强直性肌营养不良1型的诊断方法
【技术领域】
[0001] 本专利申请于2013年4月18日提交韩国特许厅，申请号为10-2013-0042873的 韩国专利申请的优先权，上述专利申请的全部内容通过引用结合在本申请中。
[0002] 本发明设及强直性肌营养不良1型的诊断方法。
【背景技术】
[0003] 强直性肌营养不良1型作为在韩国人当中最频繁发生的遗传性肌肉疾病，是W肌 强直（myotonia)和活动性体力衰弱为特征的常染色体显性遗传疾病。上述疾病具有与肌 肉相关的症状一同导致屯、脏、眼睛、内分泌器官、消化器官及中枢神经系等多个器官的异常 的特征（HarperPSetal.，DGM.Myotonicdystrophy,inEn邑elAG,Franzini-Armstron邑 C(eds):Myology(ed3).In.化WYork:NY，McGrawHillProfessional,2004:1039-76)。根 据源因基因，分为强直性肌营养不良I型和强直性肌营养不良2型值Mtypel，2,DMl，DM2)。 在存在于对强直性肌营养不良蛋白激酶（DMPK，DystrophiaMyotonicaProteinKinase) 进行编码的19号染色体基因的3'非翻译区中，由CTGS碱基序列非正常增加来发现强直 性肌营养不良1型，通过在位于第S号染色体巨臂（3q21)的锋指蛋白狂NF9)基因内含子 1的CCTG四碱基的不稳定扩张来发生强直性肌营养不良2型。
[0004] 尤其，强直性肌营养不良1型主要在长成成人之后呈现出身体上的障碍，由此，对 已经发生症状的患者或已被诊断疾病的患者家属执行强直性肌营养不良1型的诊断。W 往，利用分子生物学方法来确认强直性肌营养不良蛋白激酶基因的变异程度，从而目前为 止一直进行着有关诊断疾病的方法的研究，而且主要使用利用聚合酶链式反应或印记杂交 的方法。 阳0化]另一方面，强直性肌营养不良1型没有特殊的症状，但主要在20~30岁的成人期 时显现症状，因此，强直性肌营养不良1型会W常染色体显性形态遗传给子孙，从而早期诊 断及预防极为重要。W往强直性肌营养不良1型的诊断方法对已经发现症状的患者或已被 诊断出疾病的患者的家属执行了诊断，但对上述疾病而言，判断携带者及判断向子孙遗传 的危险性更为重要。
[0006] 因此，对育龄女性及胎儿来说，强直性肌营养不良1型的诊断极为重要，而且本发 明的诊断方法可通过预测疾病的罹患可能性W及严重程度来更为积极地进行预防。强直性 肌营养不良1型作为遗传病，除怀孕前或怀孕初期预防之外没有更有效的预防方法，需要 确保对强直性肌营养不良1型的诊断方法。
[0007] 在本说明书全文中，参照了多篇论文及专利文献，并表示了其引用。所引用的论文 及专利文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技 术领域的水平及本发明的内容。
【发明内容】
阳00引技术问题
[0009] 本发明人员为了开发用于强直性肌营养不良I型早期诊断的方法而进行了精屯、 的研究。结果，开发出当具有强直性肌营养不良蛋白激酶基因的CTG重复序列增加的等位 基因的携带者或症状轻微的患者生孩子时，利用CTG重复序列导致的疾病的发生，来在孕 妇、育龄女性或新生儿的对象集体中找出携带者或具有轻微症状的患者之后，对胎儿执行 检查，来判定是否存在疾病罹患的诊断方法，由此完成了本发明。 阳010] 因此，本发明的目的在于，提供强直性肌营养不良1型（Myotonicdystrophytype I)的诊断方法。
[0011] 本发明的另一目的在于，提供强直性肌营养不良1型患者的计算机-执行 (computer-implemented)鉴别方法（identificationmethod)。
[0012] 本发明其他目的和优点通过
【发明内容】
，发明要求保护范围及附图变得更加明确。 阳01引解决问题的手段
[0014] 根据本发明的一实施方式，本发明提供强直性肌营养不良1型的诊断方法，上述 强直性肌营养不良1型的诊断方法为了提供强直性肌营养不良1型的诊断所需要的信息， 包括如下用于检测强直性肌营养不良蛋白激酶（dystrophiamyotonica-proteinkinase) 基因的CTG重复序列的步骤：
[0015] 步骤（a),作为在由孕妇、育龄女性或新生儿组成的对象集体中实施第一诊断检 查，来筛选呈现出阳性的个体的步骤，在从上述对象集体的生物学试样分离的核酸中测定 强直性肌营养不良蛋白激酶基因3'非翻译区的CTG序列的重复次数来实施上述第一诊断 检查，（i)在上述强直性肌营养不良蛋白激酶的两个等位基因为在CTG序列中的重复次 数为34次W下的同质接合体的情况下，或者在上述强直性肌营养不良蛋白激酶的两个等 位基因分别为在CTG序列中的重复次数为34次W下及35次W上的异质接合体的情况下， 判断为阳性，（ii)在上述强直性肌营养不良蛋白激酶的两个等位基因为在CTG序列中的 重复次数为34次W下的异质接合体的情况下，判断为阴性，（化）在除此之外的情况下，判 断为阳性；W及
[0016] 步骤化），作为对上述步骤（a)中的阳性个体实施第二诊断检查，来筛选呈现出阳 性的个体的步骤，在从上述步骤（a)的阳性个体的生物学试样分离的核酸中测定强直性肌 营养不良蛋白激酶基因3'非翻译区的CTG序列的重复次数来实施上述第二诊断检查，（i) 虽然在上述第一诊断检查中，强直性肌营养不良蛋白激酶的两个等位基因作为在CTG序列 中的重复次数为34次W下的同质接合体而判断为阳性，但在第二诊断检查中，当在强直性 肌营养不良蛋白激酶的两个等位基因中未发现CTG序列的重复次数为35次W上的等位基 因的情况下，判断为阴性，（ii)在上述第一诊断检查的阳性个体中，当在强直性肌营养不 良蛋白激酶的两个等位基因中发现CTG序列的重复次数为35次W上的等位基因的情况下， 判断为阳性。
[0017] 本发明人员为了开发用于强直性肌营养不良1型的早期诊断的方法而进行了精 屯、的研究。结果，开发出当具有强直性肌营养不良蛋白激酶基因的CTG重复序列增加的等 位基因的携带者或症状轻微的患者生孩子时，利用CTG重复序列导致的疾病的发生，来在 孕妇、育龄女性或新生儿的对象集体中找出携带者或具有轻微症状的患者之后，对胎儿执 行检查，来判定是否存在疾病罹患的诊断方法。
[0018] 本发明的诊断方法不仅可适用于作为常染色体显性疾病（autosomaldominant disorder)的强直性肌营养不良I型，而且还适用于可通过基因的异常罹患的其他遗传疾 病的筛选，来提供对基于遗传疾病进展的并发症或对后天性障碍的重要信息。
[0019] 本发明的诊断方法虽然被记载为"为了提供强直性肌营养不良1型的诊断所需要 的信息而检测强直性肌营养不良蛋白激酶基因的CTG重复序列的诊断方法"，但运为了提供 强直性肌营养不良1型的诊断所需要的信息，还可W表达为"检测强直性肌营养不良蛋白 激酶基因的CTG重复序列的方法"或"包括确认向体外分离的动物的生物学试样内强直性 肌营养不良蛋白激酶基因的CTG重复序列的步骤的强直性肌营养不良1型的诊断方法"。
[0020] 在本说明书中，术语"生物学试样"作为向体外分离的动物的生物体试样，意味着 血液、血浆、血清、尿、细胞、毛发或组织试样，根据本发明的具体的一实施例，上述生物学试 样为血液、毛发或口腔黏膜细胞。另一方面，当诊断对象（SUbect)为胎儿的情况下，上述生 物学试样包括绒毛膜、羊水、胎盘或厮带血。
[0021] 在本说明书中，术语"核酸"不仅具有全面包含脱氧核糖核巧酸（基因组脱氧 核糖核酸及互补脱氧核糖核酸）还有核醋核酸分子的含义，而且在核酸分子中，包含作 为基本结构单位的核巧酸不仅包括自然的核巧酸，还包括糖或碱基部位变形而成的类似 物（analogue) (Scheit，NucleotideAnalogs,JohnWiley,化WYork(1980);Uhlman及 化yman，QiemicalReviews,90:543-584(1990))。
[0022] W下，对基于上述本发明的方法的强直性肌营养不良I型的诊断方法进行详细的 说明： 阳〇2引步骤（a):第一诊断检查
[0024] 首先，在由孕妇、育龄女性或新生儿组成的对象集体中实施第一诊断检查来筛选 呈现出阳性的个体。
[00巧]上述第一诊断检查在从上述对象集体的生物学试样分离的核酸中测定强直性肌 营养不良蛋白激酶基因3'非翻译区的CTG序列的重复次数。目P，可通过对强直性肌营养不 良蛋白激酶基因3'非翻译区的增殖反应来测定CTG序列是否重复及重复次数。
[00%] 在本说明书中，术语"增殖反应"是指基因（gene)或核酸分子的增殖。虽然本 发明所属技术领域已知多种增殖反应，且运里包括聚合酶链式反应（W下称为PCR)(美 国专利第4683195号、4683202号及4800159号）、逆转录聚合酶链式反应（W下标记为 RT-PCR)、（Sambroo等，MolecularCloning.ALaboratoryManual，3rded.ColdSpring HarborPress(2001))、Miller,H.I.(WO89/06700)及Davey，C.等巧P329,822)的方 法，连接酶链反应（ligasechainreaction,LCR)17、18，Gap-LCR(W0 90/01069)、修复链 式反应（repairchainreaction，EP439, 182)、牵专录介导扩增（transcription-mediated a