专利名称：锝－99m标记的二巯基丁二酸酯类配合物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种99mTc标记的放射性配合物及其制备方法和应用，其特别是作为肿瘤显像剂的应用。
背景技术：
目前在99mTc标记的放射性药物化学领域，近年来对以99mTc(V)核为中心核的二巯基丁二酸配合物(99mTc(V)-DMSA)的研究十分活跃，其结构式见(图a)，主要用于肿瘤显像，它在软组织肿瘤、甲状腺髓样癌、头颈部肿瘤、骨转移瘤等多种恶性肿瘤的显像诊断中显示了较高的灵敏度和特异性，已广泛应用于临床。
近年来，通常称为癌症的恶性肿瘤已成为目前危害人类健康最严重的一类疾病，严重影响着人类的健康，因此对于肿瘤显像药物的研究是当今放射性药物研究的热点之一。在显像方面，由于99mTc具有半衰期短(6.02小时)、γ射线能量适中(140千电子伏特)等优良核性质，使其能与SPECT(Single-Photo Emission Computed Tomography，单光子发射计算机断层术)配合用于体内显像，且病人受到辐射剂量很低。医用99Mo-99mTc发生器的研制成功，使99mTc核素获取方便，价格低廉，因此99mTc成为放射性标记药物研究的首选核素，并且取得了很大的进展。
放射性核素SPECT肿瘤显像在临床应用中具有无创性、易得、操作相对简单、费用相对低的特点，因此核医学扫描技术这种无创性的肿瘤诊断技术具有重要的发展价值。
67Ga-柠檬酸镓(67Ga-cit)作为一种较常用的肿瘤显像剂。由于它的亲瘤广谱性，且有商品供应临床、使用方便，所以三十多年以来一直在发达国家用于肿瘤定位。是一种较常用的软组织肿瘤显像剂。对于何杰金氏和非何杰金氏淋巴瘤的常规诊断、临床分期、疗效评价、预后评价、预后判断和监测复发等很有价值，可用于诊断各种软组织肉瘤如平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、神经纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞肉瘤、粒细胞瘤等。其他如用于肝脏肿瘤、支气管肺癌以及对肺部良恶性病变的鉴别诊断也有一定的价值。它的不足之处是①缺乏特异性(炎症病变部位亦显阳性)；②物理特性差，发射的γ射线的能量范围(93-394千电子伏特)过宽；③67Ga-柠檬酸镓由肠道排除，干扰了显像质量；④静脉注射后显像需长时间等待(48-72小时)。由于上述多种不足，研究发展了其他亲肿瘤的放射性药物。
99mTc(V)-DMSA是一种较理想的亲肿瘤显像剂。(ohta H，Endo K，Fujita T，et al，Imagingof soft tissue tumors nith 99mTc(V)-Dimercaptosuccinic acid，A new tumer-seeking agent，ClinNucl Med 198419568)，与其它肿瘤显像剂相比，其具有以下优点①在肿瘤和骨组织中的摄取率较高——即靶/非靶器官放射性比高，可以较好的显示肿瘤和骨组织的病变；②体内代谢快，从血中清除迅速，在给药后2小时左右即可达到理想的显像状态，既缩短了检查时间又减少了病人受照剂量；③使用目前最常用的99mTc标记，核素来源方便，具有适宜的能量(140千电子伏特)和较短的半衰期(6.02小时)；④制备简单，目前已有市售的成品药盒，可实现简单的一步法制备，也可改变99mTc(V)-DMSA药盒的标记条件，较方便的制备出放化纯度较高的99mTc(V)-DMSA；⑤图像质量高，显像时间短，既能显示软组织转移灶又能显示骨组织转移灶。
99mTc(V)-DMSA在软组织肿瘤诊断方面的应用价值已得到人们的肯定。99mTc(V)-DMSA可发现直径小于0.5cm的肿瘤，与肿瘤显像剂67Ga-cit(67Ga-柠檬酸镓)比较，除特异性低于67Ga-cit外，灵敏度、图像质量等均优于67Ga-cit。
研究表明99mTc(V)-DMSA可以对MTC、软组织肿瘤、头颈部肿瘤、骨转移瘤等多种肿瘤进行高灵敏度、高特异度的显像诊断；可以较方便的进行全身显像，寻找肿瘤的转移灶；可以判断肿瘤细胞的存活情况，观察肿瘤放化疗后的疗效。99mTc(V)-DMSA在肿瘤显像诊断方面具有广阔地应用前景(Ohta H，Komibuchi T，Tomihara M，etal，99mTc(V)-DMSA and67Ga-citrate images in a patient with recurrent extraabdominel fobromatosis[J]，Ann Nucl Med1998，12(4)221-223)。
但是由于99mTc(V)-DMSA在骨中有非常高的摄取，造成干扰，导致靶/非靶比值较低，所以对肿瘤显像尤其是软组织肿瘤显像结果造成一定的影响。99mTc(V)-DMSA结构如下
由此可以看出，现有的较为成功的软组织肿瘤显像剂99mTc(V)-DMSA，尚存在骨摄取高造成干扰的缺点，若能提供一种能更好的被软组织肿瘤摄取、敏感性更高，而骨摄取更低、对比更清晰的肿瘤显像剂，将具有广泛的应用前景。
基于以上考虑，发明人提出了一类新型的锝-99m标记的肿瘤显像剂。肿瘤摄取值高，初步研究表明这类新型肿瘤显像剂具有优良的生物性能，且制备方法简单、成本低，有望在临床上得以推广应用。
发明内容
本发明的首要目的是克服了已有技术的缺点，提供一类具有优良显像性能的新的放射性锝-99m标记的二巯基丁二酸酯类配合物； 本发明的另一目的在于提供新的锝-99m标记、锝氮标记、羰基锝标记的二巯基丁二酸酯类配合物的制备方法； 本发明的再一目的是提供一种所述的配合物作为肿瘤显像剂的应用； 本发明是以99mTc(V)、99mTcN(II)、99mTc(I)(CO)3为中心核，与其配位的是二巯基丁二酸酯类配体，其结构式分别为[99mTcO(DMSR)2]-/[99mTcO(DMSR2)2]-、[99mTcN(DMSR2)2]2-/[99mTcN(DMSR2)2]2-、[99mTc(CO)3(DMSR)2]/[99mTc(CO)3(DMSR2)2]，其中用式DMSR/DMSR2表示的配体中R为C1～C5烷基或环己基。
本发明提供的一种以99mTc(V)为配体的放射性锝-99m标记的二巯基丁二酸配合物，由下述结构式表示
该配合物[99mTeO(DMSR)2]-/[99mTcO(DMSR2)2]-以99mTc(V)为中心核，与其配位的二巯基丁二酸酯配体，用式DMSR/DMSR2表示 其中 R为C1～C5烷基或环己基； 所述的C1～C5烷基是指具有1～5个碳原子的直链或支链的烷基，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基在内的任一种； 优选的本发明配合物的R为C1～C4烷基或环己基配合物； 进一步优选的本发明配合物是R为甲基或乙基配合物； 最优选的配合物是其中R为乙基配合物。
在本研究领域，对于放射性核素标记配合物的结构表征常用该核素的稳定同位素或用与该核素化学性质相近的稳定核素代替该放射性核素来制备同类配合物，进行结构表征并由此推定放射性核素标记配合物的结构，对于放射性核素锝-99m，常用锝-99或用其同族的铼(Re)代替，从而对锝-99m标记配合物的结构进行推定。本发明的锝-99m配合物与现有技术中以99mTc(V)为中心核的二巯基丁二酸配合物[99mTcO(DMSA)2]-属同类配合物，二者的分别在于配位体的取代基不同，即结构式中的R不同。因此本发明的锝-99m配合物在结构上与现有的99mTc(V)为中心核的二巯基丁二酸配合物[99mTcO(DMSA)2]-相同。现有以99mTc(V)为中心核的二巯基丁二酸配合物[99mTcO(DMSA)2]-的结构已有文献报道用Tc(V)代替99mTc(V)进行结构表征，结果认为该类配合物带一个负电荷，是由两个DMSA配体提供的4个巯基和1个锝酸根共价结合的正方形锥体结构组成，如前述结构式所示，由此推定，现有以99mTc(V)为中心核的二巯基丁二酸配合物[99mTcO(DMSR)2]-/[99mTcO(DMSR2)2]-的结构与此相同。考虑到本发明所述配合物与现有配合物属同类，因此，同样可以推定本发明所述配合物具有正方形锥体构型，所以本发明中只对二巯基丁二酸酯配体DMSR/DMSR2进行表征，而不再对本发明的配合物结构进行表征。
本发明提供了一种放射性的锝氮标记的二巯基丁二酸酯配合物，其分子式为[99mTcN(DMSR)2]2-/[99mTcN(DMSR2)2]2-。
该配合物[99mTcN(DMSR)2]2-/[99mTcN(DMSR2)2]2-以99mTcN为中心核，与其配位的二巯基丁二酸配体用式DMSR/DMSR2表示 其中 R为C1～C5烷基或环己基； 所述的C1～C5烷基是指具有1～5个碳原子的直链或支链的烷基，包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基在内的任一种； 优选的本发明配合物是R为C1～C4烷基或环己基配合物； 进一步优选的本发明配合物是R为甲基或乙基配合物； 最优选的配合物是其中R为乙基配合物。
与99mTc(III)为中心核99mTc(III)-DMSA的分子式为[99mTc(III)O(DMSA)2]-，经研究表明整个配体带一个负电荷是由两个DMSA配体提供的4个巯基和1个锝酸根共价结合的正方形锥体结构组成，由于[Tc≡N]2+比[Tc＝O]3+少一个正电荷，推测放射性的锝氮标记的二巯基丁二酸配合物其分子式为[99mTcN(DMSA)2]2-，整个配合物带两个负电荷。
本发明提供了一类放射性的羰基锝标记的二巯基丁二酸酯配合物，其分子式为以99mTc(CO)3为中心核，与其配位的二巯基丁二酸配体用式DMSR/DMSR2表示 其中 R为C1～C5烷基或环己基； 上述C1～C5烷基是指具有1～5个碳原子的直链或支链的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基在内的任一种； 优选的本发明配合物是R为C1～C4烷基或环己基配合物； 进一步优选的本发明配合物是R为甲基或乙基配合物； 最优选的配合物是其中R为乙基配合物。
本发明的配体DMSR/DMSR2可通过以下的方式合成
R为C1～C5烷基或环己基。
起始反应物为二巯基丁二酸与ROH反应，所述的ROH为C1～C5烷醇或环己醇，均可在市场购得。两种反应物在H+存在下强烈搅拌加热回流。反应30分钟后，即可得到1和2，用三氯甲烷溶解2，与1和原料分离，再将1和原始产物用索式提取器和三氯甲烷/乙腈混合溶剂分离，即可得到2。
本发明提供了制备所述的锝-99m标记的二巯基丁二酸酯类配合物的方法即放射性高锝酸盐(99mTcO4-)与二巯基丁二酸酯配体(DMSR/DMSR2)在还原剂的存在下反应制备得到所述的放射性锝-99m标记的二巯基丁二酸酯配合物。优选的制备方法为下述的湿法或冻干法 湿法 将高锝酸根99mTcO4-淋洗液(从医用99Mo-99mTc发生器获得)、还原剂与二巯基丁二酸酯配体DMSR/DMSR2)室温反应20分钟后，得到产物锝-99m标记的二巯基丁二酸酯配合物，该方法中还原剂与二巯基丁二酸酯配体的重量比为(0.1～10)∶(1～20)，因高锝酸根99mTcO4-为放射性示踪量，其化学量可以不考虑。
冻干法 将还原剂、赋形剂、稳定剂和二巯基丁二酸酯配体，按(0.1～10)∶(20～100)∶(1～20)∶(1～20)的重量比溶于充氮二次水中(充氮量要足以保证还原剂不被氧化)，无菌过滤后分装于容器中，经冷冻干燥后，加塞密封，得到冻干药盒；如果分装的溶剂为西林瓶，则每支冻干药盒还原剂用量为0.05mg～5mg，配体的含量为0.5mg～10mg。
将约18.5～185兆贝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(从医用99Mo-99mTc发生器获得)加入冻干药盒中，摇匀后室温反应5～20分钟，得到产物为锝-99m标记的二巯基丁二酸酯类配合物。
上述方法中，还原剂为SnCl2.2H2O、Na2S2O4或甲脒亚磺酸(FSA)，是将99mTc7+(99mTcO4-)还原为99mTc5+的常规化学试剂；赋形剂为甘露醇、葡萄糖、尿素；稳定剂为维生素C，是为保护冻干药盒中的还原剂以及决定冻干粉末外观，且不影响最终配合物制备的化学物质。
本发明提供的锝-99m标记的二巯基丁二酸酯类配合物制法简单、成本低。生物试验结果表明其在小鼠肿瘤模型中有很高的摄取和很好的滞留，具有较高的靶/非靶比值，适合用作肿瘤显像剂。
本发明提供了制备所述的锝氮核标记的二巯基丁二酸酯类配合物的方法即用SDH(以SnCl2.2H2O为还原剂，丁二酰二酰肼SDH为N3-离子提供体)药盒与放射性高锝酸盐(99mTcO4-)室温制备得到[99mTcN]2+中间体，然后与二巯基丁二酸酯配体发生配体交换反应，即得到所述的放射性锝氮核标记的二巯基丁二酸酯配合物。优选锝氮配合物制备方法为下述的湿法 将高锝酸根99mTcO4-淋洗液(从医用99Mo-99mTc发生器获得)与SDH(以SnCl2.2H2O为还原剂，丁二酰二酰肼SDH为N3-离子提供体)药盒室温反应20分钟后，制备得到[99mTcN]2+中间体(按CN02156871.5制备)，然后与二巯基丁二酸酯配体溶液发生配体交换反应，即得到所述的放射性锝氮核标记的二巯基丁二酸酯配合物，所述的配体二巯基丁二酸酯为0.5-5mg/ml。
本发明提供的锝氮核标记的二巯基丁二酸酯类配合物目前无文献报道，该配合物制法简单、成本低。生物试验结果表明其在小鼠肿瘤模型中有一定的摄取和很好的滞留，具有较高的靶/非靶比值，适合用作肿瘤显像剂。
本发明提供了制备所述的羰基锝标记的二巯基丁二酸酯类配合物的方法即用还原剂、CO和99mTcO4-淋洗液75℃水浴加热20分钟后制备得到[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体，然后与二巯基丁二酸酯配体发生配体交换反应，即得到所述的放射性羰基锝核标记的二巯基丁二酸酯配合物。
优选羰基锝配合物制备方法为下述的湿法 将高锝酸根99mTcO4-淋洗液(从医用99Mo-99mTc发生器获得)与碳酸钠、酒石酸钾钠、硼氢化钠、一氧化碳在75℃的水浴中持续加热20分钟，冷却，然后与二巯基丁二酸酯配体发生配体交换反应，即得到所述的放射性羰基锝核标记的二巯基丁二酸酯配合物。
本发明提供的羰基锝标记的二巯基丁二酸酯类配合物目前还无文献报导，该配合物制法简单、成本低。生物试验结果表明其在小鼠肿瘤模型中有一定的摄取和很好的滞留，具有较高的靶/非靶比值，适合用作肿瘤显像剂。
图1至图12为实例9中对四种中标记化合物分别进行荷H22型肝癌腹水瘤小鼠和荷Ca761乳腺癌615小鼠全身平面显像结果。图中(a)为H22肝癌腹水瘤小鼠模型；(b)为Ca761乳腺癌615小鼠模型。
图1为99mTc(V)-DMSA(a)(黑白) 图2为99mTc(V)-DMSEt(a)(黑白) 图3为99mTcN-DMSEt(a)(黑白) 图4为99mTcN-DMSEt2(a)(黑白) 图5为99mTc(CO)3-DMSA(a)(黑白) 图6为99mTc(CO)3-DMSEt(a)(黑白) 图7为99mTc(V)-DMSA(b)(黑白) 图8为99mTc(V)-DMSEt(b)(黑白) 图9为99mTcN-DMSEt(b)(黑白) 图10为99mTcN-DMSEt2(b)(黑白) 图11为99mTc(CO)3-DMSA(b)(黑白) 图12为99mTc(CO)3-DMSEt(b)(黑白)
具体实施例方式 以下通过具体的实施例进一步说明本发明的特点。
实例1 本实例为配体二巯基丁二酸酯(DMSR/DMSR2)的制备 1.配制200ml 1mol/L盐酸/ROH溶液利用乙酰氯与醇剧烈反应能产生HCl的原理 CH3COCl+ROH→CH3COOR+HCl 制备浓度约为1mol/L当量的盐酸/ROH溶液。实践证明该处理产生的酯类杂质不参与反应且在反应物过滤处理时除去，不影响实验。
以盐酸/甲醇(CH3OH)溶液为例，经计算吸取约16ml经重蒸处理的乙酰氯缓慢逐滴加入200ml色谱级甲醇中，边滴加边强烈搅拌混合均匀，用广泛pH试纸测量pH值在2～3之间。
2.配体二巯基丁二酸酯(DMSR/DMSR2)的合成 将8.017gmeso-DMSA加入刚配置的200ml 1mol/L当量的盐酸/ROH溶液中，强烈搅拌加热回流。反应一段时间后，将反应溶液冰盐浴迅速冷却至室温，旋蒸除去大量ROH，再加入100ml蒸馏水，将所得悬浊液在0℃下冷冻一小时抽滤得固体，用4×15ml蒸馏水洗涤，在空气中自然风干，再把风干后的固体中加入50ml氯仿中搅拌15分钟以溶解DMSR2，将剩余悬浊液抽滤，滤液保留，固体滤渣用3×10ml氯仿洗涤自然风干，滤液与前滤液合并保留。
将上述反应所得滤液旋蒸除去溶剂CHCl3，得到白色固体，用无水甲醇重结晶，得到白色针状晶体DMSR2 3.156g。
将反应得到的白色固体滤渣用滤纸包裹置于索氏提取器中，配置70ml 20％乙腈和80％氯仿(v/v)混合溶剂用索氏提取器对该固体提取24小时。反应停止后，将液体溶剂取出旋蒸出去大部分溶剂，剩余约35ml，静置冷却加入等量环己烷确保DMSR的完全沉淀，将所得沉淀过滤用3×20ml氯仿洗涤，风干得到白色固体DMSR 1.217g。
以R为Me(甲基)、Et(乙基)为例，以下为二巯基丁二酸甲酯(DMSMe)、二巯基丁二酸双甲酯(DMSMe2)、二巯基丁二酸乙酯(DMSEt)、二巯基丁二酸双乙酯(DMSEt2＞的产率、沸点、及相关光谱确定数据。
表1 DMSMe、DMSMe2、DMSEt、DMSEt2的产率，沸点，及相关光谱确定 实例2 本实例为二巯基丁二酸酯冻干药盒的制备(以制备100支为例) 称取二巯基丁二酸酯DMSR/DMSR2 200mg溶于40ml pH10.0硼砂-氢氧化钠缓冲溶液，加入Vc10mg(5mg/ml，2ml)，再加入含20mg SnCl2.2H2O的盐酸溶液中(10mg/ml，2ml)，用pH10.0硼砂-氢氧化钠调节pH为8.4～8.5之间。经无菌过滤后分装于100支青霉素小瓶中，然后置于冷冻干燥机中冷冻干燥24小时，加塞密封，得到冻干药盒。当二巯基丁二酸酯不同时可得到相应的冻干药盒。根据药盒产量以及对每只药盒中组分含量要求的不同，可调节SnCl2.2H2O、二巯基丁二酸的用量，使他们的重量比落在(0.1～10)∶(1～20)范围内。
实例3 本实例为90mTc-DMSMe的制备 1)湿法在0.5ml DMSMe溶液(4.0g/L)加入0.2mg SnCl2.2H2O的盐酸溶液(10mg/ml，0.1ml)，用pH10.0硼砂-氢氧化钠调节pH为8.4～8.5之间的西林瓶中，将约18.5～185兆贝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(从医用99Mo-99mTc发生器获得)加入该瓶室温反应15分钟，即得所需的99mTc-DMSMe 2)冻干法将约18.5～185兆贝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(从医用99Mo-99mTc发生器获得)加入到DMSMe药盒中，混匀后室温反应15分钟，即得到所需的99mTc-DMSMe配合物。
实例4 本实例为99mTc-DMSMe2的制备 1)湿法在0.5ml DMSMe2溶液(4.0g/L)加入0.2mg SnCl2.2H2O的盐酸溶液(10mg/ml，0.1ml)，用pH10.0硼砂-氢氧化钠调节pH为8.4～8.5之间的西林瓶中，将约18.5～185兆贝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(从医用99Mo-99mTc发生器获得)加入该瓶室温反应15分钟，即得所需的99mTc-DMSMe2 2)冻干法将约18.5～185兆贝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(从医用99Mo-99mTc发生器获得)加入到DMSMe2药盒中，混匀后室温反应15分钟，即得到所需的99mTc-DMSMe2配合物。
实例5 本实例为99mTc-DMSEt的制备 1)湿法在0.5ml DMSEt溶液(4.0g/L)加入0.2mg SnCl2.2H2O的盐酸溶液(10mg/ml，0.1ml)，用pH10.0硼砂-氢氧化钠调节pH为8.4～8.5之间的西林瓶中，将约18.5～185兆贝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(从医用99Mo-99mTc发生器获得)加入该瓶室温反应15分钟，即得所需的99mTc-DMSEt 2)冻干法将约18.5～185兆贝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(从医用99Mo-99mTc发生器获得)加入到DMSEt药盒中，混匀后室温反应15分钟，即得到所需的99mTc-DMSEt配合物。
实例6 本实例为99mTc-DMSEt2的制备 1)湿法在0.5ml DMSEt2溶液(4.0g/L)加入0.2mg SnCl2.2H2O的盐酸溶液(10mg/ml，0.1ml)，用pH10.0硼砂-氢氧化钠调节pH为8.4～8.5之间的西林瓶中，将约18.5～185兆贝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(从医用99Mo-99mTc发生器获得)加入该瓶室温反应15分钟，即得所需的99mTc-DMSEt2 2)冻干法将约18.5～185兆贝可(MBq)99mTcO4-淋洗液(从医用99Mo-99mTc发生器获得)加入到DMSEt2药盒中，混匀后室温反应15分钟，即得到所需的99mTc-DMSEt2配合物。
实例7 本实例为99mTcN-DMSR，99mTcN-DMSR2的制备 1)[99mTcN]int2+中间体的制备。
将1.0mL99mTcO4-(约37MBq)加入到含有5.0mgSDH，5.0mgPDTA(1，2-丙二胺四乙酸)和0.05mg SnCl2.2H2O的冻干药盒中，充分摇匀，置于室温下反应15min。
2)99mTcN-DMSR，99mTcN-DMSR2的制备 取0.2ml上述中间体溶液，用0.1mol/LHCl调节pH在2～3之间，将0.2ml 6mg/mlDMSA衍生物DMSR/DMSR2如DMSMe、DMSMe2、DMSEt、DMSEt2(含配体1mg)的生理盐水溶液分别加入上述溶液中，室温下反应15min即得。
实例8 本实例为99mTc(CO)3-DMSR，99mTc(CO)3-DMSR2的制备 取4毫克碳酸钠、15毫克酒石酸钾钠、10毫克硼氢化钠装入10毫升的青霉素小瓶，密封，然后通一氧化碳15分钟，再注入0.5毫升99mTcO4-洗脱液(约18.5-185MBq)。在75℃的水浴中持续加热20分钟，制备得到羰基锝中间体，然后用1mol/L的稀盐酸中和至中性，加入2mg/mlDMSR/DMSR2水溶液1ml。调节pH值在2-3之间。室温放置15分钟左右，即得。
实例9 本实例为对99mTc-DMSR/99mTc-DMSR2、99TcmN-DMSR/99TcmN-DMSR2、99mTc(CO)3-DMSR/99mTc(CO)3-DMSR2的性能测定。
1.层析鉴定 1)99mTc-DMSR/99mTc-DMSR2的层析鉴定(结果见表2-5) 99mTc-DMSR用生理盐水为展开剂，聚酰氨薄片为载体如表由此可将产物99mTc-DMSR与99mTcO4-、99mTcO2.nH2O、99mTc-Sn胶体分开，并以此计算产物的放射化学纯度。
表2 99mTc-DMSR的层析鉴定 99mTc-DMSR2用乙腈为展开剂，聚酰氨薄片为载体，如表由此可将产物99mTc-DMSR2与99mTcO4-、99mTcO2.XH2O、99mTc-Sn胶体分开，并以次计算产物的放射化学纯度。
表3 99mTc-DMSR2的层析鉴定 2)对99TcmN-DMSR/99TcmN-DMSR2的层析鉴定描述如下 表4 99TcmN-DMSR/99TcmN-DMSR2的层析鉴定结果 3)对99mTc(CO)3-DMSR/99mTc(CO)3-DMSR2的层析鉴定描述如下用乙腈为展开剂，聚酰氨薄片为载体 表5 99mTc(CO)3-DMSR/99mTc(CO)3-DMSR2的层析鉴定结果 2.脂水分配系数的测定(结果见表6-7) 配好静置一天的正辛醇-PBS液中，先取上层正辛醇2ml，再用长针头注射器取下层PBS液1.9ml加入同一只离心试管中，最后取0.1ml按实施例制备好放射化学纯度大于95％的99mTc-DMSR、99mTc-DMSR2；99TcmN-DMSR、99TcmN-DMSR2配合物溶液加入这只离心试管，用涡旋混合器振荡3～5分钟，充分混匀，体系达到平衡，再放入离心沉淀器中离心5分钟，使水相和有机相分开，在有机相和水相中分别平行取3个样，每个样0.3ml，用井型γ计数器测量其放射性活度，每个样品平行做3次脂水分配系数测定。
表6 99mTc-DMSR/99mTc-DMSR2(RMe、Et)衍生物脂水分配系数测定值 表7 99mTcN-DMSR/99mTcN-DMSR2(RMe、Et)衍生物脂水分配系数测定值 3.99mTc-DMSR/99mTc-DMSR2、99mTcN-DMSR/99mTcN-DMSR2、99mTc(CO)3-DMSR/99mTc(CO)3-DMSR2的体外稳定性测定 分别将按实施例制备好的99mTc-DMSR/99mTc-DMSR2、99mTcN-DMSR/99mTcN-DMSR2、99mTc(CO)3-DMSR/99mTc(CO)3-DMSR2(R＝Me、Et)配合物溶液在室温下放置不同时间(1、2、3、4、5和6小时)，然后进行点样层析分析，计算放射化学纯度。实验结果表明99mTc-DMSR/99mTc-DMSR2、99mTcN-DMSR/99mTcN-DMSR2、99mTc(CO)3-DMSR/99mTc(CO)3-DMSR2在室温下可稳定存在6小时以上，其外观和放射化学纯度均无明显变化。
4.99mTc-DMSR/99mTc-DMSR2、99mTcN-DMSR/99mTcN-DMSR2、99mTc(CO)3-DMSR/99mTc(CO)3-DMSR2(以R为Me、Et为例)在小鼠体内生物分布(结果见表8-10) 将实施3-9分别制备好放射化学纯度大于95％的99mTc-DMSR/99mTc-DMSR2、99mTcN-DMSR/99mTcN-DMSR2、99mTc(CO)3-DMSR/99mTc(CO)3-DMSR2(R甲基、乙基)，溶液，从正常昆明小鼠(18～22g)，尾静脉注射0.1ml(30μCi)的剂量，在注射后两小时将其断颈处死，取血及脑、心、肝、肺、脾、肾、骨、肌肉等脏器和组织，用吸血纸擦静后称重，并在γ计数仪上测定放射性技术，计算各单位质量组织的摄取剂量占总注射剂量的百分数(ID％/g)。百分之一注射剂量的计算是取0.1ml(注射量)配合物溶液，稀释至100倍后(加入9.9ml)分别取0.1ml于三只试管中，在测量组织放射性计数的同时测量其放射性计数，百分之一剂量为3只试管放射性计数的平均值。
表8 各标记化合物正常小鼠单位质量组织剂量分布(
Time＝120min，n＝3) 由上述初步的正常小鼠体内代谢实验数据及图表分析可以看出，正常小鼠静脉注射后120min四种新的锝标记DMSA衍生物99mTc(V)-DMSMe、99mTc(V)-DMSMe2、99mTc(V)-DMSEt、99mTc(V)-DMSEt2对比99mTc(V)-DMSA肝摄取及肝/血依次增加，骨摄取及骨/血显著降低，表明在99mTc(V)-DMSA中引入酯基能显著降低骨摄取，初步肯定了我们设计这类化合物作为软组织肿瘤显像剂与99mTc(V)-DMSA软组织肿瘤显像剂相比较骨干扰会降低的设计思路，值得进一步研究。
表9 99mTc(V)-DMSA、99mTc-DMSEt、99mTc-DMSEt2、99mTcN-DMSEt(pH＝8～9)各单位质量组织剂量分布(
n＝5) 99mTc(V)-DMSA骨摄取和肾摄取较高，并且在静脉注射后30min-3h骨摄取及骨/血持续增加，作为软组织肿瘤显像剂会对其显像软组织肿瘤带来不可避免的骨干扰。按半小时的ID％/g排列顺序为骨、肾、血、肺、肝、心、肉、脾，可见99mTc(V)-DMSA主要通过肾和泌尿系统排泄； 99mTc(V)-DMSEt2与99mTc(V)-DMSA相比，肝及肝/血显著增高，血摄取显著增高，肾摄取显著增加，肾/血降低，骨摄取及骨/血显著降低； 99mTc(V)-DMSEt与99mTc(V)-DMSA相比，肝及肝/血显著增高，血摄取显著增高，肾摄取增加，肾/血降低；骨摄取及骨/血显著低于99mTc(V)-DMSA； 与99mTc(V)-DMSA、99mTc(V)-DMSEt、99mTc(V)-DMSEt2相同pH值条件下制备的99mTcN-DMSEt(pH＝8～9)的肝及肝/血均高于99mTc(V)-DMSA，骨摄取及骨/血显著降低，其他脏器代谢与99mTc(V)-DMSA基本类似。
正常小鼠体内生物分布实验结果达到设计时预想的降低软组织肿瘤显像剂99mTc(V)-DMSA骨干扰的目的，为进行荷瘤小鼠的生物分布实验提供了前提和打下了基础。
表10 99mTcN-DMSEt、99mTcN-DMSEt2正常小鼠体内各单位质量组织剂量分布 (
Time＝120min，n＝5) 由上述初步的正常小鼠体内代谢实验数据及图表分析可以看出，正常小鼠静脉注射120分钟后99mTcN-DMSEt、99mTcN-DMSEt2的肝摄取和肾摄取较高，99mTcN-DMSEt2肝摄取比99mTcN-DMSEt显著增高且高于肾摄取。两种标记化合物的骨摄取都较低 5.99mTc-DMSR/99mTc-DMSR2、99mTcN-DMSR/99mTcN-DMSR2、99mTc(CO)3-DMSR/99mTc(CO)3-DMSR2(REt)在荷瘤小鼠模型体内生物分布 (1)取标记化合物99mTc(V)-DMSA、99mTc(V)-DMSEt从荷H22型肝癌腹水瘤小鼠模型尾静脉注射0.1ml(50μCi)的剂量，在注射后4小时，6小时各处死五只，取血及心、肝、肺、脾、肾、骨、肌肉和肿瘤等主要组织器官，用吸血纸擦静后称重，并在γ计数仪上测定放射性技术，计算各单位质量组织的摄取剂量占总注射剂量的百分数(ID％/g)。百分之一注射剂量的计算是取0.1ml(注射量)配合物溶液，稀释至100倍后(加入9.9ml)分别取0.1ml于三只试管中，在测量组织放射性计数的同时测量其放射性计数，百分之一剂量为3只试管放射性计数的平均值。99mTcN-DMSEt由于荷瘤小鼠数量有限，只于注药后6小时处死5只。
(2)取标记化合物99mTc(V)-DMSA、99mTc(V)-DMSEt、99mTcN-DMSEt从荷Ca76 1乳腺癌615小鼠模型尾静脉注射0.1ml(50μCi)的剂量，在注射后4小时各处死五只，取血及心、肝、肺、脾、肾、骨、肌肉和肿瘤等主要组织器官，用吸血纸擦静后称重，并在γ计数仪上测定放射性技术，计算各单位质量组织的摄取剂量占总注射剂量的百分数(结果见表11) 表11 99mTc(V)-DMSA、99mTc(V)-DMSEt、99mTcN-DMSEt在荷H22型肝癌腹水瘤小鼠模型体内生物分布结果(
n＝5) 99mTc(V)-DMSA在肾和骨中的摄取较它在其他脏器中的摄取最高，其中骨摄取非常高，这就对它显像肿瘤造成了非常重大的干扰。99mTc(V)-DMSEt肝摄取和肾摄取较高，并且较其他脏器而言，肝摄取最高，骨摄取远小于99mTc(V)-DMSA，能显著降低显像肿瘤时的骨干扰，同时99mTc(V)-DMSEt在4h的肿瘤摄取要高于99mTc(V)-DMSA，6小时与99mTc(V)-DMSA基本一致，说明论文对DMSA的改进并没有降低肿瘤摄取，是可喜的现象之一。
同时99mTc(V)-DMSEt血摄取比其他两个标记化合物99mTc(V)-DMSA、99mTcN-DMSEt都要高，这就使得瘤/骨、瘤/肉虽然都高于其他两个标记化合物，但瘤/血比却较低，是值得进一步研究和改进的方向。
99mTcN-DMSEt在肝和肾中的摄取很高，并且肾的摄取高于99mTc(V)-DMSA，在这三个标记化合物中它的肿瘤摄取值是最低的，但后续SPECT显像结果效果要好于99mTc(V)-DMSA，可能主要是因为骨干扰降低的原因。
(3)99mTc(V)-DMSA、99mTc(V)-DMSEt、99mTcN-DMSEt在荷Ca761乳腺癌小鼠模型体内生物分布结果如表12所示 表12 99mTc(V)-DMSA、99mTc(V)-DMSEt、99mTcN-DMSEt在荷H22型肝癌腹水瘤小鼠模型体内生物分布结果(
n＝5) 99mTc(V)-DMSA在肾和骨中的摄取较它在其他脏器中的摄取最高，其中骨摄取非常高，导致瘤/肾，瘤/骨均小于1，对它显像肿瘤造成了非常重大的干扰。本发明的99mTc(V)-DMSEt肝摄取和肾摄取较高，并且较其他脏器而言，肝摄取最高，骨摄取远小于99mTc(V)-DMSA，能显著降低显像肿瘤时的骨干扰，同时99mTc(V)-DMSEt在这种肿瘤模型小鼠中的生物分布结果表明4h的肿瘤摄取要高于99mTc(V)-DMSA同时99mTc(V)-DMSEt血摄取比其他两个标记化合物99mTc(V)-DMSA、99mTcN-DMSEt都要高，这就使得瘤/骨虽然较高但瘤/血却较低，是值得进一步研究和改进的方向同时瘤/肝小于1。
99mTcN-DMSEt在肝和肾中的摄取很高，并且肾的摄取高于99mTc(V)-DMSA，在荷Ca761乳腺癌615小鼠模型中它的肿瘤摄取值高于99mTc(V)-DMSA。
6.99mTc(V)-DMSA、99mTc(V)-DMSEt、99mTcN-DMSEt、99mTcN-DMSEt2肿瘤模型显像 取荷H22肝癌腹水瘤小鼠模型和荷Ca761乳腺癌615小鼠模型各一只四组，分别从尾静脉注入0.2ml，约1mCi的99mTc(V)-DMSA、99mTc(V)-DMSEt、99mTcN-DMSEt，99mTcN-DMSEt2，将小鼠捆绑，仰卧位固定，于注药后4.5小时置SPECT显像；采集条件能峰140Kev、窗宽20％、矩阵256×256、放大倍数3.2倍、每只小鼠采集计数200万，显像后处死，解剖。取心、肝、肺、脾、肾、骨、肌肉和肿瘤等主要组织器官，用吸血纸擦静后称重，并在γ计数仪上测定放射性技术，计算各单位质量组织的摄取剂量占总注射剂量的百分数(ID％/g)。
肿瘤模型显像结果 (1)对四种标记化合物99mTc(V)-DMSA、99mTc(V)-DMSEt、99mTcN-DMSEt、99mTcN-DMSEt2分别进行了荷H22型肝癌腹水瘤小鼠和荷Ca761乳腺癌615小鼠全身平面显像。结果如图1至图12所示。
(2)将上述用于SPECT全身平面显像的荷H22肝癌腹水瘤小鼠模型及荷Ca761乳腺癌615小鼠模型于显像后处死(注射后4.5h)后解剖，所得生物数据如表13-14所示 表1399mTc(V)-DMSA、99mTc(V)-DMSEt、99mTcN-DMSEt、99mTcN-DMSEt2荷H22肝癌腹 水瘤小鼠模型SPECT全身平面显像后解剖体内生物分布数据(ID％/g，Time＝4.5h) 结论 99mTc(V)-DMSA在肿瘤组织中有一定的摄取，在肾和骨中的摄取较它在其他脏器中的摄取最高瘤/肾＜1，瘤/骨＜1，99mTc(V)-DMSEt肿瘤摄取值高于其他三种标记化合物，在肝中的摄取最高，肾摄取也较高，瘤/肝＜1，瘤/肾＜1。99mTcN-DMSEt肿瘤摄取低于99mTc(V)-DMSA，在肝和肾中的摄取很高肾摄取高于99mTc(V)-DMSA，瘤/肝＜1，瘤/肾＜1，瘤/肺＜1，99mTcN-DMSEt2肿瘤摄取值最低，在肝和肾中的摄取很高，瘤/肝＜1，瘤/肾＜1，瘤/肺＜1肿瘤显像结果表明 99mTc(V)-DMSA在瘤体部位显影不明显但解剖数据中在肿瘤部位有一定的摄取。由于骨摄取高，导致全身放射性本底较高。
99mTc(V)-DMSEt在瘤体部位放射性浓聚明显，肝、双肾及膀胱均有显影。99mTcN-DMSEt在瘤体部位放射性浓聚明显，肝、双肾显影明显，其他部位本底较低。
99mTcN-DMSEt2在瘤体部位放射性有一定的放射性浓集。肝、双肾显影明显，其他部位本底很低。
表14 99mTc(V)-DMSA，99mTc(V)-DMSEt，99mTcN-DMSEt，99mTcN-DMSEt2荷Ca761乳腺癌小鼠模型SPECT全身平面显像后解剖体内生物分布数据(ID％/g，Time＝4.5h) 99mTc(V)-DMSA在肿瘤组织中有一定的摄取，在肾和骨中的摄取较它在其他脏器中的摄取最高瘤/肝＜1、瘤/肾＜1、瘤/骨＜1，99mTc(V)-DMSEt肿瘤摄取值高于其他三种标记化合物，在肝中的摄取最高，肾摄取也较高，瘤/肝＜1。99mTcN-DMSEt肿瘤摄取低于99mTc(V)-DMSA，在肝和肾中的摄取很高肾摄取高于99mTc(V)-DMSA，瘤/肝＜1，瘤/肾＜1，99mTcN-DMSEt2肿瘤摄取值最低，在肝和肾中的摄取很高，瘤/肝＜1，瘤/肾＜1，瘤/肺＜1。解剖结果与SPECT显像结果基本一致，Ca761模型小鼠肿瘤显像结果表明 99mTc(V)-DMSA在瘤体部位有一定的放射性浓集，但由于骨摄取高，导致全身放射性本底较高。
99mTc(V)-DMSEt得到了非常好的显像图形，放射性绝大部分浓集于瘤体部位和肝，其他部位放射性本底非常低。而解剖数据也验证了这一点99mTc(V)-DMSEt肿瘤摄取(％ID/g)为0.71，是99mTc(V)-DMSA0.39的1.87倍，瘤/骨为5.07，是99mTc(V)-DMSA瘤/骨0.23的22.04倍，说明在该种模型小鼠实验中，DMSA中引入乙基能显著降低骨摄取，同时肿瘤摄取不但并没有受到影响，反而有所增加，得到了非常好的肿瘤显像图形。
99mTcN-DMSEt在瘤体部位放射性浓聚明显，肝、双肾显影明显，其他部位本底较低。
99mTcN-DMSEt2在瘤体部位放射性有一定的放射性浓集。肝、双肾显影明显，其他部位本底较低。
从数据可以看出99mTc(V)-DMSEt在肿瘤摄取要高于其他三种标记化合物的情况下，其他脏器的摄取值较低，导致放射性本底较低，这使得它得到肿瘤显像效果图。
可见在DMSA中引入酯基能显著降低骨摄取，从而降低了骨摄取对于肿瘤显像的干扰，同时这一改进并没有影响标记化合物在肿瘤中的摄取，得到了较好的肿瘤显像图形，这一显像结果与解剖数据相符。
这两种模型小鼠SPECT全身平面显像结果及解剖数据对比亦表明，选择荷Ca761乳腺癌小鼠模型进行DMSA类配体标记化合物肿瘤摄取研究效果比荷H22肝癌腹水瘤模型小鼠效果更好。
根据配合物在肿瘤模型小鼠体内的显像结果，认为其具有发展为新型肿瘤显像剂的潜质。99mTc-DMSR/99mTc-DMSR2、99mTcN-DMSR/99mTcN-DMSR2、99mTc(CO)3-DMSR/99mTc(CO)3-DMSR2是本发明人研制出的一类新的99mTc标记的二巯基丁二酸酯类配合物，与现有的99mTc-DMSA的化学组份不同，其中配体DMSR/DMSR2，R为C1～C5烷基或环己基；特别是当R为Et时，配合物表现出优良的生物性能，在肿瘤中有较高的摄取，除放射性绝大部分浓集于瘤体部位和肝脏，其他部位本底很低。与现有的软组织肿瘤显像剂99mTc-DMSA的明显不同之处在于后者的骨摄取非常高造成很大的干扰，而本发明最突出的优点是克服了99mTc-DMSA的不足之处，骨摄取非常低，99mTc(V)-DMSEt在荷Ca761乳腺癌615小鼠模型中得到了非常好的平面显像效果和生物分布结果，除放射性绝大部分浓集于瘤体部位和肝脏，其他部位本底很低。DMSR/DMSR2，均为有机小分子，合成简单，标记方法成熟且容易得到高放射化学纯度的配合物，存放时间长，价格低廉。
本发明所述的配合物为新的锝-99m标记二巯基丁二酸类配合物。从小鼠的生物分布数据来看，本发明所述的配合物，特别是99mTc(V)-DMSEt、99mTcN-DMSEt的生物性能优良，有望发展为一类具有我国自主知识产权的锝-99m标记肿瘤显像剂。
该类配合物能在室温下稳定存在6小时以上为其临床上应用打下基础；生物分布实验结果表明该类配合物在肿瘤模型小鼠流体组织中有很高的摄取和很好的滞留，而且非靶本底尤其是骨本底的摄取较99mTc-DMSA显著降低，具有较高的靶/非靶比值。初步的SPECT显像实验支持了生物分布实验结果，表明该类配合物具有用于肿瘤显像的潜质。
因此，本发明的放射性锝-99m标记二巯基丁二酸类配合物其具有制法简单，成本低，效果好的优点，可望成为一种具有良好前景的新型肿瘤显像剂。
权利要求
1.一类放射性锝-99m标记的二巯基丁二酸酯类配合物，其特征在于，以99mTc(V)、99mTcN(II)、99mTc(I)(CO)3为中心核，与其配位的是二巯基丁二酸酯类配体，其结构式分别为[99mTcO(DMSR)2]-/[99mTcO(DMSR2)2]-、[99mTcN(DMSR2)2]2-/[99mTcN(DMSR2)2]2-、[99mTc(CO)3(DMSR)2]/[99mTc(CO)3(DMSR2)2]，其中用式DMSR/DMSR2表示的配体中R为C1～C5烷基或环己基。
2.根据权利要求1所述的放射性锝-99m标记的二巯基丁二酸酯类配合物，其特征在于，所述的C1～C5烷基是指具有1～5个碳原子的直链或支链的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基在内的任一种。
3.根据权利要求1所述的放射性锝-99m标记的二巯基丁二酸酯类配合物，其特征在于R为甲基或乙基。
4.权利要求1所述的放射性锝-99m标记的二巯基丁二酸酯类配合物的制备方法，其特征在于按下列湿法制备
将高锝酸根99mTcO4-淋洗液、还原剂与二巯基丁二酸酯配体室温反应20分钟后，得到产物锝-99m标记的二巯基丁二酸酯配合物，所述的还原剂与二巯基丁二酸酯配体的重量比为(0.1～10)∶(1～20)。
5.权利要求1所述的放射性锝-99m标记的二巯基丁二酸酯类配合物的制备方法，其特征在于，按下述冻干法制备
(1)将还原剂、赋形剂、稳定剂和二巯基丁二酸酯配体DMSR/DMSR2，按(0.1～10)∶(20～100)∶(1～20)∶(1～20)的重量比溶于充氮二次水中，无菌过滤后分装于容器中，经冷冻干燥后，加塞密封，得到冻干药盒；
(2)将18.5～185兆贝可(MBq)99mTcO4-淋洗液加入到DMSR/DMSR2药盒中，混匀后室温反应15分钟，即得到所需的99mTc-DMSR/99mTc-DMSR2配合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的分装容器为西林瓶，每只冻干药盒还原剂用量为0.05mg～5mg，配体的含量为0.5mg～50mg。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述的还原剂为SnCl2.2H2O、Na2S2O4或甲脒亚磺酸，所述的赋形剂为甘露醇、葡萄糖或尿素，所述的稳定剂为维生素C。
8.权利要求1所述配合物的制备方法，其特征在于所述的锝氮标记的二巯基丁二酸之类配合物的制备过程如下用SDH(以SnCl2.2H2O为还原剂，丁二酰二酰肼SDH为N3-离子提供体)药盒与放射性高锝酸盐(99mTcO4-)室温制备得到[99mTcN]2+中间体，然后与二巯基丁二酸酯配体发生配体交换反应，即得到所述的放射性锝氮核标记的二巯基丁二酸酯配合物。优选锝氮制备方法为下述的湿法
将高锝酸根99mTcO4-淋洗液(从医用99Mo-99mTc发生器获得)、与SDH(以SnCl2.2H2O为还原剂，丁二酰二酰肼SDH为N3-离子提供体)药盒室温反应20分钟后，制备得到[99mTcN]2+中间体，然后与二巯基丁二酸酯配体溶液发生配体交换反应，即得到所述的放射性锝氮核标记锝二巯基丁二酸酯配合物。
9.权利要求1所述配合物的制备方法，其特征在于所述的羰基锝标记的二巯基丁二酸酯类配合物的制备过程用还原剂、CO和99mTcO4-淋洗液75℃水浴加热20分钟后制备得到[99mTc(CO)3(H2O)3]+中间体，然后与二巯基丁二酸酯配体发生配体交换反应，即得到所述的放射性羰基锝核标记的二巯基丁二酸酯配合物，优选羰基锝制备方法为下述的湿法
将高锝酸根99mTcO4-淋洗液(从医用99Mo-99mTc发生器获得)、与碳酸钠、酒石酸钾钠、硼氢化钠，一氧化碳在75℃的水浴中持续加热20分钟，冷却，然后与二巯基丁二酸酯配体发生配体交换反应，即得到所述的放射性羰基锝核标记的二巯基丁二酸酯配合物。
10.权利要求1所述的放射性锝-99m标记的二巯基丁二酸酯类配合物在制备肿瘤显像剂中的应用。
全文摘要
本发明是一类锝－99m标记的二巯基丁二酸酯类配合物及其制备方法和应用，其特点是配合物，以99mTc(V)、99mTcN(22)、99mTc(I)(CO)3为中心核，与其配位的二巯基丁二酸酯类配体，用式DMSR/DMSR2表示，其中R为C1～C5烷基或环己基。本发明配合物是按湿法或冻干法制备，用作肿瘤显像剂，具有制备简单、价格便宜以及靶/非靶比值较高的优点。
文档编号C07C323/00GK101085787SQ200610087330
公开日2007年12月12日 申请日期2006年6月8日 优先权日2006年6月8日
发明者王学斌, 易鹏, 张现忠, 张俊波, 陆洁, 唐志刚, 杨树业 申请人:北京师范大学