扩增：体系为25 yL，其中包括：F3/B3各 0? 4 y M、FIP/BIP各I. 6 y M、LF/BF各0? 8 y M、8mM MgS04、I X ThermoPol缓冲液（包含：20mM Tris-HCl (pH 8. 8, 25°C )，IOmM KC1，10mM(NH4)2S04,2mM MgS04,0. 1体积％TritonX-100)、 6mM甜菜碱、I. 2mM dNTP、8U BstDNA大片段聚合酶，模版DNA溶液2 y L。然后加入I X的 SYBR Green I以进行实时定量荧光检测。其中，使用相同的模板样品，对引物组1-4进行分 别测试，分别如图1中Tubel-4所示。将反应管放置在ESE-Quant tube scanner中，设置 反应条件为：63°C恒温反应60min，并在80°C反应3min。反应结束后观察ESE-Quant tube scanner软件判断扩增结果。结果如图1所示。根据图1可见，引物组1能较早地出现S型 曲线，而引物组2、3和4出现S型曲线的时间较晚，由此说明引物组1具有更高的灵敏性。
[0048]实施例2
[0049] 本实施例对引物组1和2进行特异性检测。
[0050] 将非转基因大豆与转基因大豆M0N87701的种子分别磨成干粉，然后分别按照 0:1、9:1、19:1、99:1、995:5、999:1和1:0的重量比混合，并且使用DNA提取试剂盒按其说明 书操作，进行DNA的提取，获得DNA浓度为15ng/yL的模板样品。
[0051] 按照如下反应体系，进行环介导等温核酸扩增：体系为25yL，其中包括：F3/B3各 0? 4yM、FIP/BIP各I. 6yM、LF/BF各 0? 8yM、8mMMgS04、IXThermoPol缓冲液（包含：20mM Tris-HCl(pH8. 8, 25°C)，IOmMKC1，10mM(NH4)2S04,2mMMgS04,0. 1 体积％TritonX-100)、 6mM甜菜碱、1.2mMdNTP、8UBstDNA大片段聚合酶，模版DNA溶液2yL。然后加入终浓度为 IX的SYBRGreenI以进行实时定量荧光检测。其中，使用不同的模板样品，对引物组1-2 进行分别测试。将反应管放置在ESE-Quanttubescanner中，设置反应条件为：63°C恒温反 应60min，并在80 °C反应3min。反应结束后观察ESE-Quanttubescanner软件判断扩增结 果。结果如图2所示，其中图2位引物组1的结果图，其中Tubel-7的模板分别为按照0:1、 9:1、19:1、99:1、995:5、999:1和1:0的重量比混合的非转基因大豆与转基因大豆M0N87701 的种子粉。根据图2可见，引物组1能准确地区分不同含量的转基因大豆M0N87701，由此说 明引物组1具有高特异性。
[0052] 实施例3
[0053] 按照表3制备如下样品的DNA作为模板，DNA浓度为15ng/y L，并使用引物组1进 行环介导等温核酸扩增。
[0054] 表 3
[0055]
[0056] 按照如下反应体系，进行环介导等温核酸扩增：体系为25yL，其中包括：F3/B3各 0? 4yM、FIP/BIP各I. 6yM、LF/BF各 0? 8yM、8mMMgS04、IXThermoPol缓冲液（包含：20mM Tris-HCl(pH8. 8, 25°C)，IOmMKC1，10mM(NH4)2S04,2mMMgS04,0. 1 体积％TritonX-100)、 6mM甜菜碱、I. 2mMdNTP、8UBstDNA大片段聚合酶，模版DNA溶液2yL。然后加入终浓度为 IX的SYBRGreenI以进行实时定量荧光检测。将反应管放置在ESE-Quanttubescanner中，设置反应条件为：63 °C恒温反应60min，并在80 °C反应3min。反应结束后观察ESE-Quant tubescanner软件判断扩增结果。结果如图3所示，可见只有Tubel取得了S型扩增曲线， 而其它样品不具有S型扩增曲线。
[0057] 实施例4
[0058] 将非转基因大豆与转基因大豆M0N87701的种子分别磨成干粉，然后分别按照 0:1、9:1、19:1、99:1、995:5、999:1和1:0的重量比混合，并且使用DNA提取试剂盒按其说明 书操作，进行DNA的提取，获得DNA浓度为15ng/yL的模板样品。其中，对不同的模板样品 使用引物组1进行测试。
[0059] 按照如下反应体系，进行环介导等温核酸扩增：体系为25yL，其中包括：F3/B3各 0? 4yM、FIP/BIP各I. 6yM、LF/BF各 0? 8yM、8mMMgS04、IXThermoPol缓冲液（包含：20mM Tris-HCl(pH8. 8, 25°C)，IOmMKC1，10mM(NH4)2S04,2mMMgS04,0. 1 体积％TritonX-100)、 6mM甜菜碱、1.2mMdNTP、8UBstDNA大片段聚合酶，模版DNA溶液2yL。将反应管放置在 水浴锅中，63°C恒温反应60min后在PCR管盖内壁加1000X的SYBRGreenI溶液2yL， 最后用双蒸水补足至25yL。结果如图4所示，其中Tubel-7的模板分别为按照0:1、9:1、 19:1、99:1、995:5、999:1和1:0的重量比混合的非转基因大豆与转基因大豆M0N87701的种 子粉。根据图4肉眼可见，引物组1能准确地区分不同含量的转基因大豆M0N87701，转基因 大豆M0N87701的含量越多，反应管中的液体颜色越接近绿色，转基因大豆M0N87701的含量 越少，反应管中的液体颜色越接近红色。
[0060] 实施例5
[0061] 使用与实施例3相同的模板样品，并使用引物组1进行环介导等温核酸扩增。
[0062] 按照如下反应体系，进行环介导等温核酸扩增：体系为25yL，其中包括：F3/B3各 0? 4yM、FIP/BIP各I. 6yM、LF/BF各 0? 8yM、8mMMgS04、IXThermoPol缓冲液（包含：20mM Tris-HCl(pH8. 8, 25°C)，IOmMKC1，10mM(NH4)2S04,2mMMgS04,0. 1 体积％TritonX-100)、 6mM甜菜碱、1.2mMdNTP、8UBstDNA大片段聚合酶，模版DNA溶液2yL。将反应管放置 在水浴锅中，63 °C恒温反应60min后在PCR管盖内壁加1000X的SYBRGreenI溶液 2yL，最后用双蒸水补足至25yL。结果如图5所示，根据图5肉眼可见，只有转基因大豆 M0N87701 (Tubel)为绿色，其它反应管中的液体颜色为红色。
[0063] 实施例6
[0064] 对实施例4和5得到的扩增后的物料进行电泳检测，结果分别如图6和图7所示。 图6可见转基因大豆M0N87701的含量越多，阶梯状电泳条带越深，转基因大豆M0N87701的 含量越少，阶梯状电泳条带越浅。图7可见只有转基因大豆M0N87701 (Tubel)具有阶梯状 电泳条带，其它样本未出现阶梯状电泳条带。
[0065] 以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简 单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0066]另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0067] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种引物组，该引物组包括外引物对、内引物对和环引物对；其特征在于，所述外引 物对包括SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示的引物；所述外引物对包括SEQ ID NO :1和 SEQ ID NO :2所示的引物；所述外引物对包括SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示的引物； 所述外引物对包括SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示的引物。2. -种试剂盒，其特征在于，该试剂盒至少包括权利要求1所述的引物组和环介导等 温核酸扩增试剂。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其中，所述环介导等温核酸扩增试剂包括扩增缓冲 液、dNTP和DNA聚合酶。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述扩增缓冲液含有8-12mM的KCl、8-12mM的 (NH4) 2SO4' l-3mM 的 MgSO# 0? 05-0. 2 体积 ％ 的 TritonX-IOO 且 pH 值为 8. 6-9. 0〇5. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其中，所述环介导等温核酸扩增试剂还包括 6-IOmM 的 MgSOjP 4-8mM 的甜菜碱。6. 根据权利要求2所述的试剂盒，其中，该试剂盒还含有显色试剂，所述显色试剂为荧 光染料SYBR Green 1〇7. 根据权利要求2或6所述的试剂盒，其中，所述外引物对可以以8-12 y mol/L的溶液 的形式存在，所述内引物对可以以35-45 y mol/L的溶液的形式存在，所述环引物对可以以 18-22 ymol/L的溶液形式存在。8. -种检测转基因大豆M0N87701的方法，其特征在于，该方法至少包括如下步骤：（1) 提取待测大豆的基因组DNA作为待扩增样本；（2)使用如权利要求1所述的引物组，以所述 待扩增样本为模版，进行环介导等温核酸扩增的操作；（3)在环介导等温核酸扩增的进行 过程中通过实时荧光法检测是否具有S型扩增曲线；和/或，在环介导等温核酸扩增结束 后，通过染色和/或电泳检测扩增后的物料中是否含有特异性扩增产物；如果在环介导等 温核酸扩增的进行过程中具有S型扩增曲线，或，扩增后的物料中含有特异性扩增产物，则 指示待测大豆为转基因大豆M0N87701。9. 根据权利要求8所述的方法，其中，相对于25 y L的环介导等温核酸扩增反应体系， 以基因组DNA的量计，待扩增样本的用量为25-50ng。
【专利摘要】本发明提供了一种引物组，该引物组包括外引物对、内引物对和环引物对；其中，所述外引物对包括SEQ？ID？NO：1和SEQ？ID？NO：2所示的引物；所述外引物对包括SEQ？ID？NO：1和SEQ？ID？NO：2所示的引物；所述外引物对包括SEQ？ID？NO：3和SEQ？ID？NO：4所示的引物；所述外引物对包括SEQ？ID？NO：5和SEQ？ID？NO：6所示的引物。本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒至少包括如上所示的引物组和环介导等温核酸扩增试剂。本发明还提供了一种检测转基因大豆MON87701的方法。通过上述技术方案，本发明能够通过环介导等温核酸扩增方法对转基因大豆MON87701实现快速、简便、灵敏且准确地检测。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105087558
【申请号】CN201510451305
【发明人】温洪涛, 关海涛, 张瑞英
【申请人】黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年7月29日