进行了检测极限（LoD;NCCLS指导纲要化SI EP17-A2)确定研究。
[0116] 使用W前描述的PCR巧位系统，试验了突变水平为20%、15%、10%、5%和2%的 6种IMll突变的连续稀释液。
[0117] 所述分析方法是基于使用含有寡核巧酸阻断物的反应混合物获得的Ct 仅扩增突变序列）与使用相同但不含寡核巧酸阻断物的反应混合物获得的Ct样品（C^; 突变和WT序列被一起扩增）之间的ACt比较
[0118] ACt二Ct突变体-Ct总
[0119] 为6种IMll突变的每种和5种突变水平的每种产生ACt数据（表5)，并且基于 在化SI/N(XLSEP17-A指导纲要中描述的"精密剖析方法"(precisionprofileapproach) 确定LoD。如表5中所示，使用本发明的PCR方法，可W检测到低至2. 23%的突变水平（取 决于突变的类型）。 阳120] 表5 :6种IMll突变的LOD概述
[0121]
阳1。] 3.伸用本发巧的宴核巧酸附断物巧得的忡能，与化核酸巧NA)宴聚物讲行比巧
[0123] 执行PCR错位W便检测变体序列的最常用方法使用PM(肤核酸）寡聚物。PM寡 聚物具有与3'修饰的寡核巧酸阻断物相同的功能，但是由于更高的DNA亲和性，它们通常 允许在WT与变体序列检测之间更好地辨别。 阳124] 设计了 4种PNA寡聚物（参见表6)。如前所述，将它们与竞争PCR引物、第二PCR引物和探针混合。所试验的样品是WT样品和R132H&R132C突变样品。 阳125] 表6 :PNA寡聚物的序列。 阳 126]
阳127] 粗体的核巧酸示出了IDHl变体序列的位置。.
[0128] 下面的表示出了使用4种PM寡聚物和使用d7寡核巧酸阻断物在相同样品上获 得的结果。
[0129] 表7 :使用PNA寡聚物（dl至d4)或d7寡核巧酸阻断物在WT和I畑1变体样品上 获得的Ct结果。 阳 130]
阳131] 在WT样品上的最高Ct与对于突变样品来说的最低Ct相关联的组合中获得了最 佳结果。正如可W在表7中看到的，在PM寡聚体中，d3PNA寡聚体是显示出最佳性能的寡 聚体，允许最好地辨别WT和变体序列，并且d7寡核巧酸阻断物显示出与d3PNA寡聚体的性 能可比的性能（参见下面的表8)。 阳1巧 表8 : 阳1；33]
[0134] 参考文献
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【主权项】
1. 一种用于从核酸样品选择性扩增靶DNA序列的体外方法，所述方法包括： a. 提供怀疑包含至少一个靶DNA序列的核酸样品，所述靶DNA序列与参比DNA序列在 至少一个靶突变位点处不同； b. 添加以下物质以便形成反应混合物： i) 正向引物寡核苷酸和反向引物寡核苷酸，其与所述靶突变位点周围的所述参比DNA 序列的一部分完全互补， ii) 阻断性寡核苷酸，其被设计成与所述引物寡核苷酸之一竞争，并被修饰以使其不能 被聚合酶延伸； c. 通过聚合酶链反应（PCR)对所述反应混合物进行扩增，由此延伸所述引物寡核苷酸 以便选择性扩增所述靶DNA序列； 其中所述方法的特征在于所述阻断性寡核苷酸与包含所述靶突变位点的所述参比DNA 序列的一部分互补，但是在所述靶突变位点的外部包含至少一个与所述参比DNA序列的错 配。2. 权利要求1的方法，其中所述靶突变位点包含一个或几个核苷酸的替换、一个或几 个核苷酸的缺失或一个或几个核苷酸的插入。3. 权利要求2的方法，其中所述靶突变位点包含单个核苷酸替换。4. 权利要求1至3任一项的方法，其中所述阻断性寡核苷酸中的所述错配位于所述靶 突变位点的上游，即在5'区域中。5. 权利要求1至4任一项的方法，其中所述阻断性寡核苷酸的3'-末端被修饰以抑制 由聚合酶引起的延伸。6. 权利要求5的方法，其中所述阻断性寡核苷酸上的3' -末端包含C3间隔物、C6胺 或磷酸基团。7. 权利要求1至6任一项的方法，其中所述阻断性寡核苷酸是单链DNA、RNA、肽核酸或 锁核酸之一。8. 权利要求1至7任一项的方法，其中阻断性寡核苷酸序列被设计成与它所竞争的引 物寡核苷酸相比具有更高的解链温度（Tm)和/或以更高的浓度添加。9. 权利要求1至8任一项的方法，其中所述阻断性寡核苷酸以与它所竞争的引物寡核 苷酸的浓度相比高至少4或5倍的浓度添加。10. 权利要求1至9任一项的方法，其中所述反应混合物还含有核酸检测染料。11. 权利要求1至10任一项的方法，其中所述反应混合物还含有探针，优选为标记的探 针。12. 权利要求11的方法，其中所述探针是水解探针。13. 权利要求10至12任一项的方法，其中所述PCR是定量PCR。14. 一种用于在核酸样品中检测和/或确定靶突变的方法，所述方法包括：对怀疑包含 至少一个靶DNA序列的核酸样品进行权利要求1至13任一项的扩增方法，所述靶DNA序列 与参比DNA序列在至少一个靶突变位点处不同；以及检测和/或确定已被扩增的靶DNA序 列的所述靶突变。15. 权利要求14的方法，其包括通过使用选自下列的一种或多种方法确定所述已被扩 增的靶DNA序列的所述靶突变：MALDI-TOF、HR熔解、双脱氧测序、单分子测序、焦磷酸测序、
【专利摘要】本发明涉及用于从核酸样品选择性扩增靶DNA序列的体外方法，所述方法包括对怀疑包含至少一个靶DNA序列的核酸样品运行PCR扩增，所述靶DNA序列与参比DNA序列在至少一个预定靶突变位点处不同；其中所述方法利用了阻断性寡核苷酸，其除了所述靶突变位点外部的至少一个错配之外，与包含所述靶突变位点的所述参比DNA序列的一部分互补。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105164280
【申请号】CN201480024316
【发明人】奥利维尔·比利亚
【申请人】凯杰马赛公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2014年4月29日
【公告号】WO2014177540A1