基于lamp技术检测罂粟壳成分的引物、试剂盒及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于LAMP技术检测罂粟壳成分用的引物，本发明还涉及一种包 含上述引物的试剂盒，本发明还涉及一种采用上述引物检测罂粟壳成分的方法，属于生物
技术领域。
【背景技术】
[0002] 罂粟学名：Papaver somniferum L.，罂粟科植物，是制取鸦片的主要原料，未成 熟果实含乳白色浆液，制干后即为鸦片，其提取物也是多种镇静剂的来源，如吗啡、可待因、 和罂粟碱等多种生物碱，其中吗啡是其主要成分，加工入药，有敛肺、涩肠、止咳、止痛和催 眠等功效，治久咳、久泻、久痢、脱肛、心腹筋骨诸痛；学名"somniferum"的意思是"催眠"， 反映出其具有麻醉性。罂粟的种子罂粟籽是重要的食物产品，其中含有对健康有益的油 月旨，广泛应用于世界各地的沙拉中，而罂粟花绚烂华美，是一种很有价值的观赏植物。罂 粟果壳性微寒，味酸涩，有小毒，含低量吗啡等生物碱。另含多糖约2. 4%，水解可得乳 糖10%、阿拉伯糖6%、木糖6%、鼠李糖4%、乳糖醛酸Galacturonic acid60%、4-0-甲 基葡萄糖醛酸4-〇-Methylglucuronic acid4 %、微量岩藻糖Fucose、2-〇_甲基岩藻糖 2-〇-Methylfucose、2_〇-甲基木糖 2-〇_Methylxylose 及葡萄糖酸酸 G-tucuronic acid、 景天庚糖Sedoheptulose、D-甘露庚酮糖D-Mannoheptulose、D-甘油基-D-甘露辛酮糖 D-Glycero-D-Mannooctulose、内消旋肌醇 Mesoinositol、赤藓醇 Erythritol，有敛肺、湿 肠、止痛的作用，用于久咳、久泻、脱肛、脘腹疼痛，但是该品易成瘾，不宜常服。目前一些不 法商贩将罂粟壳作为食品添加剂加入到火锅底料、卤汤、烧烤味调料等食品中，使人食用后 产生快感，并逐渐产生依赖性以达到招揽回头客的目的。人如果长期食用含有罂粟成分的 食物，就会出现兴奋、烦躁不安、冒虚汗、全身乏力犯困、面黄肌瘦等慢性中毒症状，还会使 人嗜睡、性格改变、记忆力减退，长期食用还会导致精神失常、出现幻觉；还容易是车辆驾驶 员犯困、注意力不集中而造成交通事故；添加了罂粟壳的食品由于非常容易使人上瘾，甚至 走上吸毒犯罪的道路等等，这种违法行为严重损坏了消费者的健康，业已成为食品安全的 严重的隐患。我国早就明文禁止在食品中添加罂粟成分的，国务院已经将罂粟壳列入《麻醉 药品管理办法》名录中，将罂粟壳按照麻醉品进行管理。因此，建立一种更加快速、灵敏、方 便的检测方法是保障人民身体健康的一项重要手段、是行政执法的技术后盾、新的检测技 术和方法已经成为一项迫切需要的政治任务，刻不容缓。
[0003] 目前我国对于罂粟的检测还没有一个统一的标准，主要检测方法有化学分析法、 薄层色谱法、免疫分析法、气质联用法以及液相色谱法等。化学分析法是根据罂粟壳所含的 生物碱与特定试剂反应显色来作定性检测，简单迅速但灵敏度低；薄层色谱法也是根据罂 粟壳所含的生物碱来检测，可以同时检测多种生物碱，但是检测灵敏度也低、特异性差，且 易污染环境；免疫分析法是利用罂粟的生物碱制备的特异性抗体来检测生物碱抗原的存在 与否，检测灵敏度可达0.l-20ug/kg，该方法比较快速、通量较高、灵敏度也较强，可以作为 日常大量样品筛查检测之用，但是该方法不能准确定量，且抗体制备较难又不易保存，重复 性不高，假阳性率高。气相色谱法GC、气相色谱质谱法GC-MS、高效液相色谱法HPLC、液相色 谱-串联质谱法LC-MS:可以检测吗啡和可卡因等，虽然检测灵敏度较高，但都需要昂贵的 设备、环境要求高、检测周期长、检测费用昂贵、还需要专业训练过的技术人员，不适合基层 和现场检测。另外上述方法都是对生物碱进行间接的检测，不能对罂粟物种来源进行准确 的定性。
[0004] 目前火锅底料和小吃类食品等中的非法添加罂粟壳的现象已经引起了人们对食 品安全问题的高度重视和全社会的广泛关注，为了能够尽快准确的给监管执法提供执法依 据，迫切需要能够又快又准又方便且适合基层普通实验室对罂粟物种来源进行准确的定性 的检测方法。
[0005] 目前已有的检测方法，其检测步骤繁琐，采用仪器昂贵，不能快速、方便的实现检 测罂粟壳成分。故此，现有检测罂粟壳成分的检测方法有待进一步完善。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种基于LAMP技术检测 罂粟壳成分用的引物；
[0007] 本发明另一个目的提供一种包含上述引物的试剂盒；
[0008] 本发明另一个目的是提供一种采用上述试剂盒检测罂粟壳成分的方法，该方法具 有快速、检测灵敏度高、操作简单、结果直接可以判读等特点。
[0009] 为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
[0010] 一种基于LAMP技术检测罂粟壳成分用的引物，其特征在于包括：
[0026] 其中所述引物包括：
[0039] 一种基于LAMP技术检测罂粟壳成分的方法，其特征在于包括以下步骤：
[0040] A、罂粟DNA的提取
[0041] 采用纳米磁珠提取罂粟DNA;
[0042] B、建立LAMP反应体系
[0043] 25yL的LAMP反应体系包括20yL预反应溶液和5yLDNA模板，其中20yL预反 应溶液，由以下组分组成：
[0044]
[0058] C、向Loopamp反应试管中分别加入上述预反应溶液各20yL;
[0059] D、在预反应溶液中加入待检测的待检测样品DNA5yL，使总量达到25yL;
[0060] E、对照反应中，阴性对照反应使用大豆DNA5yL，空白对照反应使用去离子水 5yL，阳性对照使用鱼翅本身提取的DNA5yL;
[0061] F、用移液器吸排液法混合，或者合上盖子轻击使溶液充分混合后瞬时离心；
[0062] G、将混合物置于LAMP浊度仪的反应孔中，于60-70 °C恒温反应90min，最后 60-80°C下保温5min以结束反应；
[0063] H、采用LAMP浊度仪方法或荧光目测的方法检测检验结果。
[0064] 如上所述的一种基于LAMP技术检测罂粟壳成分的方法，其特征在于所述（正向外 引物F3+反向外引物B3):(正向内引物FIP+反向内引物BIP)的浓度比为1:2-1:10。
[0065] 如上所述的一种基于LAMP技术检测罂粟壳成分的方法，其特征在于所述的FIP和 BIP各I. 6yM，各 40pmol;F3 和B3 各 0? 2yM，各 5pmol〇
[0066] 如上所述的一种基于LAMP技术检测罂粟壳成分的方法，其特征在于步骤A中所述 的纳米磁珠提取鱼翅DNA具体步骤：
[0067] 1)制样：取0.Ig的罂粟组织加入ImL抽提缓冲液进行研磨，得样品；
[0068] 2)清洗纳米磁珠：取出纳米磁珠到PCR管中，用ddH20反复清洗纳米磁珠3次，在 磁铁的作用下吸去ddH20 ;
[0069] 3)结合：加入100yL的样品到PCR管中，用移液枪吸吐混匀样品和纳米磁珠，室 温下吸附；
[0070] 4)清洗：在磁铁的作用下移去上清，纳米磁珠清洗3次；
[0071] 5)裂解：加入50yLddH20到PCR管中，用移液枪吸吐混匀纳米磁珠后，95°C， IOmin；
[0072] 6)取样：用磁铁吸附纳米磁珠，待PCR管内溶液澄清后，上清即为罂粟DNA，取 IyL样品进彳丁PCR;
[0073] 如上所述的一种基于LAMP技术检测罂粟壳成分的方法，其特征在于所述的LAMP 浊度仪方法包括有实时浊度检测和/或终点度检测。
[0074] 如上所述的一种基于LAMP技术检测罂粟壳成分的方法，其特征在于所述荧光目 测的方法：
[0075] 使用紫外线照射装置从试管底部向上进行照射，佩戴紫外防护眼镜从试管侧面进 行观查；如果与阳性对照一样发出绿光，则判定为阳性，如果与阴性对照一样没有发出荧 光，而判定为阴性。
[0076]本发明米用环介导等温扩增loop-mediatedisothermalamplification，简称LAMP是一种新的核酸检测方法，其原理是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的 DNA聚合酶，在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在1小时内能扩增 出IO9祀序列拷贝，扩增产物电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。 传统的PCR技术，PCR结束后，需要对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测，操作 步骤繁琐，费时费力，而且存在溴化乙锭或同位素对人体和环境的危害。而本研究所建立的 LAMP技术检测鱼翅省时、经济且敏感性高。检测结果只需利用LAMP浊度仪或者SYBG的绿 色荧光或通过目测是否产生白色沉淀就知道反应是否发生，而不需要烦琐的凝胶电泳检测 过程。
[0077] 综上所述，本发明的有益效果：
[0078] 本发明采用磁珠法提取罂粟的DNA并根据罂粟黄连素桥酶基因设计了检测罂粟 的LAMP扩增的特异性引物，且建立了罂粟LAMP检测的体系，通过本体系可以在一个小时内 高灵敏度的检测出罂粟成分的存在，检测灵敏度达到l〇fg，比普通PCR要高出一千