究中应用的白血病细胞系在几个以前的出版物中已经报道，即K562[Lozzio等，血液，45321-334(1975)]，HL-60[Collins等，自然，270347-349(1977)]，HEL[Martin等，科学，2161233-1235(1982)]，DAMI[Greenberg等，血液，721968-1977(1988)]，MOLT-4[Minowada等，J Nalt Cancer Inst，49891-895(1972)]，Jurkat[Schwenk等，Blut，31299-306(1975)]，U937[Sundstrom等，国际癌症杂志，17565-577(1976)]，KG-1[Koeffler等，科学，2001153-1154(1978)]，JOK-1[Aandersson等，1982，在R.F.Revoltella(编)，肿瘤细胞中分化功能的表达，239-245，Raven出版社，纽约]和ML-2[Gahmberg等，1985，在L.C.Andersson等(编.)，正常分化和恶性分化期间的基因表达，107-123，Academic出版社，伦敦]。还分析了从美国典型培养物保藏中心获得的下述肿瘤细胞系JEG-3绒毛膜癌；A204横纹肌肉瘤；SK-NEP-1肾母细胞瘤；BT-474乳腺癌；Y79视网膜母细胞瘤。在含10％胎牛血清(FCS)和抗生素的RPMI培养基中培养所述白血病细胞。在含10％马血清的Iscove′s改良型DMEM培养基中培养Dami细胞。在含10％FCS和抗生素的DMEM-HAT培养基中，培养由原代人脐静脉内皮细胞与A549肺癌细胞融合获得的永生化内皮杂交细胞[Edgell等，美国国家科学院院报，503734-3737(1983)]。
按报道的方法[Sambrook等，见上述]从所述细胞系提取Poly(A)+RNA。取5μg Poly(A)+RNA在含甲醛的琼脂糖凝胶中进行电泳，并在标准条件[sambrook等，见上述]下进行印迹。用随机引物法标记Flt4cDNA克隆的插入片段并且与上述印迹进行杂交。在下述溶液中42℃杂交18-24小时，即含50％甲酰胺、5X Denhardt′s溶液(100X Denhardt′s溶液为Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白各2％)、5X SSPE(3M NaCl，200mM NaH2PO4·H2O，20mM EDTA，pH7.0)、0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)和0.1mg/ml超声处理的鲑精DNA的溶液。在1X SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)、0.1％SDS中65℃洗涤杂交膜并于Kodak XAR-5胶片上曝光。
用从8个白血病细胞系(HEL、K562、DAMI、U937、MOLT4、HL60、Jurkat和KG-1)和内皮杂交细胞系(EAhy926)中提取的Poly(A)+RNA进行Northern分析。用与GAPDH探针的杂交作为内对照，用来分析RNA平均上样量。只有HEL红白血病细胞和DAMI成巨核细胞白血病的细胞表达5.8kb和4.5kb的Flt4mRNA。在K562红白血病、Jurkat和MOLT-4T细胞白血病以及HL-60前髓细胞白血病、U937单核细胞白血病和KG-1髓样白血病的细胞中Flt4 mRNA为阴性。
用从5个肿瘤细胞系(JEG-3、A-204、SK-NEP-1、BT-474和Y79)和两个上述的白血病细胞系(JOK-1、MOLT4)中提取的Poly(A)+RNA进行Northern分析。用标记的S2.5cDNA克隆作为杂交探针。用与β-肌动蛋白探针的杂交作为内对照，用来分析RNA平均上样量。发现只有SK-NEP-1肾母细胞瘤和Y79视网膜母细胞瘤中有Flt4转录。
用载体(vehicle)(-)或视黄酸(+)处理以诱导神经元分化，10天后分析了Tera-2畸胎瘤细胞[Thompson等，细胞科学杂志，7237-64(1984)]。在从所述细胞中分离的Poly(A)+RNA的Northern杂交中发现未分化细胞表达5.8kb和4.7kb的Flt4mRNA，但是10天分化之后，在Northern印迹和杂交中不能检测到Flt4mRNA。这些结果说明在这些细胞分化期间Flt4下调。
还分析了未分化和TPA诱导分化的HEL细胞的Flt4mRNA表达。HEL和DAMI细胞系均拥有红细胞/成巨核细胞双表型，并且通过用肿瘤促进剂12-O-四葵酰佛波醇-13乙酸酯(TPA)处理可以进一步表达成巨核细胞标记物。我们分析了在这些细胞分化期间Flt4表达是否受到刺激。在用TPA或用来溶解TPA的DMSO处理2天后，分析了HEL细胞。在剥离Flt4信号后，用Rb-1和β-肌动蛋白cDNA探针进行杂交，来证实泳道的平均负载。根据放射自显影光密度扫描分析并针对GAPDH基因组成型表达进行标准化之后，确定当在TPA诱导的HEL细胞进行成巨核细胞分化时其Flt4mRNA水平增加约3.4倍。
实施例7胚肺中Flt4的表达原位杂交在大学中心医院和芬兰Turku大学的联合伦理委员会的许可下，得到15周龄人胚肺组织。用10％甲醛将样品4℃固定18小时，脱水，石蜡包埋，切为6μm切片。用SP6和T7聚合酶及[35S]-UTP从线性化质粒DNA中制备206和157个碱基(反义和正义)的RNA探针。根据Wilkinson等，发育，99493-500(1987)；Wilkinson，细胞，5079-88(1987)中的万法进行切片原位杂交，有如下的修改1)在石蜡包埋前应用二甲苯而不是甲苯；2)将切为6μm的切片放置在用2％3-氨基丙基-三乙氧基硅烷(Sigma)预处理的玻片表面上的二乙基焦碳酸酯处理的水层上；3)省略对探针的碱性水解步骤；4)杂交混合物包括60％去离子甲酰胺；5)在含50mM DTT和1X SSC的溶液中65℃高严谨度洗涤80分钟；6)用NTB2-乳剂(Kodak)覆盖切片并在4℃保存。在暴露14天后，将所述玻片在Kodak D-19显色剂中显色2.5分钟并用Unifix固定5分钟。将切片用苏木精在水中染色。
在所述利用反义探针的杂交研究中，主要在15周龄胚肺的某些内皮细胞中发现Flt4mRNA。在用正义链探针和RNA酶A处理的切片进行的对照杂交实验中未产生超出上述背景的信号。
对于免疫过氧化酶染色，应用了1∶100稀释的抗Flt4抗体，过氧化酶偶联的猪抗兔抗体和本领域中应用的标准方法。用免疫前血清或免疫原封闭的血清进行的对照染色没有信号。分析了17周龄胚肺组织，结果与mRNA原位杂交的实验结果一致肺的某些大血管内皮兔抗Flt4抗血清染色为阳性。
实施例8在非人类哺乳动物中鉴定Flt4基因图4中给出了在不同物种DNA中检测Flt4序列的实验结果。为了揭示Flt4基因在进化中的较高保守程度，将2.5kb cDNA片段(见图1)与从不同动物和酵母中纯化并用EcoR I消化的染色体DNA进行杂交。杂交溶液包括50％甲酰胺、5X Denhardt′s溶液(100X Denhardt′s溶液为Ficoll、聚乙烯吡咯烷酮和牛血清白蛋白各2％)、5X生理盐水-磷酸钠-EDTA(3M NaCl，200mM Na2PO4H2O，20mM EDTA，pH7.0)、0.1％SDS(十二烷基磺酸钠)和0.1mg/ml超声处理的鲑精DNA。在42℃杂交24小时。在1X标准柠檬酸盐(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)、0.1％SDS中65℃洗涤杂交膜并于Kodalk XAR-5胶片上曝光。在猴、大鼠、小鼠、狗、牛、兔、和鸡DNA中观察到特异性条带，但在酵母中没有信号。曾经从鹌鹑中分离了Flt4cDNA。见Eichmann等，基因，174(1)3-8(1996年9月26日)，其Genebank登记号为X83827。
实施例9成人组织中Flt4基因的表达通过用2微克来自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾和胰腺组织的poly(A)+RNA与Flt4cDNA探针杂交，分析了成人组织中Flt4mRNA的表达(多组织Northern印迹，Clontech Inc)。与组成型表达基因的探针进行的对照杂交给出各泳道的平均上样量。
各种人组织的poly(A)+RNA与Flt4cDNA探针的杂交显示在胎盘、肺、心和肾组织中有5.8和4.5kb移动性mRNA带和6.2kb弱标记条带。在肝脏和骨骼肌组织中见到模糊的mRNA条带，而在胰腺和脑组织中即便有Flt4RNA也极少。
实施例10人胚胎组织中Flt4的表达为了检测人胚胎组织中F1t4mRNA的表达，将包括下列16-19周龄人胚胎组织的总RNA与1.9kb Flt4cDNA片段进行Northern杂交(见图1)，并将得到的放射自显影照片用密度仅进行扫描。用从相应溴乙啶(EtBr)染色的凝胶UV照片中估计的RNA量将结果标化。下述符号代表mRNA水平依次递增-、+、++ +++。
表1胚胎组织 MRNA脑脑脊膜 +皮质板 ++中间带 +++室管膜带+小脑++脉络丛 +肝 +胰腺 +小肠 -心脏 +肺 +++肾 ++肾上腺 ++皮肤 ++脾脏 +++胸腺 -人胚胎组织的分析表明除了胸腺和小肠，所有组织均有Flt4转录。肺和脾中表达水平最高。
实施例11 Flt4表达载体通过下述步骤制备全长Flt4cDNA(短形式)a)利用两个SphI位点将SphI切割的Flt4cDNA片段[用引物寡核苷酸5′-ACATGCATGCCACCATGCAGCGGGGCGCCGCGCTGTGCCTGCGACTGTGGCTCTGCCTGG GACTCCTGGA-3′(SEQ ID NO.7)(正向引物)和5′-ACATGCATGC CCCGCCGGT CATCC-3′(反向引物)(SEQ ID N0.8)从S2.5kb克隆(见图1)中扩增]连接到已亚克隆到pSP73载体(Promega)的S2.5kb片段的5′末端；b)用寡核苷酸引物5′-CGGAATTCCC CATGACCCCA AC-3′(SEQ ID NO.9)(正向)和5′-CCATCGATGG ATCCTACCTG AAGCCGCTTTCTT-3′(SEQ ID NO.10)(反向)从0.6kb EcoRI片段(图1)中PCR扩增最后138bp的片段，利用EcoRI和BamHI位点将此PCR片段连接到构建体a)的3’末端；c)在构建体b)的EcoRI位点连接1.2kb EcoRI片段；d)将所得全长HindIII-BamHI片段连接入HindIII-BamHI切割的SV-poly表达载体[Stacey等，核酸研究，182829(1990)]。
实施例12 Flt4配体的鉴定将PC-3前列腺腺癌细胞系(ATCC CRL 1435)在无胎牛血清(FBS)的F12培养基中培养7天，将由此得到的条件培养物16000×g离心20分钟，使其变清，并且对其诱导Flt4酪氨酸磷酸化的能力进行筛选。
将重组表达Flt4的NIH3T3细胞(见实施例13)再种植于直径为5cm的细胞培养皿中，并且在含10％胎牛血清和抗生素的Dulbecco’改良型最低基本培养基(DMEM)中培养至融合。用磷酸缓冲液(PBS)将融合的细胞洗涤2次，并且在DMEM/0.2％牛血清白蛋白中饥饿培养过夜。为激活细胞，用1ml所述条件培养物取代饥饿培养基，并且将所述细胞37℃温育5分钟。
用PC-3条件培养物刺激后，将含有细胞的培养皿置于冰上，用Tris-HClpH7.4，含100mM NaVO4的150mM NaCl洗涤两次。除去培养皿中洗涤液，在含抑酶肽、1mM PMSF和1mM NaVO4的RIPA缓冲液[10mM Tris-HCl pH7.5，50mM NaCl，0.5％去氧胆酸钠，0.5％Nonidet P40，0.1％十二烷基磺酸钠(SDS)]中裂解细胞，将细胞裂解物超声10秒，进行两次。然后将裂解物16000×g离心30分钟，将上清转入新试管中，用于免疫沉淀。
抗Flt4 C-末端(见上述)的多克隆抗体被用于免疫沉淀。将细胞裂解物上清与2-4μl兔多克隆抗Flt4抗血清在冰上保温2小时。加入50％(体积/体积)的蛋白A-Sepharose(Pharmacia)之PBS溶液约30μl，4℃旋转保温45分钟。免疫沉淀物用RIPA洗涤3次，用PBS洗涤1次。
然后将免疫沉淀沉淀物在7.5％的凝胶中进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并印迹至硝酸纤维素膜上。将这些Western印迹与单克隆抗磷酸酪氨酸(anti-P-Tyr)抗体(1∶2000稀释的PT-66 Sigma，目录号P-3300)进行温育，随后利用化学发光检测系统(Amersham)，用过氧化物酶结合的兔抗小鼠抗体进行检测。有时，将印迹膜在含100mM 2-巯基乙醇、2％SDS、62.5mM Tris-HCl pH6.7的溶液于50℃放置30分钟并偶而搅动，以彻底去掉印迹膜此前所带的信号，用抗Flt4抗体(1∶1000稀释)再染色，随后用过氧化物酶结合的猪抗兔抗体(1∶1000稀释，Dako，P217)进行染色。将表达Flt4的NIH3T3细胞用100mM酪氨酰磷酸酶抑制剂过钒酸钠(PerVO4)处理20分钟，然后获取该细胞的抗-Flt4免疫沉淀物，作为Flt4酪氨酸磷酸化的阳性对照。用过钒酸钠对细胞的处理通过下述方法进行，即向细胞培养基中加入100mM(终浓度)正钒酸钠和2mM(终浓度)过氧化氢，并将所述细胞在37℃5％CO2温育20分钟。此步骤导致产生钒酸盐的过氧化形式(氧钒基氢过氧化物)，其在活细胞中是蛋白质酪氨酸磷酸酶的强效抑制剂。
PC-3条件培养物刺激120KD多肽的酪氨酸磷酸化，该多肽与Flt4的酪氨酸磷酸化、加工成熟的形式共迁移。用抗Flt4抗体再次染色该印迹可证实共迁移。
为了证实120KD多肽不是所述条件培养液的非特异性组分，将15ml条件培养基通过SDS-PAGE分离，印迹在硝酸纤维素膜上，并用抗P-Tyr抗体将所述印迹染色。检测了几个多肽，无一与Flt4共迁移，表明所述120KD带的确是从激活细胞中免疫沉淀的酪氨酸磷酸化蛋白。对在室温下用肝素-Sepharose CL-6B(Pharmacia)预处理2小时的PC-3条件培养基(第3泳道)的刺激进行的分析表明Flt4配体不与肝素结合。
非条件培养基不诱导Flt4自我磷酸化。另外，非转染NIH3T3细胞或FGFR-4转染的NIH3T3细胞用PC-3细胞条件培养基刺激均不表现120KD多肽的酪氨酸磷酸化。当将PC-3条件培养用Centricon-10浓缩器(Amicon)浓缩4倍时，刺激活性显著增加。还有，通过浓缩获得的包含分子量小于10000(＜10000)的蛋白的流出液不激活Flt4的磷酸化。用与CNBr-活化的Sepharose(1mg/ml)偶联的Flt4胞外结构域(Flt4EC-6xHis，见下)50ml按说明书预处理浓缩的PC-3细胞条件培养基，可完全消除Flt4的酪氨酸磷酸化。用SepharoseCL-4B对条件培养基进行类似预处理不影响其刺激活性。
这些资料证实PC-3细胞产生可溶性Flt4配体。上述实验证实所述配体与重组Flt4EC结构域结合。因此，该配体可以在亲和层析中利用重组Flt4EC结构域进行纯化。可以将该纯化蛋白在SDS-PAGE中进行电泳，印迹到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，并且可以用本领域的标准方法测定其氨基末端序列。或者，将所述纯化的配体消化成肽，用于氨基末端序列测定。从纯化蛋白中获得的肽序列被用于合成编码这些序列的寡核苷酸混合物。可以将这些寡核苷酸及其互补DNA链进行放射性标记，并且将其用于筛选由PC-3细胞制备的cDNA文库，以获得编码所述配体的cDNA，所用的所有方法均为本领域的标准方法(Wen等，细胞69559-572(1992))。或者，这些寡核苷酸及其互补链作为聚合酶链式反应(PCR)的引物，以由PC-3细胞RNA制备的cDNA为模板扩增编码配体的序列。这些用于cDNA合成和PCR(RT-PCR)的方法为本领域中的标准方法(Innis等，1990，PCR方案，Academic Press；McPherson M.J.等，1991，PCR，实用方法，IRL出版社；Partanen等，美国国家科学院院刊，878913-8917(1990))。还有另一个选择是通过利用克隆到真核细胞表达载体的cDNA(例如应用Invitrogen Librarian克隆试剂盒及其提供的载体，如pcDNAI和pcDNAIII)，从PC-3细胞中克隆所述Flt4配体，用FIt4碱性磷酸酶(Cheng和Flanagan，细胞，79157-168(1994))、Flt4免疫球蛋白(Flt4-Ig)(Lyman等，细胞，751157-1167(1993))或类似亲和试剂，筛选这些转染入例如COS细胞的文库，所用的方法为本领域的标准方法。
实施例13 细胞系和转染在含10％FCS的DMEM培养基中培养NIH3T3细胞和293-EBNA细胞(Invitrogen)。为了稳定的表达，利用DOTAP转染试剂(Boehringer-Mannheim)通过脂转染方法，用LTR-Flt41载体与pSV-neo载体一同转染NIH3T3细胞，此时Flt4cDNA的表达受Moloney鼠白血病病毒LTR启动子的调控。用DEAE葡聚糖法转染COS-1细胞(McClutchan和Pagano，J.Natl.Cancer Inst，41351-35(1968))。在500mg/ml新霉素中筛选转染细胞。
实施例14 Flt4融合蛋白的构建和表达pVTBac-FLT4EC-6xHis融合构建体对编码Flt4的cDNA的末端作如下修饰扩增编码胞外结构域(EC)的Flt4cDNA序列的3’末端，所用的寡核苷酸为5，-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3’(SEQ ID NO13，下划线为SalI位点，所含序列对应于SEQ ID NO1中核苷酸2184-2204)和5’-CGCGGATCCCTAGTGATGGTGATGGTGATGTCTACCTTCGATCATGCTGCCCTTATCCTC-3’(SEQ ID NO14，下划线为BamHI位点，包括与SEQ ID NO1中核苷酸2341-2324互补的序列)编码与Ni-NTA柱(Qiagen，Hilden，德国)结合的6个组胺酸残基，其后为终止密码子。用SalI和BamHI消化该扩增片段，将其作为SalI-BamHI片段连接入LTR-Flt4l载体(见实施例4)，取代唯一的SalI-BamHI片段，该片段包含编码Flt4跨膜结构域和胞浆结构域的序列。
通过PCR扩增Flt4 cDNA的5’末端，其不含Flt4信号序列编码区，所用的寡核苷酸为5’-CCCAAGCTTGGATCCAAGTGGCTACTCCATGACC-3’(SEQ ID NO11，下划线为HindIII和BamHI位点，包括相应于SEQID NO1的核苷酸86-103的序列)和5’-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3’(SEQ ID NO12，包括与SEQ ID NO1的核苷酸700-681互补的序列)。该扩增片段(其包括SEQ ID NO1的核苷酸86-700)用HindIII和SphI(SphI位点相应于SEQ ID NO1的核苷酸588-593，在Flt4cDNA的扩增区域内)消化。
用所得HindIII-SphI片段取代上面刚刚叙述的修饰型LTR-FLT4l载体中的HindIII-SphI片段(HindIII位点位于Flt4插入片段与载体pLTRpoly部分的5’端连接处内，SphI位点位于Flt4 cDNA之内，相应于SEQ ID NO1的核苷酸588-593)。然后将得到的Flt4EC-6xHis插入片段作为BamHI片段连接至pVTBac质粒的BamHI位点(Tessier等，基因98177-183(1991))。用脂转染法使该构建体与杆状病毒基因组DNA共同转染SF-9细胞。产生重组病毒并将其用于感染High-Five细胞(Invitrogen)Flt4-AP融合构建体扩增Flt4EC结构域编码序列的3’末端，所用寡核苷酸为5’-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3’(SEQ ID NO15)和5’-CGGGATCCCTCCATGCTGCCCTTATCCT-3’(SEQ ID NO16)，将其作为SalI-BamHI片段连接至LTR-TLF4l载体，取代编码跨膜结构域和胞浆结构域的序列。然后将所得插入片段作为HindIII-BamHI片段连接至APtag-1质粒的HindIII-BglII位点，使其与碱性磷酸酶编码区在同一阅读框架内(Flanagan和Leder，1990，细胞63185-194)。利用DOTAP转染试剂(Boehringer)，通过脂转染法用此Flt4-AP构建体和pSV2neo共转染NIH3T3细胞(Southern和Berg，J.Mo1.Appl.Genet 1327-341(1982))，在有500mg/ml新霉素的条件下筛选转染细胞。产生在培养液中的重组蛋白用针对碱性磷酸酶活性的比色反应进行检测(Cheng & Flanagan，细胞79157-168(1994))。
Flt4-Ig构建体编码Flt4-免疫球蛋白嵌合体的重组DNA按如下方法构建。通过PCR扩增编码Flt4(包括编码信号序列的Flt4核苷酸)的cDNA的5’末端，所用引物为5’-GGCAAGCTTGAATTCGCCACCATGCAGCGGGGCGCC-3’(SEQ ID NO17)和5’-GTTGCCTGTGATGTGCACCA-3’(SEQ IDNO18)，将其作为HindIII-SphI片段连接至LTR-FLT4l载体。扩增Flt4EC编码区的3’末端，所用寡核苷酸为5’-CTGGAGTCGACTTGGCGGACT-3’(SEQ ID NO19)和5’-CGCGGATCCAAGCTTACTTACCTTCCATGCTGCCCTTATCCTCG-3’(SEQ ID NO20)，将其作为SalI-BamHI片段连接至LTR-FLT41载体，取代编码跨膜结构域和胞浆结构域的序列。将此包含剪接共体位点的Flt4EC插入片段首先连接至pHγCE2，其包含编码人免疫球蛋白重链铰链区的外显子以及恒定区外显子(Karjalainen K.，TIBTECH，9109-113(1991))。含Flt4-Ig嵌合体的EcoRI-BamHI插入片段再用本领域的标准方法(Klenow)钝化，并且与pREP7内钝化的HindIII位点连接。利用磷酸钙沉淀法将此构建体转染至293-EBNA细胞，用所述条件培养基经蛋白A-Sepharose亲和层析来分离Flt4-Ig蛋白。
实施例15-17 Flt4配体的纯化及测序用Centriprep过滤盒将由PC-3细胞在无血清培养条件下产生的细胞培养液上清浓缩30-50倍，上样于固相Flt4胞外结构域的柱上。利用两种可选择的构建体和方法制备两种亲和基质。在第一种情况中，将Flt4EC-6xHis融合蛋白与CNBr-激活的Sepharose 4B(Pharmacia)交联，而在第二种情况中，利用二甲基庚二酸酯(dimethylpimelidate)将Flt4-Ig融合蛋白与蛋白ASepharose结合(Schneider等，1982，生物化学杂志，25710766-10769)。从亲和柱中洗脱的物质被进一步纯化，所用方法有离子交换层析、反向高效层析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。检测层析级分刺激Flt4的酪氨酸磷酸化的能力。对纯化的具有生物活性的配体蛋白进行显微测序，并且根据获得的氨基酸序列制备简并的寡核苷酸，用于分离和克隆编码配体的cDNA；例如，从由PC-3细胞中分离的poly(A)+RNA制备的cDNA文库中分离和克隆。
命名为血管内皮生长因子C(VEGF-C)的Flt4配体，以及天然人、非人类哺乳动物、和禽类的编码VEGF-C、VEGF-C变体和其类似物的多核苷酸序列的详细特点公开于PCT/US98/01973，1998年2月2日提交(1998年8月6日公开，国际公开号为WO98/33917)；Joukov等，生物化学杂志，273(12)6599-6602(1998)；Joukov等，EMBO J，16(13)3898-3911(1997)；和PCT/F196/00427，1996年8月1日提交(国际专利公开号为WO97/05250)，所有均全文引入本文作为参考。如上述文献所详述，在人的细胞中最初产生的人VEGF-C是419个氨基酸的前原-VEGF-C多肽。人前原-VEGF-C多肽的氨基酸序列见SEQ ID NO21所示，并且根据Budapest条约的条款，已将编码人VEGF-C的cDNA保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd，Manassas，VA 20110-2209(美国)(保存日期为1995年7月24日，ATCC登记号为97231)。其它物种的VEGF-C序列也已经被报道。例如见Genebank登记号MMU73620(鼠骨骼肌)和CCY15837(鹌鹑Coturnix coturnix)，在此引入本文作为参考。
前原-VEGF-C多肽经多步骤加工产生约21-23KD(在还原条件下通过SDS-PAGE估测)的成熟且活性最强的VEGF-C多肽。此加工过程包括剪切信号肽(SEQ ID NO21，残基1-31)；剪切羧基末端肽(对应于大约SEQ IDNO21的氨基酸228-419，并具有类似于Balbiani环3蛋白(BR3P)序列[Dignam等，基因，88133-40(1990)；Paulsson等，生物化学杂志，211331-49(1990)]的间隔的半胱氨酸残基模式)以产生29KD的部分加工形式；(主要在细胞外)剪切氨基端肽(对应于大约SEQ ID NO21的氨基酸32-103)以产生约21-23KD的完全加工的成熟形式。实验证据证实VEGF-C的部分加工形式(例如29KD形式)可以与Flt4(VEGFR-3)受体结合，然而只有VEGF-C的完全加工形式与VEGFR-2发生高亲和性结合。这表明VEGF-C多肽天然地连接成非二硫键连接的二聚体。
而且，已经证实SEQ ID NO2的氨基酸103-227对维持VEGF-C的功能并非都是关键的。由SEQ ID NO2的氨基酸113-213(缺少残基103-112和214-227)组成的多肽仍然保留结合并激活VEGF-C受体的能力，并且预计跨越约131位残基到约211位残基的多肽仍将保留VEGF-C的生物活性。已经表明156位上的半胱氨酸对于VEGFR-2的结合活性非常重要。然而，VEGF-C△C156多肽(即由于缺失或替代而缺少此半胱氨酸的类似物)仍然是VEGFR-3的有效激活剂。SEQ ID NO2的165位半胱氨酸对于与任何一个受体结合是必需的，然而缺少83或137位半胱氨酸的类似物与天然VEGF-C竞争结合这两个受体并激活这两个受体。
人VEGF-C与其它物种VEGF-C的序列比对(应用任何通常被接受的算法进行)表明存在额外的残基，其中引入了并没有破坏VEGF-C生物活性的变化(例如插入、替代和/或缺失)。在两个或更多物种的VEGF-C多肽的对比中存在不同氨基酸的任何位点，尤其是具有不同化学特性的侧链的不同氨基酸的位点，很可能是易于改变并且不拌有功能消失的位点。在PCT/US98/01973的图5中给出了人、鼠和鹌鹑VEGF-C的比对实例。
除上述的考虑之外，应该理解可以对野生型VEGF-C序列进行无数的保守氨基酸替代，尤其是如果此替代数目不大时，其很可能会获得仍具有VEGF-C生物活性的多肽。“保守氨基酸替代”是指用具有相似化学特性之侧链的氨基酸进行的氨基酸替代。用于保守氨基酸替代的相似氨基酸包括具有酸性侧链的氨基酸(谷氨酸，天冬氨酸)；具有碱性侧链的氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组胺酸)；具有极性酰胺侧链的氨基酸(谷胺酰胺、天冬酰胺)；具有疏水性脂肪族侧链的氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、甘氨酸)；或具有芳香族侧链的氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)；具有小侧链的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸)；或具有脂肪族羟基侧链的氨基酸(丝氨酸、苏氨酸)。还考虑了增加或去掉一个或几个内部氨基酸而不破坏VEGF-C生物活性。
从上述中应该理解许多VEGF-C多肽及其变体将与Flt4(VEGFR-3)以高亲和力结合，并且因此在本发明一些方面中被用作Flt4结合化合物，这些本发明的方面涉及利用Flt4结合化合物显像或筛查组织样品。特殊的目的是包含变化的VEGF-C形式，其降低或消除VEGFR-2结合亲和力，而得到的多肽对VEGFR-3的结合特异性增加。如上所述，这样的变化包括去除或取代基本上消除VEGFR-3结合亲和力的Cys156，或改变破坏天然前原-VEGF-C-蛋白裂解位点的氨基酸序列(因为VEGFR2对完全加工型VEGF-C的亲和力最高)。另外，经过修饰仍具有Flt4结合亲和力但不能激活Flt4自我磷酸化的VEGF-C分子在本文叙述的治疗方法中是有用的Flt4拮抗剂。从上述介绍中应该进一步清楚本文中所述Flt4配体可以用于检测，以其作为附加的指征来证实人Flt4等位基因变体的同一性，并且证实在本文中介绍的与Flt4序列同源的非人基因序列实际上是Flt4的非人类对应物。推导的前原VEGF-C氨基酸序列见SEQ ID NO21所示。
命名为血管内皮生长因子D(VEGF-D)的第二个Flt4配体以及编码VEGF-D、VEGF-D变体及其类似物的人类多核苷酸序列详述于PCT/US97/14696，1997年8月21日提交并于1998年2月26日公开为WO98/7832；Achen等，美国国家科学院院刊95(2)548-553(1998)，在此引入本文作为参考。如上述文献所详述，在人的细胞中最初产生的人VEGF-D是354个氨基酸的前原-VEGF-D多肽。前原VEGF-D的cDNA和推导的氨基酸序列见SEQ ID NO22所示。其它物种的VEGF-D序列也已经报道。例如见Genebank登记号D89628(鼠骨骼肌)；和AF014827(褐家鼠)，在此引入本文作为参考。
所述前原VEGF-D多肽具有21个氨基酸的假定信号肽，似乎其蛋白裂解式加工方式类似于前原VEGF-C的。“重组的成熟”VEGF-D缺乏SEQ IDNO22D 1-92残基和202-354残基，它保留活化VEGFR-2和VEGFR-3受体的能力，且很可能形成非共价连接的二聚体。VEGF-D多肽作为本发明Flt4结合化合物的应用类似于VEGF-C的那些。同样，预计对VEGF-D的类似修改(以除去VEGF同源性结构域中8个保守的半胱氨酸中的第二个Cys136，或除去蛋白裂解位点)将产生如下多肽，其VEGFR-2结合亲和力已降低或消除，并因此使Flt4特异性增强。已经过修改而保留了Flt4结合亲和力但不能激活Flt4自我磷酸化的VEGF-D分子是本文所述方法的有效Flt4拮抗剂。
实施例18小鼠Flt4 cDNA探针的克隆用上述覆盖胞外结构域的S2.5人Flt4受体cDNA片段筛选129SV小鼠λFIXII基因组文库(Stratagene)的大约106个噬菌斑。另见Pajusola等，癌症研究，525738(1992)。从阳性噬菌斑中亚克隆2.5kb BamHI片段并测定其两端的序列。从这个亚克隆中应用PCR扩增包括小鼠Flt4cDNA序列之核苷酸1745-2049的外显子片段，并将其克隆到pBluescript KSII+/-载体(Stratagene)。见Finnerty等，癌基因，82293(1993)。
用相似的方法克隆包括核苷酸1-192的第二个片段。
实施例19小鼠组织中Flt4mRNA的分析根据Chomczynski等，Anal Biochem 162156(1987)的方法，从发育中的胚胎(交配后8-18天和1日龄的小鼠)分离总RNA。交配后8天的胚胎的样品还包括胎盘。
对于RNA酶保护分析，利用[32P]-UTP和T7聚合酶针对从实施例18获得的线性化鼠Flt4质粒制备反义RNA探针。应用β-肌动蛋白探针，其对应于公开的小鼠β-肌动蛋白序列的核苷酸1187-1279。见Tokunaga等，核酸研究，141829(1986)。在6％聚丙烯酰胺/7M尿素凝胶上纯化之后，将标记的转录本与30μg总RNA在52℃杂交过夜。将未杂交的RNA用RNA酶A(10U/ml)和T1(1mg/ml)在37℃ pH7.5条件下消化1小时。通过蛋白酶K37℃消化15分钟灭活RNA酶，并且将样品在6％聚丙烯酰胺/7M尿素凝胶上进行分析。
在这个实验中分析的Flt4表达模式表明从肺、肝脏、心脏、肾脏、骨骼肌和脾脏获得的mRNA信号很弱，而在睾丸和脑组织中显然无特异性信号。通过RNA酶保护试验对在小鼠不同发育阶段收集的一系列RNA进行的分析表明在从交配后8天到新生小鼠的整个胚胎发育期间，Flt4mRNA均表达，并且信号强度无大的变化。
实施例20 小鼠胚胎中Flt4的原位杂交为了更好的确定细胞和组织中的Flt4转录本，将交配后7.5天和8.5天的小鼠胚胎的切片与标记的Flt4RNA进行杂交。小鼠胚胎来源于CBA和NMRJ小鼠的交配。通过颈脱臼处死怀孕小鼠，并将胚胎立即冰冻保存或通过磷酸盐缓冲液转入4％多聚甲醛中。将所述胚胎和分离的小鼠器官4℃固定18小时，脱水，石蜡包埋并切割成6μm的切片。
用[35S]-UTP从线性化的质粒中制备192个和305个核苷酸(见实施例18)的RNA探针(反义和正义)。根据下述方法进行切片原位杂交，所述方法为Wilkinson等，发育，99493(1987)；Wilkinson等，细胞，5079(1987)(在此引入本文作为参考)中介绍的方法，并进行了如下了修改1)在石蜡包埋前应用二甲苯而不是甲苯；2)将切为6μm的切片放置在用2％3-三乙氧基甲硅烷基丙胺预处理的玻片表面用二乙基焦碳酸酯处理的水层上；3)省略探针的碱性水解步骤；4)在含30mM DTT和1X SSC的溶液中65℃高严谨度洗涤80分钟。用NTB-2乳剂(Kodak)覆盖切片并在4℃保存。将所述切片暴露14天、显影并用苏木精染色。与正义链杂交的对照和RNA酶A处理的切片中没有产生超出背景的特异性信号。
在交配后7.5天的小鼠胚胎中没有检测到Flt4mRNA表达，但在发育的第8.5天于发育的主动脉中检测到亮信号。相反，发育中的卵黄囊为Flt4阴性。在胚胎外组织中，Flt4在尿囊中显著表达，而卵黄囊的发育中的血细胞岛为阴性。在另一方面，脑间充质的成血管细胞为Flt4强阳性。在发育中的胎盘中，Flt4信号首先见于窦状隙静脉中。在交配后9.5天的胎盘中，静脉腔隙的内皮和与Reichert＇s膜部分融合的巨细胞表达Flt4mRNA。
因此，虽然在最早期的内皮细胞前体，成血管细胞中，F1t4表达非常显著，但其仅限定于交配后8.5天胚胎的某些血管中。已知Tie受体在小鼠胚胎发育期间的所有内皮中均表达，因此为这些细胞提供了标记物。见Korhonen等，癌基因，8395(1993)；和Korhonen等，血液，802548-2555(1992)。值得注意的是，与Tie探针相比，Flt4探针如果与交配后11.5天胚胎的动脉内皮杂交，例如与发育中的背主动脉或颈总动脉的内皮杂交，其杂交信号很弱。相反，在发育中的静脉中，Flt4信号则强得多。例如，在发育的后肾周围的静脉中可检测到Fit4信号，而Tie探针主要识别后肾内的毛细血管。
发现Flt4mRNA分布于交配后12.5天小鼠胚胎的几个区域，在腋区的扩张血管中尤其突出。在颈静脉区域的中矢状切片中发现了相似的Flt4阳性血管结构(资料未给出)。表达Flt4的血管的丛样模式出现于眶周区和发育中的脊椎周围。另外在紧靠发育中的皮肤的下层，存在Flt4阳性血管网。从几个部位中，包括发育中的脑，可获得较弱的毛细血管信号。还可以在颈部、发育中的口鼻部和发育中的舌底以及尾部中检测到Flt4mRNA。另外，肝脏的Flt4mRNA表达为强阳性，其为斑点样模式。
在进一步发育期间，Flt4mRNA表现出更进一步限定于胚胎的某些血管中。交配后14.5天的胚胎很好的表现了这种限定表达的模式。在此类胚胎的中矢状切片中，在其前面部分沿着发育中脊椎管观察到最显著的Flt4信号。此信号被认为来源于胸导管的内皮细胞，在这个发育时间点上胸导管是最大的淋巴管。相反，背主动脉和次级腔静脉为阴性。扩张的肠系膜区血管也为Flt4强阳性。而且，在交配后12.5天的胚胎中，眶周、下领中沿着其解剖边界的血管网以及颈部的血管网包含Flt4阳性内皮。在心包间隙和整个皮下组织中出现相似的结构。值得注意的是与Flt4阴性血管相反，所有的Flt4阳性血管在其腔隙中无血细胞。这些表达模式表明在发育的这个时间点上Flt4变成限定于所述淋巴管内皮细胞。我们观察到Flt4表达的另一位点是发育中骨髓的窦状隙。
还分析了与Flt4探针杂交的交配后16.5天胚胎之胸廓上部的横切切片。进行苏木精-伊红染色检测此区域中血管的不同类型。这些包括颈总动脉和头臂动脉、腔静脉和大小较小且缺少肌肉组织和结缔组织包绕的胸导管。在较高放大倍数下，观察胸导管及其附近小血管的内皮细胞与Flt4探针的杂交。
实施例21培养的内皮细胞中Flt4mRNA的分析实施例20中所述原位杂交的结果表明Flt4在静脉内皮细胞中表达，稍后在淋巴管和一些静脉内皮细胞中表达，但是不在动脉内皮中表达。为了确定在体外此调节是否维持，利用Northern印迹和杂交分析我们研究了培养的内皮细胞。
分离并培养人的主动脉、股静脉、脐静脉和包皮微血管的内皮细胞，并且按在本领域中先前所述方法定性。见Van Hinsberg等，动脉硬化，7389(1987)；和Van Hinsberg等，Thromb.Haemostas，57148(1987)。取传代5到8代后(分裂比率1∶3)的融合内皮细胞用于分离聚腺苷酸化RNA。
内皮细胞系EA hy926(Edgell等，美国国家科学院院刊，803734-3737(1983))、BCE(Folkman等，美国国家科学院院刊，765217-5221(1979))和LEII(Schreiber等，美国国家科学院院刊，826138(1985))不表达Flt4。然而，培养的人微血管、静脉和脐静脉内皮细胞对Flt4特异的5.8和4.5kbmRNA为阳性，而动脉内皮细胞为阴性。相反，另一种内皮受体酪氨酸激酶基因Tie则在所有研究的内皮细胞中表达为4.4kb mRNA。
实施例22成人组织中Flt4mRNA实施例20中得到的结果表明在发育期间，Flt4mRNA变为在很大程度上限定于淋巴管内皮。由于此发现在人体中的潜在的重要性，我们利用人Flt4探针在成人组织中研究了Flt4表达。应用的人Flt4探针是包括所述cDNA(SEQ ID NO1)之碱基对1-595的EcoRI-SphI片段。另见Pajusola等，癌症研究，525738(1992)。所述von Willebrand因子探针是包括碱基对1-2334的EcoRI-HindIII片段。Bonthron等，核酸研究，1417125(1986)。
我们应用了用于组织学诊断的常规固定材料。正常肺组织是从切除的患有表皮样肿瘤的左侧次级肺叶中取得。从患有结肠腺癌的患者取得肠系膜和肠系膜的淋巴结。因大小异常，摘除靠近唾液腺的正常淋巴结。从两个患者得到的扁桃体和两个阑尾没有诊断学上的变化。研究了两例淋巴管瘤和三例膀胱淋巴管瘤，结果类似。
对于用10％福尔马林固定的作为组织学诊断常规标本的人组织，正常的原位杂交方法仅仅给出背景，然而用微波而不是蛋白酶K处理使其能够特异性杂交。见Shi等，生物化学杂志，2665774(1991)；Catoretti等，病理学杂志，168357(1992)。
在肠系膜、肺和阑尾中淋巴管内皮有Flt4信号，而静脉、动脉和毛细血管为阴性。为了研究Flt4是否在HEVs中表达，研究了扁桃体。在扁桃体的一些HEVs中的确检测到Flt4特异性放射自显影颗粒。
实施例23正常及转移性淋巴结和淋巴管瘤中Flt4mRNA的分析分析了人正常肠系膜淋巴结(见实施例22)一个部分的Flt4表达。在淋巴窦和传出及传入淋巴管中观察到Flt4表达。在包括腺癌转移的淋巴结中可观察到相同的模式。在正常和转移性淋巴结中一些HEVs也均为阳性。在膀胱淋巴管瘤中Flt4特异表达于淋巴管内皮，与血管中针对von Willebrandt因子的原位杂交信号的比较一样明显。
与这些结果相一致，Flt4的免疫染色在皮肤淋巴管瘤病的内皮中为强阳性，皮肤淋巴管瘤病是以推测的淋巴管内皮增生为特点的稀有疾病。见Lymboussaki等，美国病理学杂志，153(2)395-403(1998年8月)，在此全文引入本文作为参考。
另外，F1t4免疫染色鉴定了在Kaposi′s肉瘤皮肤结节损伤组织样品之内的纺锤细胞。见Jussila等，癌症研究，581599-1604(1998年4月)。考虑到Flt4的明显的淋巴管特异性，可以认为这些结果与Kaposi′s肉瘤中某些细胞是起源于淋巴内皮的建议相一致。例如见Beckstead等，美国病理学杂志，119294-300(1985)；和Dictor等，美国病理学杂志，130411-417(1988)。
实施例24胎儿内皮细胞中Flt4的定位如实施例2所述，编码短形式的40个羧基末端氨基酸的Flt4cDNA片段，以657bp EcoRI片段被克隆入pGEX-1λT细菌表达载体(Pharmaci)，其与谷光甘肽-S-转移酶编码区在同一个阅读框架中。在大肠杆菌中制备由上述所得的GST-Flt4融合蛋白并通过利用谷光甘肽-Sepharose 4B柱的亲和层析将其纯化。将纯化的蛋白冻干、溶于PBS、与弗氏佐剂混合并将其用于免疫家兔。在第三次加强免疫之后，取抗血清备用。
从用前列腺素诱导的合法流产中取得17-20周龄人胎儿组织。本研究由Helsinki大学中心医院伦理委员会批准。用胎儿脚长估计孕龄。将胎儿组织包埋于Tissue-Tek(Miles)、立即冰冻并在-70℃保存。
将抗Flt4抗血清与GST-Sepharose柱交叉吸收，去除抗GST抗体，然后通过GST-Flt4亲和层析将其纯化。用丙酮将几个6微米厚的冰冻组织切片固定，并用0.3％H2O2的甲醇液处理30分钟，阻断内原性过氧化酶活性。洗涤之后，将所述切片用5％正常猪血清温育。然后将切片与抗Flt4抗体温育并洗涤。用过氧化酶偶联的猪抗兔IgG检测结合的抗体，随后以0.2％3，3-二氨基联苯胺(Amersham)为底物进行过氧化酶活性染色。将所述切片在Meyer′s苏木精中进行对比染色。
人胎儿肠系膜的抗Flt4免疫过氧化酶染色表明在几个脉管的内皮细胞中存在Flt4蛋白，而用抗原阻断的抗Flt4抗体和免疫前血清进行的对照染色为阴性。为了比较，用血管内皮细胞特异的VIII因子相关抗原的抗血清将切片染色。在不含有红细胞的脉管内皮细胞上观察到Flt4免疫过氧化酶染色，而在血管中为阴性。无红细胞的脉管很可能是淋巴内皮，此类脉管在肠系膜中尤其常见。抗VIII因子相关抗原的抗体在所有脉管中均将内皮细胞染色。
实施例25抗Flt4单克隆抗体的制备融合蛋白I通过在High-Five细胞中表达Flt4EC-6xHis-pVTBac质粒构建体(实施例14)，制备重组FIt4胞外结构域蛋白。根据厂商(Qiagen)的说明书，通过利用Ni-NTA亲和层析结合并洗脱在重组Flt4胞外结构域的COOH末端中编码的6xHis标签，从转染的High-Five细胞培养基中纯化Flt4胞外结构域(Flt4EC)。
通过腹膜内注射经弗氏完全佐剂乳化之纯化的重组制备的Flt4胞外结构域(150μg/小鼠)，免疫四月龄的Balb/c雄性小鼠。间隔三到四周后注射150μg加强免疫，并且在再间隔三周之后，进行最后一次加强免疫(10μg溶于PBS的Flt4EC，腹膜内给药)。在最后一次加强免疫给药后4天，处死小鼠，并将小鼠脾淋巴细胞与SP 2/0浆细胞瘤的细胞以2∶1比率进行融合。
在96孔培养板(NUNC)上含20％胎牛血清和HAT(次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷，GIBCO，043-01060H；稀释50倍)的Ex-Cell320培养基(SERALAB)中培养融合细胞。在37℃ 5％CO2条件下培养细胞。10天后，将含HAT的培养基换成含HT的细胞培养基(GIBCO；043-01065H，稀释50倍)。HT培养基与HAT培养基相同，但其没有氨基蝶呤。
三周后，通过下面实施例26所述抗原特异性免疫荧光测定法(IFMA)确定特异性抗体的产生。按Staszewski等，耶鲁大学生物和医学杂志，57865-868(1984)所述方法通过有限稀释法，将主要克隆进行克隆。将阳性克隆在24孔组织培养板(NUNC)中扩增培养、再克隆并用相同的方法进行再检测。通过荧光激活细胞分类法(FACS)检测阳性克隆。
除了一个克隆分泌的Ig可能属于IgA类之外，稳定克隆分泌的免疫球蛋白属于IgG1类。利用抗小鼠亚类的生物素偶联的(SEROTEC)大鼠单克隆抗体，用IFMA法确定单克隆抗体的亚类。
利用Balb/c小鼠在其腹水中制备单克隆抗体。在用降植烷(2，6，10，14-四甲基十五烷98％，ALDRJCH-CHEMIC D7924 Steinheim，目录号T2280-2)预处理动物之后，将上述的杂交瘤给小鼠腹腔注射。在注射杂交瘤细胞之前，注射(i.v.)0.5ml降植烷约两周。注射的细胞总量约为每只小鼠7.5-9×106。在注射杂交瘤10-14天后，收集腹水。
融合蛋白II通过腹膜内注射用弗氏完全佐剂乳化的重组制备的Flt4胞外结构域蛋白(20μg/小鼠)，免疫二月龄的Balb/c(雌性)小鼠。间隔三到四周后注射20μg加强免疫，并且在再间隔三周之后，进行最后一次加强免疫(10μg溶于PBS的Flt4，i.v.给药)。在最后一次加强免疫给药后4天，处死小鼠，并将小鼠脾淋巴细胞与SP 2/0浆细胞瘤以2∶1比率进行融合。
将融合细胞培养于96孔培养板(FALCON)上含20％胎牛血清和HAT(次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷，GIBCO BRL，21060-017；稀释50倍)的OptiMEMl(含Glutamax，1,51985-026 GIBCO BRL)培养基中。在37℃5％CO2条件下培养细胞。10天后，将含HAT的培养基换成含HT的细胞培养基(GIBCO BRL；41065-012，稀释50倍)。
三周后，通过下面实施例26中所述抗原特异性免疫荧光测定法(IFMA)确定特异性抗体产物。按Staszewski等(1984)所述方法通过有限稀释法，将主要克隆进行克隆。将阳性克隆在24孔组织培养板(FALCON)中扩增培养、再克隆并用相同的方法再检测。通过FACS法检测阳性克隆。
2Ell和6B2克隆分泌的免疫球蛋白属于IgG1类，2B12克隆产生的Ig属于IgM亚类。利用抗小鼠亚类重链的生物素偶联大鼠单克隆抗体(SEROTEC)，用IFMA法确定小鼠亚类IgG1，并且用小鼠单克隆抗体独特型试剂盒(Dipstick Format)(19663-012，Life Technologies Inc)确定小鼠亚类IgM。
实施例26抗Flt4单克隆抗体的特异性将纯化的重组Flt4胞外结构域-6xHis融合蛋白产物(按实施例14和25中所述方法制备)用铕标记，使用的方法是根据Mukkala等，Anal.Biochem，176(2)319-325(1989)中所述方法，并进行了如下修改将摩尔浓度过量250倍的异硫氰酸DTTA-Eu(N1螯合物，WALLAC，芬兰)加入Flt4溶液(溶于PBS，0.5mg/ml)，并且通过加入pH9.8的0.5M碳酸钠缓冲液将pH值调到9左右。4℃标记过夜。利用PD-10(PHARMACIA，瑞典)以TSA(50mMTris-HCl，pH7.8，含0.15MNaCl)作为洗脱液去除未结合的标记物。
纯化之后，向标记的Flt4中加入1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，4℃保存。掺入到每个Flt4分子中的铕离子平均数目为1.9，其是通过测量相对于已知EuCl3标准品的荧光比率而确定的(Hemmila等，Anal Biochem，137335-343(1984))。
用兔抗小鼠Ig(Z 259，DAKOPATTS)包被的微滴定条孔(strip wells)(NUNC)经夹心免疫荧光试验筛选在实施例25中制备的抗体。用DELFIA洗涤液在Platewash 1296-024(WALLAC)上将预包被孔洗一次。所述DELFIA试验缓冲液作为稀释缓冲液，用于稀释初筛中的细胞培养上清和作为阳性对照的脾切除小鼠之血清(1∶1000到1∶100000稀释)。
在Plateshake震荡器(1296-001，WALLAC)上震动5分钟，随后用上述洗涤溶液洗涤4次，4℃孵育过夜(或在室温下温育2小时)。
将1∶500稀释的所述铕标记Flt4加入到100μl检测缓冲液中。在Plateshake震荡器上震荡5分钟并在室温下温育1小时之后，按上述方法洗涤所述条孔。
加入增强溶液(DELFIA)200微升/孔。将平板在Plareshake震荡器上震荡5分钟，用ARCUS-1230(WALLAC)检测荧光强度10-15分钟(Lovgren等，见Collins W.P.(主编)，AlternativeImmunoassays，John Wiley和Sons Ltd(1985)，203-216页)。DELFIA结果表明，检测的所有单克隆抗体均结合Flt4EC抗原。挑选与Flt4反应的单克隆抗体(和产生这些抗体的杂交瘤)用于进一步筛选。
用所得单克隆抗体对表达LTR-FLT41构建体的NIH3T3细胞和转染新霉素抗性的NIH3T3细胞进行双抗免疫荧光染色。细胞用EDTA从培养板上脱落，染色，在荧光激活细胞分类器(FACS)上进行分析。FACS分析的结果表示为用指定单克隆抗体染色的阳性细胞的百分率(见下表2)。
a)LTR感染细胞的FACS结果b)NEO感染细胞的FACS结果LTR-FLT41转染细胞的FACS结果表明所述抗体有效地识别Flt4-表达细胞。这些相同抗体在新霉素磷酸转移酶转染的NIH3T3细胞中只给出背景染色。因此，所述抗体特异性识别细胞表面的Flt4酪氨酸激酶。
发现一个命名为抗Flt4杂交瘤9D9F9的克隆稳定地分泌单克隆抗体，通过IFMA确定其为IgG1类免疫球蛋白。杂交瘤9D9F9于1995年3月23日保藏于德国微生物和细胞培养物保藏中心，人类细胞和动物细胞培养物及病毒部，Mascheroder Weg 1b，3300 Braunschweig，德国，登记号为ACC2210。
融合蛋白II抗体上述铕标记的Flt4胞外结构域蛋白还被用来筛选实施例25中所述融合蛋白II的抗体。应用兔抗小鼠Ig(Z 259 DAKO)包被的微滴定孔(Nunc，Polysorb)，用Flt4特异的IFMA筛选所述抗体。通过应用DELFIA平板洗涤佼，用洗涤溶液(Wallac)洗涤所述预包被孔一次。
用DELFIA检测缓冲液稀释细胞培养上清(在初步筛选中1∶2稀释)和作为阳性对照的脾切除小鼠血清(1∶1000到1∶100000稀释)。与标准一样，纯化的抗Flt49D9F9(小鼠IgG1亚类)的使用浓度为1.0ng/ml-250ng/ml。首先在室温下将样品在Plateshake上震荡5分钟，然后4℃孵育大约18小时。首先将框架洗涤4次，然后加入Eu标记的Flt4(1∶2000，溶于100μl检测缓冲液中)，最后在室温下将框架孵育1小时。按所述方法洗涤之后，加入增强溶液(200μl/孔，Wallac)，并将此框架在Plateshake震荡器上震荡5分钟。用ARCUS-1230(Wallac)测定荧光强度。挑选与Flt4反应的单克隆抗体，进一步在使用Flt4表达型NIH3T3细胞的双抗体免疫荧光染色检测进行筛选，方法按上述。
在表3中概括了所得抗Flt4的融合蛋白II单克隆抗体及其相应的FACS分析结果(用指定单克隆抗体染色为阳性的细胞的百分率表示)。
用亲和纯化的抗-Flt49D9F9制备用于抗Flt4抗体定量的标准曲线。线性范围为1.0ng/ml到250ng/ml。
将用pLTRELT41构建体共转染的在表面表达全长Flt4的NIH3T3细胞裂解，使裂解物在6.5％SDS-PAGE中电泳，然后将蛋白转到硝酸纤维素膜(0.45μm，SCHLEICHER and SCHUELL)上，用含单克隆抗体的杂交瘤细胞培养上清(1∶10，含4％甲醇和0.04％SDS的50mM TRIS-40mM甘氨酸缓冲液)进行免疫杂交。与HRP偶联型兔抗小鼠Ig(P161，DAKO，在含150mM生理盐水和5％奶粉的20mM TRIS缓冲液，pH7.5中1∶1000稀释)和ECL(增强的化学发光剂，AMERSHAM)温育，检测单克隆抗体的特异性。
a)LTR转染细胞的FACS结果b)NEO细胞(对照)的FACS结果c)以亲和纯化的抗FLT 9D9F9抗体为标准，定量Mab的产量NF在FACS中无功能WB成功的用于Western免疫杂交实施例27应用抗Flt4抗体鉴定细胞裂解物中的Flt4和在人类组织的淋巴内皮细胞中表达的Flt4将由前面的实施例中所述杂交瘤9D9产生的单克隆抗体用于HEL细胞裂解物的免疫沉淀和Western杂交。如实施例6中所述，已经在HEL细胞中观察到Flt4 mRNA表达。将大约2×107个HEL培养细胞在实施例11中叙述的RIPA缓冲液中裂解，并与约2微克9D9抗体(相当于实施例11的多克隆抗体)免疫沉淀。使免疫沉淀物在SDS-PAGE(6％凝胶)上电泳，电转至硝酸纤维素膜进行Western分析。在免疫沉淀物的Western杂交分析中，用1微克/ml 9D9抗体检测到175KD和125KD的多肽条带，它们对应于Flt4多肽。
用9D9单克隆抗体和碱性磷酸酶ABC-AP试剂盒(Dako)对人皮肤组织进行免疫染色。简言之，在室温(RT)下将成人皮肤样品的6μm切片干燥30分钟，用冷丙酮固定10分钟，然后用磷酸盐缓中液(PBS)洗涤一次，5分钟。然后将样品与2％马血清在室温下孵育30分钟，并用PBS洗涤三次，每次5分钟。
为进行免疫染色，将样品与9D9第一抗体室温温育1小时，用PBS洗涤三次，每次5分钟。洗涤后，将样品与生物素化的兔抗小鼠第二抗体室温孵育30分钟，再用PBS洗涤三次，每次5分钟。
所结合的抗体如下进行检测在室温下与ABC-AP混合物温育30分钟，用PBS洗涤三次，与AP底物(SigmaFastRedTR/Naphtol AS-MX(目录号为F-4648))在室温下温育15分钟，用水洗涤。然后用Mayer′s苏木精对染30秒，并用水清洗。应用Aquamount和盖玻片，在显微镜下分析样品。在这些人类皮肤切片中的淋巴内皮细胞中观察到9D9抗体染色。血管内皮染色很弱或未被染色。还利用其它分析证实对淋巴管内皮的显著特异性。见Lymboussaki等，美国病理学杂志，153(2)395-403(1998年8月)；和Jussila等，癌症研究，581599-1604(1998年4月)，二者均全文引入作为参考。
这些结果进一步证实，Flt4可作为淋巴管内皮的有效标记物使用，抗Flt4抗体可用于鉴定并显示组织样品的这些细胞中所表达的Flt4。
实施例28在乳腺癌血管发生中VEGF-C/VEGFR-3信号途径的上调上述实施例证实Flt4(VEGFR-3)是正常组织中有效的淋巴管内皮特异性抗原标记。下述方法还证实VEGFR-3是恶性乳腺癌的有效抗原标记(如用于诊断和普查)和治疗药物。与组织学上正常的乳腺组织相比，在浸润性乳腺癌中发现VEGFR-3阳性脉管的数量大大增加(P＜0.0001)。
材料和方法从Helsinki大学病理系的标本库中取得新鲜的冰冻乳腺组织样品。这些样品包括导管癌(n＝6)、小叶癌(n＝6)、导管内癌(n＝8)、纤维腺瘤(n＝4)和组织学上正常的乳腺组织(n＝12)。所有样品均在切除术后立即冻于液氮，并在-70℃保存。
基本上按上述实施例(例如实施例25)中的方法制备的小鼠抗人Flt4(VEGFR-3)单克隆抗体(Mab)。通过重组杆状病毒在昆虫细胞中表达VEGFR-3胞外结构域(VEGFR-3EC)，并从培养基中纯化。然后用标淮的方法制备小鼠抗VEGFR-3EC单克隆抗体，并用蛋白A亲和层析从杂交瘤腹水或Tecnomouse培养上清中纯化免疫球蛋白级分。
将所述组织样品的5微米冰冻切片在空气中干燥，并用冷丙酮固定10分钟。将所述切片在磷酸盐缓冲液中进行再水化，并与5％正常马血清在室温下温育30分钟。然后将所述切片与浓度为1.0μg/ml的Mab 9D9F9(实施例26)在潮湿的空气中室温温育2小时。还研究了抗VEGFR-3EC的不同抗原决定簇的其它抗VEGFR-3Mab；克隆2E11D11(实施例26)和7B8F9(基本上按实施例26所述方法制备)的使用浓度分别为9.5和8.5μg/ml。在生物素化的抗小鼠血清中温育30分钟，随后用VectastainElite小鼠IgGABC试剂盒(载体实验室，Burlingame，美国)的试剂温育60分钟。用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC，Sigma，St.Louis，USA)使过氧化酶活性显色10分钟。最后，用苏木精将切片染色20秒。通过省略第一抗体或应用具有相同独特型的无关第一抗体，进行阴性对照实验。用纯化的杆状病毒免疫原阻断9D9抗体的结合，以其作为另一个阴性对照。在这些实验中，所述抗体均与摩尔过量10倍的VEGFRR-3EC蛋白在PBS中温育过夜。4℃，4000rpm离心4分钟后，小心地收集上清，并将其作为第一抗体。选取与抗VEGFR-3抗体染色阳性的切片相邻的5μm冰冻切片进行血管内皮标记物的免疫染色，这些标记物包括PAL-E(0.15μg/ml，Monosan，Uden，荷兰)、层粘连蛋白(克隆LAM-89的上清的1∶4000稀释，Sigma，St Louis，MO)、胶原XVIII(1.9μg/ml)、α-平滑肌肌动蛋白(SMA，0.5μg/ml，克隆1A4，Sigma)、VEGFR-1(克隆19上清的1∶200稀释)或VEGFR-2(1∶100稀释)。
染色后对所有样品进行病理学检查。按照Gasparini和Harris建议的方法[Gasparini G和Harris A，临床肿瘤学杂志，13765-782(1995)]，从PAL-E染色的切片中获得血管密度。用相同的方法研究VEGFR-3阳性脉管的密度。首先在低倍显微镜下浏览切片，然后通过在血管密度最高的区域(血管热点区)或在VEGFR-3阳性脉管密度最高的区域中计数每400x高倍视野中染色脉管的数目，从而估测肿瘤内血管密度。每张切片最少计数5个视野，之后取最高的3个计数的平均值。
在两个导管内瘤中，用双染色来区分淋巴管和血管的免疫组化染色。将丙酮固定的5μm冰冻切片与用抗-PAL-E抗体温育1小时，与生物素化的马抗小鼠抗体(VestastainElite小鼠IgGABC试剂盒，载体实验室，Burlingame，美国)温育30分钟，与ABC过氧化酶(Vestastain，1∶100)温育45分钟，用AEC显色10分钟。在第二步中，根据先前在文献中叙述的用于ISH信号增强的方法[Kerstens等，组织化学细胞化学杂志，43347-352(1995)]，将切片与抗VEGFR-3抗体温育1小时(0.14μg/ml)，随后与生物素化的抗小鼠抗体温育30分钟(克隆上清的1∶200稀释)，与ABC过氧化酶温育30分钟(1∶100)，与含0.01％过氧化物的生物素化酪胺溶液(1∶2000)温育5分钟，与ABC碱性磷酸酶(1∶100)温育20分钟，并用FastBlue(Sigma，StLouis，美国)显色20分钟。将临近双染色切片的冰冻切片(5μm)仅用VEGFR-3抗体按上述方法进行免疫染色。
按文献[Joukov等，EMBO J，163898-3911(1997)，在此全文引入作为参考]所述，在兔中制备人工合成多肽的多克隆抗体，所述多肽相应于成熟、分泌型人血管内皮生长因子C(VEGF-C)的N末端氨基酸残基2-18(VEGF-C前原VEGF-C多肽的氨基酸残基104-120)。使免疫原性多肽与环氧树脂激活的Sepharose-6B柱偶联，抗血清用其进行亲和纯化，并利用表达VEGF-C或对照β半乳糖苷酶的腺病毒感染的细胞检测对VEGF-C的特异性染色。
选择8个导管内肿瘤和所有用于VEGFR-3分析的浸润性肿瘤，进一步分析VEGF-C的表达。将与VEGFR-3抗体染色阳性的切片临近的5微米冰冻切片在空气中干燥，并用冷丙酮固定10分钟。将这些切片在PBS中再水化，并在5％正常山羊血清中温育30分钟，然后与在PBS中1∶200稀释的免抗人VEGF-C多克隆抗体，在潮湿的空气中室温温育2小时。然后在生物素化的抗兔血清中温育30分钟，随后用VestastainElitc兔IgGABC试剂盒(载体实验室，Burlingame，美国)的试剂温育60分钟。按上述方法进一步处理所述切片。将所述纯化的免疫原用于阻断VEGF-C抗体，以其作为阴性对照。在这些实验中，将VEGF-C抗体与10倍摩尔过量的VEGF-C蛋白在PBS中温育过夜。4℃，4000rpm离心4分钟后，小心地收集上清并将其用于免疫染色。
DiaBor Ltd(Oulu，芬兰)通过用重组多肽QH48.18[Saarela等，MatrixBiology，16319-28(1998)]免疫小鼠，制备了抗人型XVIII胶原的单克隆抗体，其中所述重组多肽对应于人型XVIII胶原N末端NCl结构域的共同区。所得克隆用多肽QH48.18经ELISA和Western分析，以及人的冰冻组织切片的免疫荧光染色进行筛选。对杂交瘤克隆的筛选获得3个单克隆抗体，它们在上述三个试验(ELISA，Western，免疫荧光染色)中均为阳性。信号最强的抗体DB144-N2被用于随后的实验。它的染色模式(例如，在成人皮肤和肾脏样品中)与多克隆抗全hu(VXIII)的模式一样。
结果A.组织学上正常的乳腺组织和良性纤维腺瘤中的VEGFR-3正常乳腺组织中VEGFR-3的免疫组化染色表明在导管间间质的毛细血管中染色很弱。这些血管不形成任何特殊的模式，而是弥散分布于整个间质中。正常乳腺组织样品中VEGFR-3阳性血管的密度范围为6-17/hpf，中间值为9(n＝12)。此类脉管的大部分对血管内皮标记物PAL-E和基底层粘连蛋白组分，胶原XVIII的染色为强阳性，表明VEGFR-3在正常乳腺组织血管中表达很弱。然而，基质中VEGFR-3清晰染色的一些小脉管对PAL-E染色为阴性，对胶原XVIII染色很弱，表明它们是淋巴管。在良性纤维腺瘤中也发现了均一的VEGFR-3阳性脉管，其密度(均值为8个脉管/hpf，范围为3-19，n＝4)与组织学上正常的乳腺组织的密度没有差别(均值8对9，Mann-Whiteney检验P＞0.1)。
B.导管内肿瘤中的VEGFR-3阳性脉管在导管内肿瘤中观察强染色的VEGFR-3阳性脉管的不同模式。这些脉管在受侵袭的导管周围形成弓样结构(图5A)。对临近切片的血管内皮标记物PAL-E的染色中，也观察到此“项链状”结构(图5B)，表明在毛细血管内皮中VEGFR-3表达增加。为了更进一步明确区分血管和淋巴管，并搜索脉管壁中平滑肌细胞和周细胞的存在，另用抗平滑肌α肌动蛋白(SMA)、基底层组分层粘连蛋白及XVIII型胶原的抗体进行染色。根据此染色，靠近导管内肿瘤的小脉管同时表达VEGFR-3和基底层蛋白，但是对SMA染色较弱，表明它们被所述脉管壁中的周细胞/平滑肌细胞不完全覆盖(图5C-5F中黑色箭头)。相反，离导管内损伤一定距离的大血管通常为VEGFR-3阴性，但其层粘连蛋白、胶原XVIII和SMA为阳性(红色箭头)。另外，发现了对VEGFR-3为阳性，而对基底层的层粘连蛋白和XVIII型胶原染色很弱，而且SMA根本未染色(绿箭头)的脉管。认为这些脉管代表淋巴管。
C.血管和淋巴管的差异复染选择两个导管内肿瘤进行免疫组化复染，以便更进一步明确区分血管和淋巴管[见de Waal等，美国病理学杂志，1501951-1957(1997)]。应用这种方法，VEGFR-3阳性血管被染成兰色，而PAL-E阳性血管和基底层被染成褐色。两个检测的样品均显示相似的染色模式排列于填满肿瘤的导管中的血管主要为PAL-E阳性(图5G和5H中箭头所指)，而在导管间基质中离其一小段距离的可能的VEGFR-3阳性淋巴管为PAL-E阴性(图5G和图5H中黑色箭头)。为了排除由于可能的复染假象造成的误解，单独用抗VEGFR-3染色临近的5微米切片。此染色证实，若干PAL-E阳性血管对VEGFR-3也为阳性。
D.导管内肿瘤细胞中的VEGF-C、VEGFR-1和VEGFR-2以及临近脉管中的它的受体用抗人VEGF-C的亲和纯化的多克隆抗体对8例导管内肿瘤样品染色。所有检测样品包括至少一些VEGF-C，但发现其染色强度和表达模式有明显异质性。在一些病例中，大部分肿瘤细胞对VEGF-C为强阳性，而在其它病例中，只有一些肿瘤细胞给出染色信号。相反，虽然在未受侵袭的正常导管内皮中有弱信号，在受侵袭导管周围的正常组织中发现几乎没有或根本没有染色。抗原阻断实验表明对VEGF-C的染色是特异性的。在临近导管内肿瘤细胞的相同“项链”状脉管中，另一VEGF-C受体VEGFR-2以及另一VEGF受体(VEGFR-1)均进行表达。
E.侵袭性乳腺癌中的VEGFR-3阳性脉管和VEGF-CVEGFR-3染色强阳性脉管还出现于所研究的所有侵袭性导管癌和小叶癌中。所述VEGFR-3阳性脉管不形成任何特殊的分布模式；这些脉管的大部分还对PAL-E抗原具有免疫反应性。侵袭性乳腺癌中肿瘤内VEGFR-3阳性脉管密度(均值为21，范围为9-56脉管/hpf，n＝12)，与正常乳腺组织的密度相比显著增加(均值21比9；Mann-Whitney检测P＜0.0001)。偶尔可以观察到肿瘤细胞侵入VEGFR-3阳性淋巴管。
在所研究的侵润肿瘤中，对VEGF-C的免疫染色差别很大(n＝12)。一些肿瘤细胞对VEGF-C染色为强阳性，而其它肿瘤染色很弱，或者在一些病例中没有发现染色。与导管内肿瘤的情况一样，在这些切片的结缔组织中几乎没有或根本没有发现染色。
上述的资料表明在大部分成人组织中是主要的淋巴管内皮标记物的VEGFR-3在正常乳腺组织毛细血管内皮中表达很弱。在导管内肿瘤中，检测到VEGFR-3强阳性脉管的“项链”状模式比较明显的排列于填满肿瘤的导管中。大部分的这些脉管表达血管内皮标记物PAL-E和基底层组分层粘连蛋白和胶原XVIII，但是其周细胞/平滑肌细胞数明显比离肿瘤细胞较远的血管的少，如抗SMA抗体染色所示。这些特征表明所述“项链”状脉管正在经历血管发生。离受侵袭导管一段距离的第二组脉管对VEGFR-3为阳性，但是对基底层组分为弱阳性，且对PAL-E为阴性，表明它们是淋巴管。这些脉管也缺乏SMA阳性的周细胞组分。另外在浸润性乳腺癌中，VEGFR-3在PAL-E阳性血管中上调，但所见脉管模式在肿瘤细胞周围的结缔组织基质中分布更随机。这些结果表明在与肿瘤生长相关的血管发生期间，乳腺癌中VEGFR-3表达上调。在肿瘤原位中VEGFR-3阳性脉管数大大增加的发现，符合以下假说，即肿瘤细胞产生了可活化其紧邻区血管生长的因子。
因为VEGF-C与VEGFR-3和VEGFR-2均高亲和力结合，并且因为导管内肿瘤和侵袭性肿瘤对VEGF-C染色经常为阳性，此生长因子是肿瘤中VEGFR-3和VEGFR-2阳性脉管的侯选生长因子。这些资料与另一研究相一致，该研究在Northern杂交分析中发现35例未筛选的恶性浸润性肿瘤(包括乳腺癌、鳞状细胞癌、淋巴瘤、黑色素瘤和肉瘤)的近一半包括VEGF-CmRNA[见Salven等，美国病理学杂志，153(1)103-108(1998年7月)，已引入本文作参考]。总而言之，在本文所述资料可指导用阻断VEGF-C所介导的VEGFR-2和/或VEGFR-3刺激作用的试剂对乳腺癌(可能还包括其它非淋巴管性肿瘤)的治疗。可选的阻断剂包括抗VEGF-C抗体；抗VEGFR-3抗体；抗VEGFR-2抗体；与VEGFR-3和VEGFR-2或VEGFR-1结合的双特异性抗体；与循环的VEGF-C结合的VEGFR-3可溶性胞外片段；结合VEGFR-3和/或VEGFR-2并抑制此类受体活化的VEGF-C片段和类似物；与VECFR-3和/或VEGFR-2结合并结合适当治疗药物的VEGF-C多肽、片段和类似物；VEGFR-3酪氨酸激酶抑制剂；和结合并抑制这些受体的小分子。另外，因为VEGF-D与VEGFR-3和VECFR-2均结合，考虑抗VEGF-D抗体和抑制性VEGF-D片段和类似物为合适的阻断药物。当选用抗体治疗人类时，优选人或人源化抗体及其片段。另外，本发明另一方面涉及在体内或体外利用上述任何药物评估哺乳动物组织，例如用于诊断和普查恶性肿瘤及其传播。
可对上述任何试剂进行进一步改良，使其适用与诊断和普查，改良方法有结合可检测的标记，其包括但不限于放射性同位素(例如14C、133I、125I)、发色基团(例如荧光素，藻胆蛋白；四乙基罗丹明；可产生荧光或发色物质以便荧光检测的酶；可产生电子致密产物以便电子显微镜镜检的吸收光、可见色或凝集作用)；或电子致密分子如铁蛋白、过氧化酶或金颗粒等。同样，可通过结合(如偶联)以下分子或与它们一起施用，从而改良所述试剂使其适用于治疗，所述分子有具有抗肿瘤特性的分子，例如植物、动物、微生物或真菌来源的毒素；放射性同位素；药物；酶；和/或细胞因子和其它治疗性蛋白(见例如Pietersz和McKenzie，“用于癌症治疗的抗体结合物”，免疫学综述，12957-80(1992)，在此引入本文作为参考。)实施例29抗-Flt4抗体作为治疗药物给人施用A.抗Flt4单克隆抗体的人源化在本文中(例如实施例28中)报道的Flt4的生物学，表明了对阻断配体介导之Flt4受体信号传递的Flt4抑制剂(拮抗剂)的治疗应用。中和Flt4的抗体包括一类作为Flt4拮抗剂的治疗药物。下面所述是实验方案，其用来改进在人类中作为治疗药物的抗Flt4单克隆抗体的应用，其通过“人源化”所述单克隆抗体来改进其在人体内的血清半衰期并降低其免疫原性(即用来防止人体对非人抗Flt4抗体的抗体应答)。
在文献中已经报道了人源化的原则，通过抗体蛋白的分子重排促进人源化。为了使结合补体的可能性最小，优选IgG4同种型的人源化抗体。
例如，通过制备嵌合抗体达到人源化水平，所述嵌合抗体包括目的非人抗体蛋白(例如本文中所述抗Flt4单克隆抗体)的可变区，和人抗体分子的恒定区[见例如Morrison和Oi，免疫学进展，4465-92(1989)]。从B细胞杂交瘤的染色体DNA或从目的杂交瘤的mRNA制备的cDNA中克隆出中和抗Flt4抗体的Flt4可变区。将V区基因片段与编码人抗体恒定区的外显子连接，并将得到的构建体在适当的哺乳动物宿主细胞(例如骨髓瘤或CHO细胞)中表达。
为了获得更高的人源化水平，仅将那些编码非人单克隆抗体基因之抗原结合互补决定区(“CDR”)的可变区基因片段的部分克隆到人抗体序列中[见例如Jones等，自然，321522-525(1986)；Riechmann等，自然，332323-327(1988)；Verhoeyen等，科学，2391534-36(1988)；和Tempest等，生物/技术，9266-71(1991)]。必要时，还可修饰围绕CDR3区的人抗体β片层框架，从而更能影映原始单克隆抗体抗原结合区的三维结构[见Kettleborough等，蛋白质工程，4773-783(1991)；和Foote等，分子生物学杂志，224487-499(1992)]。
在另一个方法中，通过如定点诱变改变非人抗体表面的指定残基，但保留非人抗体的所有内部残基和用于连接的残基，可使目的非人单克隆抗体的表面人源化。见Padlan，分子免疫学，28(4/5)489-98(1991)。
可用上述方法，通过中和Flt4的抗-Flt4单克隆抗体和产生它们的杂交瘤，例如抗体9D9F9，来产生人源化Flt4中和抗体，其可作为药物有效治疗和缓解以Flt4表达为害的病情。
B.源自噬菌体展示的人源FIt4中和抗体用噬菌体展示技术(如下述)制备人源Flt4中和抗体Aujanme等，人类抗体，8(4)155-168(1997)；Hoogenboom等，TIBTECH，1562-70(1997)；和Rader等，Curr.Opin.Biotechnol.8503-508(1997)，均引入本文作为参考。例如，将抗体可变区如Fab片段或相连的单链Fv片段与丝状噬菌体小衣壳蛋白pIII的氨基末端融合。融合蛋白的表达及其向成熟噬菌体衣壳中的掺入导致产生的噬菌体颗粒在其表面出现抗体并包含编码该抗体的遗传物质。将包括这些构建体的噬菌体文库在细菌中表达，并利用标记的或固相化Flt4作为抗原探针，筛选所述文库的Flt4特异性噬菌体抗体。
C.源自转基因小鼠的人Flt4中和抗体基本如Bruggemann和Nueberger，今日免疫学，17(8)391-97(1996)和Bruggemann和Taussig等，Curr.Opin.Biotechnol，8455-58(1997)中所述在转基因小鼠中制备人F1t4中和抗体。利用传统的免疫方法，用Flt4组合物对在其种系构型中携带人V基因片段并在其淋巴组织中表达这些转基因的转基因小鼠进行免疫。用传统方法免疫小鼠，取其B细胞制备杂交瘤，通过筛选来鉴定分泌抗Flt4人源抗体的杂交瘤(例如，如上所述)。
D.双特异性抗体用文献所述的标准方法，制备、分离和检验与Flt4特异性结合并且相关于病理或治疗的其它抗原特异性结合的双特异性抗体。见，例如，Pluckthun和Pack，免疫技术，383-105(1997)；Carter等，血液治疗杂志，4463-470(1995)；Renner和Pfreundschuh等，免疫学综述，1995，145期，179-209页；Pfreundschuh，美国专利号5643759；Segal等，血液治疗杂志，4377-382；Segal等，免疫生物学，185390-402(1992)；和Bolhuis等，癌症免疫学.免疫治疗，341-8(1991)，均全文引入本文作为参考。
实施例30用来证明抗Flt4的癌症治疗功效的动物模型癌症治疗可接受的任何动物均可用于证实抗Flt4的癌症治疗功效。用标准的剂量-应答研究证实对乳腺癌的治疗功效的模型有Tekmal和Durgam，Cancer Lett，118(1)21-28(1997)；Moshakis等，英国癌症杂志，43575-580(1981)；和Williams等，J.Nat.Cancer.Inst 66147-155(1981)所述。除了小鼠模型，狗和猪的模型也可考虑，因为至少某些人Flt4抗体(例如所述9D9抗体)还识别狗或猪的Flt4。监测肿瘤大小和副作用来证实与对照相比的治疗功效。
所有文献，包括本发明所简要引用或详细叙述的专利和期刊文章，均全文引入本文作为参考。
虽然本发明用具体实施方案进行描述，但应该理解它能够进一步修改，而且本申请意图覆盖总体上符合本发明原则而对本发明进行的任何改变、应用或调整，其包括根据本发明所属领域已知或常规的实践所作的不同于本文的改动，符合本文所述基本特征的改动，以及包含在所附权利要求书范围之内的改动。
序列表<1l0>Helsinki University Licensing Ltd.，OYLudwig Institute For Cancer Research<120>Flt4(VEGFR-3)作为肿瘤显像和抗肿瘤治疗的靶<130>28113/34891<140><141><150>09/169,079<151>1998-10-09<160>22<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>4195<212>DNA<213>人<220><221>CDS<222>(20)..(3913)<400>1ccacgcgcag cggccggag atg cag cgg ggc gcc gcg ctg tgc ctg cga ctg 52Met Gln Arg Gly Ala Ala Leu Cys Leu Arg Leu1 5 10tgg ctc tgc ctg gga ctc ctg gac ggc ctg gtg agt ggc tac tcc atg 100Trp Leu Cys Leu Gly Leu Leu Asp Gly Leu Val Set Gly Tyr Ser Met15 20 25acc ccc ccg acc ttg aac atc acg gag gag tca cac gtc atc gac acc 148Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser His Val Ile Asp Thr30 35 40ggt gac agc ctg tcc arc tcc tgc agg gga cag cac ccc ctc gag tgg 196Gly Asp Ser Leu Ser Ile Set Cys Arg Gly Gln His Pro Leu Glu Trp45 50 55gct tgg cca gga gct cag gag gcg cca gcc acc gga gac aag gac agc 244Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr Gly Asp Lys Asp Ser60 65 70 75gag gac acg ggg gtg gtg cga gac tgc gag ggc aca gac gcc agg ccc 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115 120 125Thr Gln Cys Met Pro Arg Glu Val Cys Ile Asp Val Gly Lys Glu Phe130 135 140Gly Val Ala Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Ser Val Tyr145 150 155 160Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Ser Glu Gly Leu Gln Cys Met Asn Thr165 170 175Ser Thr Ser Tyr Leu Ser Lys Thr Leu Phe Glu Ile Thr Val Pro Leu180 185 190Ser Gln Gly Pro Lys Pro Val Thr Ile Ser Phe Ala Asn His Thr Ser195 200 205Cys Arg Cys Met Ser Lys Leu Asp Val Tyr Arg Gln Val His Ser Ile210 215 220Ile Arg Arg Ser Leu Pro Ala Thr Leu Pro Gln Cys Gln Ala Ala Asn225 230 235 240Lys Thr Cys Pro Thr Asn Tyr Met Trp Asn Asn His lie Cys Arg Cys245 250 255Leu Ala Gln Glu Asp Phe Met Phe Ser Ser Asp Ala Gly Asp Asp Ser260 265 270Thr Asp Gly Phe His Asp Ile Cys Gly Pro Asn Lys Glu Leu Asp Glu275 280 285Glu Thr Cys Gln Cys Val Cys Arg Ala Gly Leu Arg Pro Ala Ser Cys290 295 300Gly Pro His Lys Glu Leu Asp Arg Asn Ser Cys Gln Cys Val Cys Lys305 310 315 320Asn Lys Leu Phe Pro Ser Gln Cys Gly Ala Asn Arg Glu Phe Asp Glu325 330 335Asn Thr Cys Gln Cys Val Cys Lys Arg Thr Cys Pro Arg Asn Gln Pro340 345 350Leu Asn Pro Gly Lys Cys Ala Cys Glu Cys Thr Glu Ser Pro Gln Lys355 360 365Cys Leu Leu Lys Gly Lys Lys Phe His His Gln Thr Cys Ser Cys Tyr370 375 380Arg Arg Pro Cys Thr Asn Arg Gln Lys Ala Cys Glu Pro G1y Phe Ser385 390 395 400Tyr Ser Glu Glu Val Cys Arg Cys Val Pro Ser Tyr Trp Lys Arg Pro
405 410415Gln Met Ser<210>22<211>354<212>PRT<213>人<400>22Met Tyr Arg Glu Trp Val Val Val Asn Val Phe Met Met Leu Tyr Val1 5 10 15Gln Leu Val Gln Gly Ser Ser Asn Glu His Gly Pro Val Lys Arg Ser20 25 30Ser Gln Ser Thr Leu Glu Arg Ser Glu Gln Gln Ile Arg Ala Ala Ser35 40 45Ser Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ile Thr His Ser Glu Asp Trp Lys Leu50 55 60Trp Arg Cys Arg Leu Arg Leu Lys Ser Phe Thr Ser Met Asp Ser Arg65 70 75 80Ser Ala Ser His Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala Thr Phe Tyr Asp Ile85 90 95Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg Thr Gln Cys Ser100 105 110Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr115 120 125Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly130 135 140Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr145 150 155 160Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro165 170 175Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu180 185 190Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser Ile Ile Arg Arg Ser Ile Gln195 200 205Ile Pro Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu Cys Pro Ile210 215 220Asp Met Leu Trp Asp Ser Asn Lys Cys Lys Cys Val Leu Gln Glu Glu225 230 235 240Asn Pro Leu Ala Gly Thr Glu Asp His Ser His Leu Gln Glu Pro Ala245 250 255Leu Cys Gly Pro His Met Met Phe Asp Glu Asp Arg Cys Glu Cys Val260 265 270Cys Lys Thr Pro Cys Pro Lys Asp Leu Ile Gln His Pro Lys Asn Cys275 280 285Ser Cys Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys Gln Lys His290 295 300Lys Leu Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg Cys Pro Phe305 310 315 320His Thr Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys325 330 335Arg Phe Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gln Gly Pro His Ser Arg Lys340 345 350Asn Pro
权利要求
1.一种治疗哺乳动物恶性肿瘤患者的方法，所述恶性肿瘤特征为，其邻近区血管的内皮细胞中有Flt4受体酪氨酸激酶(Flt4)的表达，所述方法包括如下步骤给需要此治疗的哺乳动物施用一种组合物，该组合物包括一种化合物，该化合物可有效抑制Flt4配体蛋白与所述生物之内皮细胞中表达的Flt4结合，从而抑制Flt4介导的所述血管内皮细胞的增殖。
2.根据权利要求1的治疗哺乳动物恶性肿瘤患者的方法，所述恶性肿瘤特征为，其邻近区血管的内皮细胞中有Flt4受体酪氨酸激酶(Flt4)的表达，所述方法包括如下步骤(a)检查哺乳动物，确定该生物的恶性肿瘤附近血管中是否存在表达Flt4的内皮细胞；(b)选择经上述检查步骤被确定为患有恶性肿瘤的生物，所述恶性肿瘤特征为，其邻近区血管的内皮细胞中存在表达Flt4的内皮细胞；和(c)给所选生物施用一种组合物，该组合物包括一种化合物，该化合物可有效抑制Flt4配体蛋白与所述生物之内皮细胞中表达的Flt4结合，从而抑制Flt4介导的所述血管内皮细胞的增殖。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述恶性肿瘤选自癌、鳞状细胞癌、淋巴瘤、黑色素瘤和肉瘤。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述恶性肿瘤是以在血管内皮细胞中表达Flt4为特点的乳腺癌。
5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述生物是人。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述化合物包含选自下组的多肽(a)含抗Flt4抗体之抗原结合片段的多肽；(b)含可溶性Flt4片段的多肽，其中所述片段和所述多肽能够与Flt4配体结合；(c)一种多肽，其含有脊椎动物血管内皮生长因子C(VEGF-C)前体多肽的片段或类似物，其中所述多肽和所述片段或类似物能结合但不能激活宿主固有细胞上表达的Flt4；和(d)一种多肽，其含有脊椎动物血管内皮生长因子D(VEGF-D)前体多肽的片段或类似物，其中所述多肽和所述片段或类似物能结合但不能激活宿主固有细胞上表达的Flt4。
7.根据权利要求6的方法，其中所述化合物包括含抗Flt4抗体之抗原结合片段的多肽。
8.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述化合物包括双特异性抗体或其片段，其中所述抗体或片段包含特异性结合Flt4的抗原结合结构域，和特异性结合血管内皮标记抗原的抗原结合结构域，所述血管内皮标记抗原实质上不出现在淋巴管内皮中。
9.根据权利要求8的方法，其中所述血管内皮标记抗原选自PAL-E、VEGFR-1和VEGFR-2。
10.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述化合物包含抗Flt4抗体或其抗原结合片段。
11.根据权利要求8-10中任一项的方法，其中所述抗Flt4抗体为人源化抗体。
12.根据权利要求6-11中任一项的方法，其中所述化合物还包括与所述双特异性抗体偶联的抗肿瘤药物。
13.根据权利要求1-12中任一项的方法，其中所述化合物还包括一种可检测标记。
14.根据权利要求1-13中任一项的方法，其中所述组合物还包括可药用的稀释剂、佐剂或载体介质。
15.一种使脊椎动物组织中肿瘤显像的方法，包括如下步骤(a)使疑有肿瘤的脊椎动物组织与包含Flt4结合化合物的组合物接触；(b)检测与所述组织中细胞结合的Flt4结合化合物；并且(c)通过鉴定与所述Flt4结合化合物结合的血管内皮细胞使实体瘤显像，其中表达Flt4的血管与该组织中肿瘤的存在和部位相关。
16.根据权利要求15的方法，其中所述组织包括人的组织。
17.根据权利要求15或16的方法，在所述接触步骤之后及所述显像步骤之前还包括洗涤所述组织的步骤，其中洗涤条件应使未与所述组织中Flt4结合的Flt4结合化合物从所述组织中除去。
18.根据权利要求15-17中任一项的方法，其中所述Flt4结合化合物包括选自下组的多肽(a)含抗Flt4抗体之抗原结合片段的多肽；(b)一种多肽，其含有脊椎动物血管内皮生长因子C(VEGF-C)前体多肽的片段或类似物，其中所述多肽和所述片段或类似物能结合细胞上表达的Flt4；(c)一种多肽，其含有脊椎动物血管内皮生长因子G(VEGF-G)前体多肽的片段或类似物，其中所述多肽和所述片段或类似物能结合细胞上表达的Flt4；
19.根据权利要求15-17中任一项的方法，其中所述化合物包括含抗Flt4抗体之抗原结合片段的多肽。
20.根据权利要求15-17中任一项的方法，其中所述Flt4结合化合物包括抗Flt4抗体或其抗原结合片段。
21.根据权利要求15-21中任一项的方法，其中所述抗Flt4抗体是人源化抗体。
22.根据权利要求15-21中任一项的方法，其中所述化合物还包括与其共价结合的可检测标记。
23.根据权利要求15-22中任一项的方法，还包括下述步骤使所述组织与第二种特异性结合血管内皮标记物的化合物接触，所述标记物在淋巴管内皮中实质上不存在；检测与所述组织中的细胞结合的所述第二种化合物；其中所述显像步骤包括鉴定用所述Flt4结合化合物和所述第二种化合物标记的血管，其中用所述Flt4结合化合物和所述第二种化合物标记的血管与组织中肿瘤的存在和位置相关。
24.根据权利要求23的方法，其中所述血管内皮标记物选自PAL-E、VEGFR-1和VEGFR-2。
25.根据权利要求15-17中任一项的方法，其中所述Flt4结合化合物包括双特异性抗体或其片段，其中所述抗体或片段包括特异性结合Flt4的抗原结合结构域和特异性结合淋巴管内皮中实质上不存在的血管内皮标记物的抗原结合结构域。
26.一种疾病检查方法，所述疾病以新生血管内皮细胞的变化为特点，所述方法包括如下步骤(a)获得脊椎动物可疑患者的组织样品，所述可疑患者被怀疑患有以新生血管内皮细胞的变化为特点的疾病；(b)将所述组织样品暴露于一种组合物，该组合物包括特异性结合所述生物细胞表达的Flt4受体酪氨酸激酶(Flt4)的化合物；(c)洗涤所述组织样品；和(d)通过检测所述化合物在所述组织样品中的存在、量或分布来检查所述疾病，其中血管内皮细胞中的Flt4表达被鉴定为以新生血管内皮细胞之变化为特点的疾病的标记物。
27.根据权利要求26的方法，其还包括使所述组织样品暴露于第二种化合物，该化合物可特异性结合一种血管内皮标记物，其中所述检查步骤包括对结合Flt4的化合物和结合新生血管内皮细胞的第二种化合物进行检测，以测定能同时表达Flt4和血管内皮细胞标记物的内皮细胞的存在、量或分布。
28.一种检测哺乳动物中新生血管内皮细胞的方法，包括如下步骤(a)给所述哺乳动物施用一种组合物，该组合物包括特异性结合哺乳动物Flt4受体酪氨酸激酶(Flt4)的第一种化合物，和(b)检测结合于新生血管内皮细胞的所述第一种化合物，从而检测所述生物中新生血管内皮细胞。
29.根据权利要求28的方法，还包括给所述哺乳动物施用第二种化合物，该化合物可与一种血管内皮标记物特异性结合；且其中所述检测步骤包括检测结合于新生血管内皮细胞的所述第一和第二种化合物。
30.结合Flt4受体酪氨酸激酶之化合物在药物制备中的应用，所述药物用于诊断性检查、显像或治疗以邻近区血管表达Flt4为特点的恶性肿瘤。
31.权利要求30的应用，其中所述化合物选自(a)含抗Flt4抗体之抗原结合片段的多肽；(b)含可溶性Flt4片段的多肽，其中所述片段和所述多肽能够与Flt4配体结合(c)一种多肽，其含有脊椎动物血管内皮生长因子C(VEGF-C)前体多肽的片段或类似物，其中所述多肽和所述片段或类似物能结合但不能激活宿主固有细胞上表达的Flt4；和(d)一种多肽，其含有脊椎动物血管内皮生长因子D(VEGF-D)前体多肽的片段或类似物，其中所述多肽和所述片段或类似物能结合但不能激活宿主固有细胞上表达的Flt4。
32.权利要求30的应用，其中所述化合物包括抗Flt4抗体或其抗原结合片段。
33.权利要求30的应用，其中所述化合物包括双特异性抗体或其片段，其中所述抗体或片段包括特异性结合Flt4的抗原结合结构域，还包括特异性结合在淋巴管中实质上不存在的血管内皮标记抗原的抗原结合结构域。
34.根据权利要求32和33的应用，其中所述抗体为人源化抗体。
全文摘要
本发明提供纯化的Flt4受体酪氨酸激酶多肽及其片段,编码这类多肽的多核苷酸,与这类多肽特异性结合的抗体,以及它们的用途。
文档编号A61P35/00GK1329504SQ99814285
公开日2002年1月2日 申请日期1999年10月8日 优先权日1998年10月9日
发明者卡里·阿利塔洛, 阿加·凯佩南, 雷加·瓦尔托拉, 洛塔·贾西拉 申请人:路德维格癌症研究院, 利森蒂亚有限公司