s aquati州S)灯日9)DNA聚合酶和强烈火球菌（Pyrococcusfuriosus) (Pfu)DNA聚合酶。术语 "核酸聚合酶"还涵盖RNA聚合酶。如果核酸模板是RNA，则"核酸聚合酶"是指RNA依赖性 聚合活性，例如反转录酶。
[0070] 例如，所述反应混合物可能还含有核酸检测染料，例如巧光染料（例如DAPI、 Hoechst染料、PicoGreen、I^iboGreen、OliGreen和花青染料例如Y0-Y0、漠化乙锭和 SybrGreen)。
[0071] 在优选实施方式中，所述反应混合物可能还含有探针，优选为标记的探针。
[0072] 有利情况下，探针不与引物或阻断性寡核巧酸交叠。 阳073] 运对于定量PCR(qPCR)来说是特别有用的。
[0074] 探针是与祀DNA上存在于正向巧'）和反向（3' )PCR引物结合位点之间的序列退 火的寡核巧酸。探针的Tm-般高于引物的时1。水解探针例如化qman探针是特别有利的。 运样的探针依赖于Taq聚合酶的5' -3'外切核酸酶活性，所述活性在PCR的延伸步骤期间 降解杂交的不可延伸的DNA探针。运种探针被设计成杂交到扩增子内的区域，并用报告染 料和泽灭染料双重标记。泽灭剂的近邻抑制报告染料的巧光。一旦Taq聚合酶的外切核酸 酶活性降解探针后，报告物的巧光W与存在的模板量成正比的速率增加。
[0075] 在优选实施方式中，探针可W用5'报告染料（例如FAM、6-簇基巧光素）和3'泽 灭染料（例如TAMRA、6-簇基四甲基罗丹明）标记，只要两种染料近邻或附连于探针，所述 泽灭染料即可泽灭报告染料的发射光谱。通过设及在两个引物识别序列之间的位点处退火 到祀模板的双标记的产巧光探针的聚合酶诱导的核裂解降解的过程，探针发出PCR扩增子 形成的信号。参见例如美国专利号6, 387, 652。
[0076] 扩增反应
[0077] 本发明的扩增通过聚合酶链反应（PCR)进行。
[0078] 在其最简单形式中，PCR是使用杂交到祀DNA中的相反链并位于目标区域两侧的 两条寡核巧酸引物酶法合成特定DNA序列的体外方法。包括模板变性、引物退火和由DNA 聚合酶引起的退火引物的延伸的一系列重复的反应步骤，导致其末端由引物的5'末端定义 的特定片段的指数性积累。
[00巧]因此，本文中描述的PCR优选地重复2个或更多个循环，优选地10至50个循环。
[0080] PCR使用模板DNA(祀和参比序列）（至少Ifg;更有用的情况下，1-100化g)和至 少7. 5pmol寡核巧酸引物来进行。典型的反应混合物包括：5y1DNA，7. 5pmol寡核巧酸引 物，12. 5y1来自于如antiTect探针PCR试剂盒的2X主混合物和去离子水，至25y1的总 体积。PCR使用可编程热循环仪来进行。
[0081] 根据本发明，引物W约100至约500nM、优选地约300nM的浓度使用，而阻断性寡核 巧酸W约1至约5yM、优选地约2yM的浓度使用。
[0082] PCR循环的每个步骤的长度和溫度W及循环的数量，按照效果上的严紧性要求进 行调整。退火溫度和时间安排两者由预期引物退火到模板的效率和将要耐受的错配程度所 决定。优化引物退火条件的严紧性的能力，完全在本领域技术人员的知识之内。使用3(TC至 72°C之间的退火溫度。模板分子的初始变性通常在92°C至99°C之间进行约15秒，优选地进 行约1或4分钟至约10-15分钟，然后对于简单PCR来说进行20-50个由变性巧4-99°C15 秒至1分钟）、退火（溫度如上讨论的来确定，例如60°C;15s至2分钟）和延伸（72°C1分 钟）构成的循环（在q-PCR中，延伸和退火在60°C步骤中同时进行Imin)。任选的最终延 伸步骤（在简单PCR中有用）一般在72°C进行约4分钟，并且可W跟随有无限的（0-24小 时）在4°C的步骤。
[0083] 本发明的扩增或富集程序在PCR装置例如热循环仪中，或者更优选地在实时反应 条件下在实时PCR装置中进行。实时反应条件还利用核酸检测试剂（例如染料或探针）W 便测量/检测产生的PCR产物。
[0084] 方法的步骤一般重复多个循环W便获得祀和参比序列的足够扩增。在一种实施方 式中，将方法的步骤重复5-40个循环，更优选地10-40个循环。循环的最适数量可W由本 领域普通技术人员确定。优选地，本发明的方法在PCR装置中，更优选地在实时反映条件下 在实时检测PCR装置例如Rotor-GeneQSplexHRM机中进行。在运种实施方式中，反应混 合物可W包括用于定量和/或检测反应的扩增产物的核酸检测试剂。 阳0化]分析
[0086] 祀序列的扩增可W跟随有被扩增序列的分析，例如精确确定祀序列的突变的方 法。
[0087] 一旦祀序列的扩增或富集完成后，可W因此对样品进行进一步处理，例如进行测 序反应。
[0088] 被扩增的等位基因可W通过本领域中已知的各种不同程序进一步处理，包括： MLDI-T0F，HR烙解，双脱氧测序，单分子测序，第二代高通量测序，焦憐酸测序，RFLP，数字 PCR，ARMS-PCR和定量PCR。
[0089] 运样的分析方法使得可W鉴定被扩增的祀序列的突变类型。
[0090] 下面的实施例说明本发明但不限制其范围。
[0091] 实施例：1畑1基因中突变的检测
[0092] 本文描述的发明是一种用于选择性扩增在所选区域中含有核巧酸变异的DNA或 CDNA祀序列的基于PCR的方法。反应混合物含有两个通用PCR引物（"竞争PCR引物"和 "第二PCR引物"）和一个特异性阻断性寡核巧酸（"寡核巧酸阻断物"）。
[0093] 本发明通过检测IMll基因中的突变来说明。
[0094] 在神经胶质瘤中和血液恶性肿瘤中已发现密码子132处的IMll突变。由于突变 和野生型序列相差仅仅一个核巧酸的替换（参见图2)，因此需要允许选择性辨别野生型和 突变序列的特异性PCR方法。 W巧]材料
[0096] 试验了对本发明的寡核巧酸阻断物（带有核巧酸错配）的不同设计（RVS_ R132Blc_d5至RVS_R132Blc_d8,表1)，并与没有错配的相应寡核巧酸阻断物（RVS_ R132Blc_dl至RVS_R132Blc_d4,表1)进行比较。所有寡核巧酸阻断物含有3'憐酸醋修饰。
[0097] 表1 :所试验的用于I畑1R132突变检测的不同寡核巧酸阻断物的序列和时1。对于 寡核巧酸阻断物RVS_R132Blc_d5至RVS_R132Blc_d8来说，错配的核巧酸被突出并用小写 字母。对于每个寡核巧酸阻断物来说，变体位置被突出并下划线。
[0098]
[0099] 竞争PCR引物、第二PCR引物和探针的序列提呈在下面的表中。探针在其5'末端 处用巧光染料（FAM)标记并在其3'末端处用泽灭染料（TAMRA)标记。运些引物和探针W 前从几种引物和探针设计中选择。 阳100] 表2:竞争PCR引物、第二PCR引物和探针的序列和Tm。竞争PCR引物与寡核巧酸 阻断物之间的共有序列被下划线。
[0101]
阳102] PCR引物、寡核巧酸阻断物和探针的浓度在下面列出： 阳103]
阳104] 使用如antitect探针PCR试剂盒（QIAGEN，参见：2043侣）进行扩增，qPCR反应在 Rotor-GeneQSplexHRM机（QIAGEN)上，使用下面的qPCR程序进行： 阳1〇5] 表3.qPCR程序 阳106]
[0107] 对于试验的每种寡核巧酸阻断物来说，将寡核巧酸阻断物与竞争PCR引物、第二 PCR引物和探针混合。将所有运些混合物，在含有从福尔马林固定、石蜡包埋（FFP巧的 组织（I畑1WT)提取的基因组DNA(曲NA)的样品上，在不存在或存在含有I畑1R132H或 IDH1R132C突变的质粒的情况下进行试验。试验了S个样品：100%WT样品（对任何I畑1 突变阴性），突变水平为10%的IM^1R132H样品，和突变水平为30%的ID化R132C样品。每 个qPCR反应的基因组DNA(曲NA)输入量，对于25y1的最终PCR体积来说为25ng。 阳10引 W 1.伸用本发巧的宴核巧酸附断物巧得的忡能，与汲有错配的宴核巧酸附断物讲行 比巧
[0110] 下面的表示出了使用本发明的寡核巧酸阻断物获得的结果，并与没有错配的寡核 巧酸阻断物进行比较。 阳11U表4 :使用8种不同的寡核巧酸阻断物设计（四种含有错配，d5至d8,四种没有错 配，dl至d4)在突变巧132C和R132H)和WT样品上获得的Ct(循环阔值）。 阳112]
阳113] 在WT样品上的最高Ct和对突变样品来说最低Ct的组合中获得了最佳结果。正 如可W在表4中看到的，与没有错配的相应寡核巧酸阻断物相比，在寡核巧酸阻断物中添 加核巧酸错配允许在突变样品上获得更低Ct值。例如，使用本发明的d7寡核巧酸阻断物 对IM11R132C突变体获得的Ct等于28. 74,与此相比使用d3寡核巧酸阻断物时为40. 73。 因此，在寡核巧酸阻断物中添加核巧酸错配，允许更好地辨别WT和突变样品。 阳114] 2.伸用本发巧的宴核巧酸附断物的灵敏麼试輪结果
[0115] 然后，使用d7寡核巧酸阻断物