新型¹⁸F标记间硝基苯甲酰基氨基酸、制备方法和在肿瘤显像中的应用的制作方法

专利名称：：新型¹⁸F标记间硝基苯甲酰基氨基酸、制备方法和在肿瘤显像中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种新型18F标记间硝基苯甲酰基氨基酸类化合物和及其作为正电子发射断层显像(PET)的肿瘤显像剂的应用。
背景技术：
：肿瘤的早期诊断是当今医学的一大热点，而正电子发射断层显像(PET)作为一种越来越普及的手段受到极大重视，因而肿瘤的早期诊断的突破有赖于PET肿瘤显像剂的开发。放射性核素18F因为其优良的核素性质，非常适合作为PET的显像核素。目前应用最广的发射正电子的放射性药物是"F-脱氧葡萄糖(18F_FDG)，已广泛应用于肿瘤、冠心病及神经精神疾病的研究和临床诊断。但由于正常脑组织对FDG的摄入量较大，非肿瘤组织及炎症细胞成分中也有较高的FDG吸收，致使FDG用于脑瘤显像时可能因为存在炎症而造成肿瘤诊断的假阳性结果。而氨基酸在正常脑组织的吸收很少，因此引起广泛兴趣。它作为肿瘤显像剂的依据是肿瘤增殖可能会引起氨基酸积累水平增高，以提供蛋白质生物合成的基本单元。另外，某些标记的氨基酸衍生物虽然并不参与蛋白质的合成，但是只要能被肿瘤组织的输运体系所输运，也是可以作为显像剂的，因此经放射性核素标记的某些氨基酸衍生物也有可能成为肿瘤显像剂。目前，已经有一些18F标记的氨基酸被合成出来，并在生物学评价中显示出较好的结果，如0-(2-「F]氟乙基)-L-酪氨酸(rF]FET)、0-(3-，-氟代丙基)-L-酪氨酸([18F]FPT)，显示了18F标记氨基酸衍生物作为PET肿瘤显像剂的潜力。
发明内容第一，本发明提供一种肿瘤摄取高、特异性好放射性18F标记间硝基苯甲酰基氨基酸类化合物。该种18F代化合物的结构如式A:R=H,Me，Et，Pr,i-Pr，CH3CH2CH2CH2,CH3CH2CH，CH3CH(CH3)CH2，c6h5，c6h5ch2，ch3sch2ch2,hooch2ch2，hooch2ch2ch2,hA^/""一式A其特征在于一端具有3-氟18-5-硝基苯甲酰结构；另一端具有a-氨基酸结构，有取代基R位于羧基a位上，另一端具有a-氨基酸甲酯结构，取代基R位于酯基a位上，为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、苄基、2_甲硫基乙基、羧乙基、羧丙基、苯基、咪唑甲基。两端结构通过酰胺键直接相连。其制备主要分为标记前体化合物的合成及前体化合物的^F标记和后处理两个部分。具体步骤如下—.标记前体化合物(式B)的合成R=H,Me,Et,Pr,i-Pr,CH3CH2CH2CH2，CH3CH2CH，CH3CH(CH3)CH2,C6H5，C6H5CH2，CH3SCH2CH2,HOOCH2CH2，HOOCH2CH2CH2，HN式B合成路线如式C所示rsoa，rH，NCOOHCH3OH■RDCCHOBt■H2Mr议ch2ci，CO'OMeO，MOMeR=H,Me，Et，Pr，i-Pr,CH3CH2CH2CH2，CH3CH2CH，CH3CH(CH3)CH2，CH3NH2C6H5，C6H5CH2，CH3SCH2CH2,HOOCH2CH2,HOOCH2CH2CH2，HN^""C—式C1)氨基酸羧基的甲酯化保护(式D)氨基酸0.02mol加入到无水甲醇20mL中，冰浴冷却后，缓慢滴加S0C122.lmL，滴加过程中保持反应体系的温度不超过l(TC，滴加完成后低温保持反应30min后升温到室温反应过夜后，旋去过量的S0Cl2和甲醇，得到白色固体，以乙醚充分洗涤后晾干，并以无水乙醇或者无水乙醇和无水乙醚的混合溶剂重结晶，得到白色固体即为氨基酸甲酯盐酸盐。产率70-80%。rr關■COOH:CH3OH關R=H,Me,Et,Pr,i-Pr，CH3CH2CH2CH2,CH3CH2CH，CH3CH(CH3)CH2，CH3NH2C6H5，C6H5CH2,CH3SCH2CH2，HOOCH2CH2,HOOCH2CH2CH2,Hlll^"C一式D2)3，5-二硝基苯甲酰氨基酸甲酯的合成(式E)氨基酸甲酯盐酸盐3mmo1溶解到20mL二氯甲烷中后，一次性加入重蒸三乙胺0.42mL(3翻l)后搅拌反应5min，加入3，5-二硝基苯甲酸0.424克(2,1)和H0Bt(l-羟基苯并三氮唑)O.298克(2.2誦ol)，反应混合物冷却到0。C后，滴加DCC0.46克(2.2画o1)6的二氯甲烷溶液5mL，滴加完毕后继续低温反应0.5h后升温至室温反应过夜，TLC显示反应结束后，抽滤除去生成的大量白色沉淀状副产物DCU，有机相以水、饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液洗涤后无水硫酸钠干燥，旋去溶剂后得到油状物，硅胶柱柱层析，洗脱剂(乙酸乙酯石油醚=1:3)后得到浅黄色或白色固体，产率约60%。R=H,Me，Et，Pr，i-Pr，CH3CH2CH2CH2，CH3CH，H，CH3CH(CH3)CH2,CH3nh2C6H5,C6H5CH2，CH3SCH2CH2,HOOCH2CH2,HOOCH2CH2CH2,HN^^C_式e二.前体化合物的放射性标记及后处理1)前体化合物的放射性标记(式F)18F—被阴离子柱QMA捕获后，用含10mgK2.2.2和3mgK2C03的lmL乙腈和0.5mL水的混合液将其冲洗到反应瓶中，向反应瓶中加入0.5mL的无水乙腈，加热到IO(TC，不断的通入氮气，利用乙腈和水共沸除水，待将溶剂吹干后，再分别加入0.5mL的无水乙腈，重复此操作两次，将5mg式B所示前体化合物溶于无水N，N-二甲基甲酰胺溶液倒入反应瓶中，迅速升温至125°C，维持该温度反应30min左右，停止反应，加入大约10mL水将反应体系稀释，再通过S印-PakC18柱，将滤液收集到l号瓶中(主要是没有参与反应的^F—)，然后再用10mL水洗涤柱子，将滤液收集到2号瓶中(确保将没有参与反应的18F—彻底淋洗干净)，用氮气将S印-PakC18柱吹干，用2mL乙腈洗涤C18柱，将滤液收集到3号瓶中，得到18F标记产物3，整个反应过程约需要30min。7OMeOMeR=H,Me,Et,Pr，i-Pr，CH3CH2CH2CH2，CH3CH2CH，CH3CH(CH3)CH2，CH3产NH2C6H5,C6H5CH2,CH3SCH2CH2，HOOCH2CH2，HOOCH2CH2CH2,式F2)标记中间产物的水解(式G)标记物3经HPLC(带放射性探头)分离纯化，用氮气将溶液中的乙腈吹干后，在水和甲醇的混合溶液中用一定量的氢氧化锂水解，再用一定量的lmol/L的盐酸酸化，得到，代产物4，此过程约需30min，加上标记物3的制备时间，共需约60min。R=H，Me，Et,Pr,i-Pr,CH3CH2CH2CH2,CH3CH2CH,CH3CH(CH3)CH2CH3H22，HN^/""C6H5，C6H5CH2,CH3SCH2CH2，HOOCH2CH2,HOOCH2CH2CH2，式G第二，本发明上述18F标记的氨基酸衍生物作为PET肿瘤显像剂的应用。本发明具有以下优良特性1)本发明中用于进行"F标记前体化合物合成简便，原料廉价易得。标记总时间短，有效放射性损失少。2)本发明的"F标记的化合物具有适宜肿瘤显像特别是脑肿瘤显像的优良生物性能。主要有以下几点2.1本发明的化合物在血液、肌肉组织和脑内清除速率很快，在肿瘤中有较高初始摄取且清除相对较慢，在其它脏器中初始摄取低或清除很快，从而能在注射后较短时间达到一个肿瘤/背景高比值的时段。有实验为证按实施例1制得的^F标记化合物的乙腈溶液，用氮气吹干乙腈，再用生理盐水将产物稀释为8-10iiCi/0.lmL作为注射液。取出三份0.lmL的注射液，分别加入9.9mL生理盐水，混匀后，从每份中分别再取出0.lmL，作为标准溶液，待测定小鼠各组织和脏器的放射性计数的同时测定其放射性计数，取平均值即1%ID使用。将昆明鼠随机分为五组，每组3只。从尾静脉注射18F标记产物的注射液0.lmL(8-10iiCi)，分别于注射后的5min、15min、30min、60min、120min将各组小鼠断头处死，将其迅速解剖，取脑、心、肝、肺、肾、后腿骨、肌肉、小肠、大肠、脾、血液、肿瘤等组织和脏器，擦干后称重，并测量其各自的放射性计数，计算出其各组织和脏器的放射性摄取量％ID/g，每次实验取三组平行数据。式A中R为异丙基的化合物实验结果如表1所示表118F标记产物(式A中R为异丙基的化合物)的荷S180瘤小鼠的体内生物分布数据(％ID/g±SD，n=3)器官时间(分)5153060120心1.45±0.460.56±0.010.25±0.170.15±0.030.03±0.01肝5.62±1.432.17±0.180.41±0.130.24±0.170.07±0.03肺3.58±0.771.12±0.120.32±0.190.26±0.060.05±0.01肾15.25±0.636.52±0.091.61±0.871.53±0.130.28±0.07脑0.14±0.000.10±0.010.04±0.010.03±0.020.01±0.00肌肉0.58±0.470.52±0.130.25±0.120.15±0.060.06±0.03小肠2.05±0.130.61±0.180.35±0.210.25±0.140.15±0.15大肠0.75±0.160.41±0.320.35±0.060.16±0.060.07±0.00血6.21±1.961.41±0.170.28±0.280.24±0.160.06±0.00脾1.70±0.840.34±0.040.18±0.160.09±0.050.03±0.00肿瘤0.97±0.300.76±0.080.43±0.280.35±0.140.06±0.04表1数据经过整理，得到该化合物各时项肿瘤/正常组织单位质量的放射性活度比值，如表2所示表218F标记产物(式A中R为异丙基的化合物)在荷S180瘤小鼠体内的T/B比值T/B时间(分)5153060120肿瘤/脑7.087.810.1912.297.65肿瘤/血0.160.541.531.47U3肿瘤/肉1.681.462.851.41.08由表2可以看出，该化合物的T/B比值5-30分迅速上升，在30分之后均达到峰值并在30-60分内较稳定，之后缓慢下降，因此，该化合物在30-60分这段时间最适合显像。2.2与目前技术相比，本发明的^F标记化合物具有创新性，体现在生物性能一些方面的明显的优势，举例如下与目前具有很大应用潜力的PET肿瘤显像剂18F_FET相比，本发明的18F标记化合物在肿瘤与正常组织的区分上，有明显优势。有实验为证按2.1相同实施方法进行18F_FET的荷S180瘤小鼠体内分布实验，实验结果如表3所示表318F-FET的荷S180瘤小鼠的体内生物分布数据(％ID/g±SD，n=3)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>对比表1和表3可以看出，本发明的^F代化合物(实施例中化合物4a)比18F_FET具有明显高的正常组织的清除速率，本发明的"F代化合物(实施例中化合物4a)经过较短时间能得到更高的肿瘤/背景放射性比值。整理表3数据后得到的18F_FET的肿瘤/正常组织比值如表4所示表418F_FET在荷S180瘤小鼠体内的T/B比值<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>对比表2和表4可以看出，本发明的，标记化合物(实施例中化合物4a)在30-60min区段各项T/B比值均高于18F_FET相应T/B值，特别是肿瘤/脑峰值更是后者的4倍。虽然在60-120min，18F_FETF/B比值稳定在30_60min水平甚至还有所增加，但考虑到全身分布速率、正常注射剂量的大小及放射性药物按放射性指数衰变规律损失的特性，最佳显像时间应在注射后30-60min，而在此区间，本发明的18F标记化合物各项T/B比值对18F-FET具有明显优势，这使得本发明的18F标记化合物进行肿瘤显像特别是脑肿瘤显像时可能得到比18F_FET更高质量的图像。2.3由于荷S180瘤小鼠体内分布实验显示出本发明的，标记间硝基苯甲酰基氨基酸衍生物较好的生物分布性能，我们初步进行了对荷荷神经胶质瘤小鼠体的内分布研究，结果与荷S180瘤小鼠肿瘤/背景比值变化趋势类似，虽然5-15min相应比值较小，但30-60min已经很接近，肿瘤/脑、肿瘤/血、肿瘤/肉分别在30-60min达到各自峰值8.77、1.43和2.60，并在之后较为稳定。如表5所示表5^F标记产物(式A中R为异丙基的化合物)在荷神经剂胶质瘤小鼠体内的T/B比值T/B时间(分)5153060120肿瘤/脑5.676.208.468.776.02肿瘤/血0.110.441.431.320.98肿瘤/肉1.181.272.601.501.01综上，本发明所提供的，标记化合物与现有技术相比，既具有优良的生物性能，又具有制备简单的特点。具有作为肿瘤显像剂特别是脑肿瘤显像剂的潜力。具体实施例方式以下通过具体实施方式可以使本发明得到更清楚的说明，但本发明并不局限于以下实施例。实施例按照以下步骤制备的是式A中R基为异丙基的化合物，包括标记前体(式B中R取异丙基的化合物)的合成和前体化合物的18F标记、水解两个部分。1)标记前体(式B中R取异丙基的化合物)的合成1.13-甲基-2-氨基丁酸甲酯盐酸盐的合成(式H)3-甲基-2-氨基丁酸(缬氨酸)0.02mol加入到无水甲醇20mL中，冰浴冷却后，缓慢滴加S0C122.lmL，滴加过程中保持反应体系的温度不超过l(TC，滴加完成后低温保持反应30min后升温到室温反应过夜后，旋去过量的SOC^和甲醇，得到白色固体，以乙醚充分洗涤后晾干，并以无水乙醇或者无水乙醇和无水乙醚的混合溶剂重结晶，得到白色固体即为3-甲基-2-氨基丁酸甲酯盐酸盐。产率70-80%。m.p.:156-158。C;IR(KBr，cm—0:v3432，1740，1265。H，Nco環CXJOMe1a式H1.22-(3，5-硝基)苯甲酰胺基_3-甲基丁酸甲酯的合成(式I)3-甲基-2-氨基丁酸甲酯盐酸盐0.504克(3mmo1)溶解到20mL二氯甲烷中后，一次性加入重蒸三乙胺0.42mL(3mmo1)后搅拌反应5min，加入3，5-二硝基苯甲酸0.424克(2mmo1)和HOBt(l-羟基苯并三氮唑)0.298克(2.2mmo1)，反应混合物冷却到(TC后，滴加DCC0.46克(2.2mmo1)的二氯甲烷溶液5mL，滴加完毕后继续低温反应0.5h后升温至室温反应过夜，TLC显示反应结束后，抽滤除去生成的大量白色沉淀状副产物DCU，有机11相以水，饱和碳酸氢钠水溶液，饱和氯化钠水溶液洗涤后无水硫酸钠干燥，旋去溶剂后得到油状物，硅胶柱柱层析，洗脱剂(以酸乙酯石油醚=i:3)后得到淡黄色固体，产率62%。m.p:129-131°C;IR(KBr，cm—1):v3491，3260，3114，2958，2874，1752，1664，1645，1541，1343，1215一HNMR(400MHz，CDC13):S9.14(m，1H，Ar_H)，8.90(m，2H，Ar_H)，4.83(m，1H，CHC00CH3)，3.84(s，3H，0CH3)，2.36(m，1H，CH(CH3)2)，1.04(d，6H，J=3.6Hz，CH(CH3)2);13CNMR(100MHz，CDC13):S172.66，162.67，148.69，137.28，127.26，121.32，58.19，52.73，31.53，19.04，18.03。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>式I2)前体的标记的18F标记(式J)和水解(式K)18F—被阴离子柱QMA捕获后，用含10mgK2.2.2和3mgK2C03的lmL乙腈和0.5mL水的混合液将其冲洗到反应瓶中，向反应瓶中加入0.5mL的无水乙腈，加热到IO(TC，不断的通入氮气，利用乙腈和水共沸除水，待将溶剂吹干后，再分别加入O.5mL的无水乙腈，重复此操作两次，将5mg2-(3，5-二硝基)苯甲酰胺基_3-甲基丁酸甲酯溶于无水N，N-二甲基甲酰胺溶液倒入反应瓶中，迅速升温至125t:，维持该温度反应30min左右，停止反应，加入大约10mL水将反应体系稀释，再通过S印-PakC18柱，将滤液收集到1号瓶中(主要是没有参与反应的"F—)，然后再用10mL水洗涤柱子，将滤液收集到2号瓶中(确保将没有参与反应的18F—彻底淋洗干净)，用氮气将S印-PakC18柱吹干，用2mL乙腈洗涤C18柱，将滤液收集到3号瓶中，得到中间产物2-(3-氟18-5-二硝基)苯甲酰胺基-3-甲基丁酸甲酯(3a)，经HPLC(带放射性探头)分离纯化(HPLC条件流速lmL/min，流动相为乙腈水=70%:30X，保留时间为7.9min)，用氮气将溶液中的乙腈吹干后，在水和甲醇的混合溶液中用一定量的氢氧化锂水解，再用一定量的lmol/L的盐酸酸化，得到18F标记产物2-(3-氟18-5-二硝基)苯甲酰胺基-3-甲基丁酸(4a)，整个反应过程需要60-80min。经HPLC(带放射性探头)测定(HPLC条件流速lmL/min，流动相为乙腈水=70%:30%，保留时间为3.Omin)，水解反应很完全，放射化学纯度达到生物分布实验要求。式J式K脂水分配系数是生物活性化合物的一项重要理化参数，对2-(3-氟18-5-二硝基)苯甲酰胺基_3-甲基丁酸脂水分配系数测定实施如下在离心试管中依次加入2mL正辛醇和1.9mLpH为7.4的磷酸盐缓冲溶液，以及放射性活度约为8-10Ci的2-(3-氟18-5-二硝基)苯甲酰胺基-3-甲基丁酸的0.lmL水溶液，充分振荡后离心分层5min，分别取有机相和水相各0.lmL于干净试管中，分别测定其放射性计数N，计算分配系数P=Nw/N*，重复本操作3次后取平均值，对P取对数，logP即为该18F标记产物的脂水分配系数。按上述方法测得2-(3-氟18-5-二硝基)苯甲酰胺基_3_甲基丁酸的脂水分配系数为-0.53。异常毒性检验按中华人民共和国药典2005年版所述方法进行。将IO只正常昆明小鼠(18-20g)尾静脉注入O.5mL(37MBq)2-(3-氟18-5-二硝基)苯甲酰胺基_3-甲基丁酸注射液(相当于数百倍于成人用量)，观察48小时。小鼠生长正常，无死亡及不良反应现象发生。解剖后观察，未见任何器官损伤。异常毒性检查符合放射性药物质量要求。权利要求一种新型18F标记间硝基苯甲酰基氨基酸类化合物，其特征是一端具有3-氟18-5-硝基苯甲酰结构；另一端具有α-氨基酸结构，有取代基R位于羧基α位上，为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、苄基、2-甲硫基乙基、羧乙基、羧丙基、苯基、咪唑甲基。两端结构通过酰胺键直接相连。结构如式A。式AF2008101675579C0000011.tif2.权利要求1所述的^F标记间硝基苯甲酰基氨基酸类化合物，其特征是一端具有3，5-二硝基苯甲酰结构；另一端具有a-氨基酸甲酯结构，取代基R位于酯基a位上，为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、节基、2_甲硫基乙基、羧乙基、羧丙基、苯基、咪唑甲基。两端结构通过酰胺键直接相连。结构如式B:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式B3.权利要求1所述的系列^F标记间硝基苯甲酰基氨基酸类化合物，包括以下步骤；18F—被阴离子柱QMA捕获后，用含lOmgK2.2.2和3mgK2C03的ImL乙腈和0.5mL水的混合液将其冲洗到反应瓶中，向反应瓶中加入0.5mL的无水乙腈，加热到IO(TC，不断的通入氮气，利用乙腈和水共沸除水，待将溶剂吹干后，再分别加入0.5mL的无水乙腈，重复此操作两次，将5mg式B所示前体化合物溶于无水N，N-二甲基甲酰胺溶液倒入反应瓶中，迅速升温至125t:，维持该温度反应30分钟左右，停止反应，加入大约10mL水将反应体系稀释，再通过S印-PakC18柱，将滤液收集到l号瓶中(主要是没有参与反应的^F—)，然后再用10mL水洗涤柱子，将滤液收集到2号瓶中(确保将没有参与反应的18F—彻底淋洗干净)，用氮气将S印-PakC18柱吹干，用2mL乙腈洗涤C18柱，将滤液收集到3号瓶中，得到18F标记中间产物。18F标记中间产物经HPLC(带放射性探头)分离纯化，用氮气将溶液中的乙腈吹干后，在水和甲醇的混合溶液中用一定量的氢氧化锂水解，再用一定量的lmol/L的盐酸酸化，得到18F代终产物，此过程约需30分钟。4.权利要求3所述的，标记方法，其特征在于18『源的取得是用含10mgK2.2.2和3mgK2C03的lmL乙腈和0.5mL水的混合液冲洗医用18F—QMA阴离子柱获得，并用乙睛共沸除水。5.权利要求3所述的18F标记方法，其特征在于使用DMF作为反应溶剂，K2.2.2为相转移催化剂。6.权利要求3所述的^F标记方法，其特征在于标记反应最佳温度为120-125t:，最佳时间为30分钟。7.权利要求1所述的18F标记间硝基苯甲酰基氨基酸类化合物作为正电子发射断层显像(PET)肿瘤显像剂的应用。全文摘要本发明涉及一类新型18F标记间硝基苯甲酰基氨基酸类化合物，其特征是同时具有3-氟18-5-硝基苯甲酰和α-氨基酸结构，并有取代基R位于羧基α位上，为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、苄基、2-甲硫基乙基、羧乙基、羧丙基、苯基、咪唑甲基。两端结构通过酰胺键直接相连。结构如式A。该种化合物合成简单，肿瘤组织初始摄取高且清除较慢，在正常组织和血液中摄取低或清除快，具有较高的肿瘤/血液比值和肿瘤/正常组织比值，特别是肿瘤/脑比值很高，因此肿瘤和脑本底的区分度高，稳定时间也很长。本发明还涉及该种化合物作为PET肿瘤显像剂的应用。文档编号C07C233/00GK101723848SQ20081016755公开日2010年6月9日申请日期2008年10月10日优先权日2008年10月10日发明者乔雅丽,刘航,张淑婷,李桂霞,许荆立,贺勇,齐传民申请人:北京师范大学