一种^99mTc肿瘤显像药物脑靶向脂质体制剂及其应用的制作方法

专利名称：一种^99mTc肿瘤显像药物脑靶向脂质体制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种99mTc肿瘤显像药物脑靶向脂质体制剂及其在人体和动物器官显 像中的应用，尤其是在脑瘤早期诊断中的应用，属于放射性药物学和药物制剂学技术领域。
背景技术：
流行病学研究显示，我国肿瘤患者死亡率呈明显上升趋势。早期诊断和治疗会 给肿瘤患者带来更多治愈的机会和更好的效果。临床上常用的非特异性肿瘤显像剂有 99mTc-甲氧基异丁基异腈(99mTc-MIBI) ,99mTc(V)-二巯基丁二酸钠(DMSA) ,67Ga-枸橼酸盐 (citrate) ,201TlCl 等。目前，85%的核医学临床诊断药物是99mTc-放射性药物。但是，迄今为止，尚未 有一种99mTc标记的脑瘤显像剂能够适用于临床显像研究。由于血脑屏障(blood brain barrier, BBB)的存在，脑瘤的早期诊断一直是诊断界的难题。基于BBB的结构功能特点， 药物跨越BBB的途径有以下四种开放BBB上微血管内皮细胞间的紧密连接增加药物的通 透性；修饰药物制成前体药物通过脂溶性实现融膜扩散；利用MDR逆转运对抗ρ-糖蛋白 (p-gp)外排作用；特异受体介导的吞饮。众所周知，发现一个容易跨越BBB的脂溶性分子 量小于500道尔顿的新药并非一件易事，而一个给药系统的研究成功将会给已知的CNS药 物带来新的应用前景。脂质体作为一种新型药物载体(脂质体为磷脂在水中分散而得，其 在结构上为单层或多层泡囊。而且脂质体具有生物相容性和生物可降解性)，将药物载于趋 脑性脂质体中，通过脂质体与细胞的融合、内吞等相互作用是增加药物脑摄入的一种方法。 缓激肽类似物RMP-7已被报道是靶向BBB的良好导向化合物，但由于它开放BBB的时效性， RMP-7在向FDA申报临床III期中被停滞。本发明发现用DSPE-PEG-NHS键合RMP-7后，制 备的主动靶向脂质体将大大降低其毒性，更有利于RMP-7的应用，经文献检索，未发现关于 RMP-7毒性改善的相关报道。为实现99mTc显像药物在脑瘤诊断中的应用，本发明采用脂质体和主动靶向脂质体 包载99mTc药物。以99mTcN-NOET(99mTc-氮-(N-乙基-N-乙氧基二硫代氨基甲酸盐))为示例 药物，研制99mTcN-NOET药物脂质体制备工艺及处方优选；经动物实验研究发现99mTcN-NOET 脂质体血管给药后在小鼠脑组织的分布以及SPECT显像效果均好于游离的99mTcN-N0ET。说 明99mTc显像药物脂质体制剂在脑瘤临床诊断上较游离99mTc药物具有更广阔的应用前景。 经文献检索，目前没有99mTc显像药物脂质体制剂在脑部肿瘤中应用的研究报道。

发明内容
1.本发明的创新点之一在于发现以缓激肽类似物RMP-7作为导向分子制备的主 动靶向脂质体可明显降低RMP-7无效开放BBB的可能性，此种给药系统更有利于载药。缓激肽类似物RMP-7能够和BBB上微血管内皮细胞上的B2受体相互作用增加血管 通透性。其暂时性无效开放BBB会造成脑脊液蛋白或其他有毒物质流入脑组织，因此RMP-7 在向FDA申请临床III期实验时被停滞。本发明通过将RMP-7与DSPE-PEG-NHS键合后形成的DSPE-PEG-RMP-7插入脂质体膜，制备主动靶向脂质体，大鼠静脉给药后，死亡率为0%。 细胞活性实验发现RMP-7接在脂质体上其活性未发生改变。因此将RMP-7作为导向分子接 在脂质体上不仅能继续发挥其靶向BBB的作用，而且毒性明显降低。2.该发明的创新点之二是提出用脑靶向脂质体包载99mTc显像药物。首次提出了用脑靶向脂质体包载99mTc显像药物的理念，以99mTcN-NOET (99m 锝-氮-N-乙基-N-乙氧基二硫代氨基甲酸盐))为示例药物(其为脂溶性心肌灌注显像 剂和肿瘤显像剂)，采用脂质体包载99mTc药物可以解决其水溶解度问题，方便给药。此外脑 靶向脂质体包载99mTc药物能改变其在体内的组织分布，使其在脑部肿瘤处浓集。99mTc药物 用脂质体包载的特征为脂质体由磷脂在水中分散而得，其在结构上为单层或多层微囊。脂 溶性99mTc药物插在双分子脂膜上(见附图1)。脂质体与由表面活性剂构成的胶团不同，其 在体液中被稀释时，不会因浓度降低而破裂，具有较好的包载99mTc药物能力。磷脂是生物 膜的组成成分，具有生物降解性和生物相容性，因此脂质体是99mTc药物一个良好药物载体。3.该发明的创新点之三在于99mTc显像药物脂质体的制备工艺。制备脂质体的材料主要是磷脂和胆固醇。磷脂可以采用天然大豆磷脂(主要成分 为磷脂酰胆碱)，蛋黄卵磷脂以及二硬脂酰磷脂酰胆碱，棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)，磷脂酰 丝氨酸，磷脂酸，氢化卵磷脂等。这里优选天然大豆卵磷脂(纯度> 95% )。制备99mTc药物脂质体的方法有薄膜分散法、逆向蒸发法，复乳法，冻融法，钙诱导 融合法，注入法等。优选薄膜分散法。取适量大豆卵磷脂SPC，胆固醇CHol和适量99mTc药物， 用合适的油相溶解后，25 30°C下旋转减压蒸发成膜。然后补充一定量的生理盐水使其水 化，超声5min后分散成均勻的脂质体混悬液。此法得到的99mTc药物普通脂质体特征为透 明液体，具有蓝色乳光，包封率为99%，平均粒径小于30nm。若在普通脂质体中加入适量二 硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-RMP-7 (DSPE-PEG-RMP-7)孵育Ihour后得到99mTcN-NOET 脑靶向脂质体，其特征亦为透明液体，具有蓝色乳光，包封率为99%，平均粒径小于30nm。99mTc药物脂质体制备工艺中旋转蒸发成膜和超声时间不超过5min，孵育时间不超 过1小时，有利于保持99mTc药物的放射性活度。上述脂质体制备工艺用于99mTc药物未见 报道。在脂质体制备工艺中，由于99mTc药物放射性活度高，而化学质量很小，因此脂材SPC 和CHol使用量小，整个制备工艺属于微量操作，脂质体浓度低于0. 2mg/ml，有别于常规脂 质体制剂。微量法的制备工艺以及快速操作得到小粒径半衰期短的99mTc显像药物制剂属 于方法创新。4.该发明的创新点之四在于发现99mTc药物脂质体制剂在诊断脑瘤中具有更好的 优势。由于血脑屏障的存在，长期以来限制了显像药物在中枢神经系统方面的应用。用 脂质体包载99mTcN-NOET后，静脉给药，能明显增加99mTcN-NOET在小鼠脑组织的药物浓度， 主动靶向脂质体效果更佳。经给荷C6脑胶质瘤模型大鼠的SPECT显像后发现，99mTcN-NOET 主动脑靶向脂质体组的肿瘤显像明显，99mTc药物脑靶向脂质体静脉给药有望在脑瘤的诊断 中发挥作用。
具体实施例方式实施例1以缓激肽类似物RMP-7为导向分子的主动靶向脂质体制备工艺和毒性
取适量DSPE-PEG-NHS和RMP-7分别用0. lmol/L的HEPES缓冲液溶液溶解；然后 在4°C冰柜中将DSPE-PEG-NHS缓慢滴加到RMP-7的溶液中，缓慢搅拌，4°C下反应12小时后 加入过量的0. lmol/L甘氨酸终止反应。反应液于_40°C，0. 22mbar下冷冻干燥24小时即 得到DSPE-PEG-RMP-7，RMP-7完全反应，无残留。将DSPE-PEG-RMP-7用生理盐水溶解后缓 慢滴加到脂质体中，缓慢搅拌，DSPE-PEG-RMP-7的疏水端靠疏水相互作用自动插入到脂质 体的脂膜上形成主动靶向脂质体。SD大鼠静脉注射RMP-7，每日一次，注射14日，大鼠死亡率为33 % ；同样注射主动 靶向脂质体14日，大鼠死亡率为0%。RMP-7为导向分子制备的主动靶向脂质体明显降低 其无效开放BBB引起的毒性。实施例299mTc药物(以99mTcN-NOET为示例)脂质体制备工艺按优化处方取适量大豆卵磷脂SPC，胆固醇CHol和适量99mTc药物，用合适的油相 溶解后，25 30°C下旋转减压蒸发成膜。然后补充一定量的生理盐水使其水化，超声5min 后分散成均勻的脂质体混悬液。此法得到的99mTc药物普通脂质体特征为透明液体，具有蓝 色乳光，包封率为99%，平均粒径小于30nm。若在普通脂质体中加入适量DSPE-PEG-RMP-7 和DSPE-PEG孵育Ihour后得到99mTcN-NOET脑靶向脂质体，其特征亦为透明液体，具有蓝色 乳光，包封率为99%，平均粒径小于30nm。其优化处方磷脂与胆固醇的比例为6 1 2 1(重量比)，磷脂与RMP-7比例为15 1 50 1 (重量比)，磷脂与DSPE-PEG比例为8 1 3 1 (重量比)实施例399mTc药物(以99mTcN-NOET为示例)脂质体静脉给药用于脑瘤诊断1.99mTcN-NOET脂质体静脉给药的小鼠脑组织分布一、实验方法ICR雄性小鼠90只(体重20g)，分为3组，依次为游离99mTcN_N0ET，99mTcN-NOET脂 质体(99mTcN-NOET-L)和 99mTcN-NOET 主动靶向脂质体(99mTcN-NOET-SSL-T)组。用 15%乌 拉坦麻醉后尾静脉给药0. Iml0分别于给药5、15、30、60和120min后进行眼部后静脉丛取 血。然后蠕动泵心脏灌流生理盐水，流速为2mL/min，随即剪开右心耳放血，以此消除脑毛细 血管中残留的药物对脑组织分布的影响，准确评价药物跨越血脑屏障进入脑组织的能力。动物处死后，取脑、心、肝、脾、肺、肾、尾等组织，精确称重后Y计数。给药剂量0. ImL药物100倍稀释后，取0. Iml γ计数，计算动物分布％ ID/g值，计
算公式如下％ID/g =，·+。
μ脏器 ,1%二、实验结果游离 99mTcN-NOET,99mTcN-NOET 脂质体(99mTcN-NOET-L)禾Π 99mTcN-NOET 主动靶向脂 质体(99mTcN-NOET-SSL-T)组给药后，各时间点脑组织药物分布％ ID/g见附图2。由图可以 看出，99mTcN-NOET-SSLT, 99mTcN-NOET-L 相对于 99mTcN-NOET 有很大的提高。经 WinNonLin 软 件计算其药动学参数，如表1所示。表1.各组药物在ICR小鼠中血和脑组织的药动学参数(η = 5 6)
5 AUC -.area under the tissue concentration time curve ；Cmax :maximum concentration；CL :clearance rate. 通过药动学参数的计算可以看出，99mTcN-NOET经脂质体包载后，5min时药物在脑 组织浓度达峰，达峰时药物浓度提高1.63倍，脑内药物AUC较游离药物组提高了 1.49倍， 脑组织药物清除率明显低于游离药物组。此结果说明脂质体作为药物载体，增加了药物入 脑效果，延长了 99mTcN-NOET在脑组织的显像时间。99mTcN-NOET经靶向脂质体脂质体包载后，5min时药物在脑组织浓度达峰，达峰时 药物浓度较脂质体组略有增加，脑靶向系数亦略有提高。分析其原因，与"mTcN-NOET在正 常小鼠脑内没有受体可能有关。三、结论99mTcN-NOET用脂质体包载静脉给药，在小鼠脑组织的分布优于99mTcN-NOET,尤其 以脑靶向脂质体99mTcN-NOET-SSL-T分布最高，表明其是一个较有潜力的脑靶向显像制剂。2.99mTcN-NOET脂质体静脉给药大鼠SPECT显像和放射自显影一、实验方法取SD雄性大鼠2只(体重200g)，尾状核接种C6胶质瘤细胞，接种7日后制作 的动物模型用于SPECT显像评价。标记为A鼠与B鼠。用15%乌拉坦麻醉后尾静脉分别 给予游离99mTcN-NOET和99mTcN-NOET主动靶向脂质体(99mTcN-NOET-SSL-T)，给药量分别为 0. 5ml (200uCi)。2小时后用德国Siemens Ε. cam SPECT仪采集图像。上述2只肿瘤大鼠2日后，交叉给药，A鼠给予99mTcN-NOET-SSL-T, B鼠给予游离 99mTcN-N0ET。另取一只C6脑胶质瘤模型大鼠给予99mTcN-N0ET-L。2小时处死动物，解剖取 完整脑组织，于液氮中冷冻。冷冻切片，储磷屏显影。二、实验结果1.荷C6胶质瘤大鼠模型SPECT显像结果99mTcN-NOET与99mTcN-NOET-SSLT分别在2小时左右的SPECT成像照片见附图3。 从照片光斑显像结果可以看出A鼠给予99mTcN-NOET后，脑组织未见明显肿瘤；而B鼠给予 99mTcN-NOET-SSL-T后，在右侧脑组织中可见两处明显肿瘤。为进一步确定肿瘤存在，做脑组 织冷冻切片查看肿瘤情况并做自显影。2.荷C6胶质瘤大鼠模型自显影研究结果C6 胶质瘤模型大鼠交叉给予 99mTcN-NOET-SSL-T (A 鼠)、99mTcN-NOET (B 鼠)和 99mTcN-NOET-L, 2小时左右处死动物的自显影印迹见附图4。可以看出，A鼠冷冻切片的大脑 横切面解剖照片显示脑组织中有两个肿瘤区域，其呈现茂盛的新生血管，边界比较清楚，取该切面的脑组织于磷屏下曝光，得到显影印迹图，图中可见明显的两个肿瘤区域。B鼠冷冻 切片的大脑横切面解剖照片也显示脑组织中有两个肿瘤区域，其呈现茂盛的新生血管，上 侧靠近尾状核的肿瘤边界不太清楚，下侧出现的小肿瘤边界清楚，为其转移瘤。99mTcN-NOET 给药后的自显影印迹可看到上侧肿瘤周边有一圈明显的浓集，但下侧新生瘤没有印迹。比 较SPECT显像和自显影结果，可以明显看出游离99mTcN-NOET在肿瘤后期可以显像，但对于 肿瘤的早期诊断作用欠佳。C鼠冷冻切片的大脑横切面解剖照片显示其脑组织中明显可见茂盛的新生血管， 但肿瘤边界不太清楚，C鼠为肿瘤后期模型。经分析给予99mTcN-NOET-L自显影印迹可以看 出，印迹不如主动脑靶向制剂99mTcN-NOET-SSLT清楚，仅在肿瘤边界出现浓集。三、结论99mTcN-NOET经主动靶向脂质体包载后，其对于脑部肿瘤的早期诊断优于游离药物 组和普通脂质体组。以RMP-7作为导向分子的主动靶向脂质体是一种良好的99mTc显像药 物的给药系统，其有望于为脑部肿瘤的早期诊断提供灵敏的分子探针。


附图1. 99mTcN药物主动靶向脂质体的结构示意图附图2.99mTcN-NOET和99mTcN-NOET脂质体在小鼠脑组织的药时曲线附图3.99mTcN-NOET和99mTcN-NOET-SSL-T在荷C6胶质瘤大鼠模型的SPECT显像附图4.99mTcN-NOET和99mTcN-NOET脂质体在荷C6胶质瘤大鼠模型的冰冻脑切片和 自显影
权利要求
一种99mTc肿瘤显像药物的脑靶向脂质体制剂，其特征在于以缓激肽类似物RMP 7为导向分子制备的主动脑靶向脂质体。
2.根据权利要求1所述的99mTc显像药物为99mTcN-NOET("mTc-氮-N-乙基-N —乙氧基 二硫代氨基甲酸盐))，"mTcN-NOET衍生物，99mTc-MIBI (甲氧基异丁基异腈)以及所有99mTc 标记的肿瘤显像剂。
3.根据权利要求1所述的制剂，该制剂含有脂质体微囊和包裹于其中的99mTc显像药 物，所述脂质体浓度低于1. 5mg/ml，粒径小于60nm的微囊，所述脂质体微囊含有磷脂，胆 固醇，以及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇复合物以及二硬脂酰磷脂酰乙醇胺_聚乙二 醇-RMP-7导向化合物。
4.根据权利要求3所述的制剂，其中所述的聚乙二醇为聚乙二醇2000和聚乙二醇 3400。
5.根据权利要求3所述的制剂，其中所述的磷脂选自大豆卵磷脂，蛋黄卵磷脂，二硬脂 酰磷脂酰胆碱，棕榈酰磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷脂酸，氢化卵磷脂。
6.根据权利要求3所述的制剂，其中所述的磷脂为大豆卵磷脂。
7.权利要求1所述制剂的制备方法，其特征在于该方法为薄膜分散法，具体步骤如下 取大豆卵磷脂，胆固醇和适量99mTc药物，用合适的油相溶解后，25 30°C下旋转减压蒸发 成膜。补充一定量的生理盐水使其水化，超声5min后加入适量二硬脂酰磷脂酰乙醇胺_聚 乙二醇-RMP-7孵育Ihour后得到脂质体透明溶液。
8.权利要求1所述的99mTc肿瘤显像药物靶向脂质体的用途，在于脑部肿瘤的诊断和治疗。
全文摘要
本发明名称是一种99mTc肿瘤显像药物脑靶向脂质体制剂及其应用。本发明提出了用主动脑靶向脂质体包载99mTc肿瘤显像药物的理念，采用快速薄膜分散法制备了99mTc肿瘤显像药物脑靶向脂质体制剂，包封率大于99％，粒径小于30nm，其结构见附图1，磷脂在水中分散得单层或多层微囊，脂溶性99mTc药物插在双分子脂膜中，缓激肽类似物RMP-7作为主动脑靶向导向分子伸展在脂质体表面。小鼠组织分布实验表明该制剂大大提高了99mTc药物穿过BBB的能力，荷C6脑胶质瘤大鼠模型SPECT显像和自显影结果显示该主动靶向脂质体制剂应用于99mTc肿瘤显像药物，可能实现脑瘤的早期诊断。属于放射性药物学和药物制剂学技术领域。
文档编号A61K103/10GK101920024SQ20091014197
公开日2010年12月22日 申请日期2009年6月12日 优先权日2009年6月12日
发明者周鹤翔, 谢英, 贾红梅, 郑婷婷 申请人:北京师范大学