一株盐单胞菌多基因敲除株的构建和应用的制作方法

专利名称：一株盐单胞菌多基因敲除株的构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及盐单胞菌多基因敲除株的构建和应用。
背景技术：
聚轻基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,简称PHA)是一种环境友好型塑料,具有良好的生物相容性、生物可降解性、压电性等优良特性，近年来已经成为生物材料领域最为活跃的研究热点，成为能够替代石油化工 塑料，解决能源危机和环境污染的新型材料。PHA是许多微生物在碳、氮营养失衡的情况下合成的一种能作为碳源和能源的贮存颗粒，能够通过微生物发酵获得。虽然近十年来PHA产业链发展迅猛，但PHA制造过程的复杂性使其制造成本高昂，无法与以石油为基础的传统材料竞争。主要原因包括原材料成本、能耗、下游处理成本等。所以目前试图采取很多方法来降低PHA的生产成本，比如，通过基因工程改造或代谢途径改造来获得性状优良的高产菌株，探索简单有效的下游提取纯化方法，利用价格低廉的原材料等。盐单胞菌Halomonas sp. TDOl从新疆艾丁湖中分离出的一株适应范围很广的中度嗜盐菌，能在1%-20%(w/v)氯化钠条件下生长，最高生长温度为45°C，最高生长pH为11。Halomonas sp. TDOl能进行无灭菌连续发酵生产PHA,能在以葡萄糖作为单一碳源时合成聚轻基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,简称PHB),发酵60h能达到80g/L的菌体干重和占菌体干重80%的PHB含量，而以丙酸或戊酸作为辅助碳源时合成聚羟基丁酸戊酸共聚酯(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate),简称 PHBV),但由于丙酸转化率低，PHBV 中3-轻基戍酸(3-hydroxyvalerate简称3HV)单体的比例很低,材料性能差。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组菌。本发明提供的重组菌，是对生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为失活所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因；所述与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因为2-甲基柠檬酸合成酶(PrpC)编码基因、PHA降解酶I (phaZI)编码基因、PHA降解酶2 (phaZ2)编码基因和PHA降解酶3 (phaZ3)编码基因中的至少一种。上述2-甲基朽1檬酸合成酶(2-methylcitrate synthase)PrpC的核苷酸序列为序列表中的序列I ;PHA降解酶IphaZUPHA降解酶2phaZ2、PHA降解酶3phaZ3的编码基因的核苷酸序列依次为序列表中的序列2，3，4。上述重组菌中，所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌为 Halomonas sp. TD01，保藏号为 CGMCC No. 4353。上述重组菌中，所述失活生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中的与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因为删除各种所述基因的全部编码框，即敲除各种所述基因的全部编码框。本发明的另一个目的是提供一种构建上述重组菌的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤失活生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中的上述与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因，得到的重组菌；所述失活生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中的所述与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因具体通过同源重组实现。上述与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因为2-甲基柠檬酸合成酶编码基因、PHA降解酶I编码基因、PHA降解酶2编码基因和PHA降解酶3编码基因中的至少一种。上述方法中，所述同源重组包括如下步骤I)将含有待敲除基因同源臂的DNA分子插入自杀质粒中，得到重组自杀质粒；所述含有待敲除基因同源臂的DNA分子由在所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞
菌基因组中待敲除基因的上下游两条同源臂组成；2)将所述重组自杀质粒导入出发菌中，重组自杀质粒通过同源重组整合至基因组的特定位置，得到同源重组菌I ;3)将诱导质粒导入所述同源重组菌I中，诱导质粒表达的归位内切酶I-SceI在同源重组菌I基因组的6个I-SceI位点进行切割，产生双链的DNA缺口，能诱导二次同源重组的发生，即得到所述重组菌。在上述方法的步骤3)中，还包括将诱导质粒导入所述同源重组菌I中得到的阳性克隆进行阿拉伯糖诱导，得到所述重组菌的步骤。上述方法中，所述生产聚轻基脂肪酸酯的盐单胞菌为Halomonas sp. TD01,保藏号为 CGMCC No. 4353 ；所述自杀质粒为带有6个I-SceI位点的自杀质粒pRE112-phaABC-6IsceI ；所述诱导质粒为表达归位内切酶I-SceI的质粒pMCSl_Spe_araC_ISceI。上述方法中，所述同源重组中，步骤I)的所述待敲除基因为2-甲基柠檬酸合成酶编码基因，步骤2)的出发菌为所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌，步骤3)得到重组菌A ;具体如下I)将含有2-甲基柠檬酸合成酶编码基因同源臂的DNA分子(序列7)插入自杀质粒pRE112-phaABC-6IsceI的XbaI和SacI酶切位点间，得到重组自杀质粒pRE112-phaABC_6IsceI_A ；2)将上述重组质粒pRE112-phaABC-6IsceI_A作为目标质粒先通过电转化方法转入大肠杆菌S17-lpir中，然后通过接合转化方法转入Halomonas sp. TDOl中，利用自杀质粒不能在宿主菌内复制的特性，用25μ g/mL氯霉素抗性的60LB平板筛选出同源重组菌I ;3)将pMCSl-Spe-araC-IScel导入所述同源重组菌I中，在阿拉伯糖诱导下培养，得到所述重组菌A (Halomonas sp. TD04)。上述方法中，所述同源重组中，步骤I)的所述待敲除基因为PHA降解酶I编码基因，步骤2)的出发菌为所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌，步骤3)得到重组菌B(Halomonas sp. TD02);具体如下I)将含有PHA降解酶I编码基因同源臂的DNA分子(序列8)插入自杀质粒pRE112-phaABC-6IsceI的XbaI和SacI酶切位点间，得到重组自杀质粒pRE112-phaABC_6IsceI_B ；2)将上述重组质粒pRE112-phaABC-6IsceI_B作为目标质粒先通过电转化方法转入大肠杆菌S17-lpir中，然后通过接合转化方法转入Halomonas sp. TDOl中，利用自杀质粒不能在宿主菌内复制的特性，用25μ g/mL氯霉素抗性的60LB平板筛选出同源重组菌I ;3)将pMCSl-Spe-araC-IScel导入所述同源重组菌I中，在阿拉伯糖诱导下培养，得到所述重组菌B (Halomonas sp. TD02)。上述方法中，对所述重组菌B进行上述的方法中的同源重组，步骤I)的所述待敲除基因为PHA降解酶2编码基因，步骤2)的出发菌为所述重组菌B，步骤3)得到重组菌C ；具体如下I)将含有PHA降解酶2编码基因同源臂 的DNA分子(序列9)插入自杀质粒pRE112-phaABC-6IsceI的XbaI和SacI酶切位点间，得到重组自杀质粒pRE112-phaABC-6IsceI-C ；2)将上述重组质粒pRE112-phaABC-6IsceI_C作为目标质粒先通过电转化方法转入大肠杆菌S17-lpir中，然后通过接合转化方法转入重组菌B (Halomonas sp. TD02)中，利用自杀质粒不能在宿主菌内复制的特性，用25 μ g/mL氯霉素抗性的60LB平板筛选出同源重组菌I ;3)将pMCSl-Spe-araC-IScel导入所述同源重组菌I中，在阿拉伯糖诱导下培养，得到所述重组菌C (Halomonas sp. TD03)。上述方法中，对所述重组菌C进行上述的方法中的同源重组，步骤I)的所述待敲除基因为PHA降解酶3编码基因，步骤2)的出发菌为所述重组菌C，步骤3)得到重组菌D ；具体如下I)将含有PHA降解酶3编码基因同源臂的DNA分子(序列10)插入自杀质粒pRE112-phaABC-6IsceI的XbaI和SacI酶切位点间，得到重组自杀质粒pRE112-phaABC_6IsceI_D ；2)将上述重组质粒pRE112-phaABC-6IsceI_D作为目标质粒先通过电转化方法转入大肠杆菌S17-lpir中，然后通过接合转化方法转入重组菌C (Halomonas sp. TD03)中，利用自杀质粒不能在宿主菌内复制的特性，用25 μ g/mL氯霉素抗性的60LB平板筛选出同源重组菌I ;3)将pMCSl-Spe-araC-IScel导入所述同源重组菌I中，在阿拉伯糖诱导下培养，得到所述重组菌D (Halomonas sp. TD05)。上述方法中，对所述重组菌D进行上述的方法中的同源重组，步骤I)的所述待敲除基因为2-甲基柠檬酸合成酶编码基因，步骤2)的出发菌为所述重组菌D，步骤3)得到重组菌E ;具体如下I)将含有2-甲基柠檬酸合成酶编码基因同源臂的DNA分子(序列7)插入自杀质粒pRE112-phaABC-6IsceI的XbaI和SacI酶切位点间，得到重组自杀质粒pRE112-phaABC_6IsceI_A ；2)将上述重组质粒pRE112-phaABC-6IsceI_A作为目标质粒先通过电转化方法转入大肠杆菌S17-lpir中，然后通过接合转化方法转入重组菌D (Halomonas sp. TD05)中，利用自杀质粒不能在宿主菌内复制的特性，用25 μ g/mL氯霉素抗性的60LB平板筛选出同源重组菌I ;3)将pMCSl-Spe-araC-IScel导入所述同源重组菌I中，在阿拉伯糖诱导下培养，得到所述重组菌E (Halomonas sp. TD08)。上述制备方法得到的重组菌也是本发明保护的范围。上述的重组菌在制备聚羟基丁酸戊酸共聚酯中的应用也是本发明保护的范围。上述的重组菌在提高聚羟基丁酸戊酸共聚酯中3-羟基戊酸单体所占的摩尔百分比中的应用也是本发明保护的范围。本发明的第三个目的是提供一种制备聚羟基丁酸戊酸共聚酯的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤在含有丙酸的发酵培养基中发酵培养上述的重组菌，收集菌体，即得到聚羟基丁酸戊酸共聚酯。上述方法还可以包括如下步骤进行纯化抽提聚羟基丁酸戊酸共聚酯取冰干后菌体用氯仿抽提得到PHBV，具体方法为氯仿干菌体=10:1混合后，加盖密闭，1001处理4小时，冷却至室温后，加入等体积蒸馏水，充分振荡混匀，静置分层。取下层氯仿层，加入过量冰乙醇沉淀，晾干后得到PHBV粉末。上述方法中，所基述发酵培养中的丙酸终浓度为O. 5g/L_lg/L，发酵培养基中的丙酸终浓度具体为O. 5g/L。上述方法中，所述发酵培养基中含有氯化钠，所述氯化钠的浓度为250g/L以下，所述发酵培养基中氯化钠的浓度具体为60g/L。上述发酵培养基为MM-G培养基，具体配方见实施例。本发明的实验证明，本发明通过对一株能够进行无灭菌连续发酵的中度嗜盐菌Halomonas sp. TDOl进行基因工程改造，失活2-甲基柠檬酸合成酶PrpC和3个PHA降解酶，得到性状更加优良的新菌株，该菌株可高效地利用丙酸生产性能优良的材料PHBV，丙酸转化为产物PHBV中3HV单体的转化率接近100%，因而PHBV中3HV的摩尔比大大提高，改善了材料性能的同时也降低了 PHBV生产的底物成本；由于一系列遗传操作手段的建立，有望使该菌株通过代谢工程改造，成为一种平台生物来无灭菌连续生产各种生物制品，大幅度降低生物制品的生产成本。


图I 为质粒 pRE112-phaABC_6IsceI 和 pMCSl-Spe-araC-IScel 的图谱。图2为PrpC敲除株Halomonas sp. TD04丙酸梯度的摇瓶实验。图3 为 PrpC 敲除株 Halomonas sp. TD04 与野生型 Halomonas sp. TDOl 生产 PHBV摇瓶对比实验。图4为PrpC敲除株Halomonas sp. TD04在发酵罐中细胞干重、PHBV含量、PHBV中3HV比例变化。图 5 为 Halomonas sp. TDOKHalomonas sp. TD04 和 Halomonas sp.TD08 摇瓶对比实验。
具体实施例方式本文所用的术语“丙酸转化率”是指丙酸转化为产物PHBV中3HV的转化率，具体为产物PHBV中3HV的浓度与丙酸消耗浓度的比值。本文所用的术语“盐单胞菌”是指盐单胞菌属，是一类能在1-25% (质量分数)的盐浓度中生长的中度嗜盐细菌，革兰氏阴性菌。本文所用的术语“PrpC”是指2-甲基柠檬酸合成酶。本文所用的术语“自杀质粒”是指不能在宿主菌中进行复制的质粒。本文所用的术语“敲除基因”是指通过将该基因的编码框全部删除，达到失活该基因的目的。本文所用的术语“失活基因”是指通过删除全部或者部分编码框，以及其他ー些方式，使该基因不能表达产物或者表达产物没有功能。本文所用细胞干重(CDW，g/L)为冰干菌体的质量与发酵产物体积的比值；本文所用PHBV含量(WT%)为PHBV的质量与參与酯化的冰干菌体质量的百分比，其中PHBV质量为酯化后得到的3HV质量与3HB的质量和。本文所用3HV (mol%)为3HV单体的摩尔数与PHBV总摩尔数的百分比，其中PHBV总摩尔数为3HV单体的摩尔数+3HB (3-hydroxybutyrate, 3_轻基丁酸)单体的摩尔数。本发明的重组菌是在生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌的基础上通过基因工程改造而获得的。基因工程操作的起始菌株可以是野生型盐单胞菌，例如Halomonas sp. TDOl ；也可以是已经经过某些基因工程改造的重组盐单胞菌，例如Halomonas sp. TD02。本领域技术人员可以理解，本发明的重组菌中还可以包含其他基因突变，以便获得某些性状，例如底物代谢能力。本领域技术人员可以根据现有技术的教导容易地引入此类突变。下面将结合实施例对本发明进行更加具体的描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用酶试剂均购自MBI Fermentas公司，提取质粒所用的试剂盒购自北京博迈德科技发展公司，提取细菌基因组及回收DNA片段所用的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。下述实施例中产聚轻基脂肪酸酯的盐单胞菌Halomonas sp. TDOl已于2010年11月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No. 4353，分类命名为盐单胞菌Halomonas sp. TDOl0下述实施例中的接合转化方法具体如下I.将含有目标质粒的大肠杆菌S17_lpir (Biovector中国质粒载体菌株基因库，货号Biovector-104802, http://biovector, blog. 163. com) 37°C培养至 0D600 0. 6-0. 8,4000rpm,4°C, IOmin离心,用新鲜LB洗漆一次并在同样条件下离心,然后用500 y I新鲜LB重悬。2.将Halomonas sp. TDOl(或其敲除突变株)在37°C过夜培养，4000rpm，4°C，IOmin离心，用新鮮含有60g/L氯化钠的LB培养基(以下简称为60LB)洗涤一次并在同样条件下离心，然后用Iml新鲜含有60g/L氯化钠的LB培养基。3. 二者各100 U I轻轻混合，并滴在30LB平板上(含有30g/L氯化钠的LB平板)中央，37°C下接合6h。4.用新鮮含有60g/L氯化钠的LB培养基Iml将上述平板上的菌苔洗下来，涂筛选平板(60LB+CmK+PH10 ;含有60g/L氯化钠的LB固体培养基，含有25 u g/mL氯霉素，PH调节为10)，倒置培养24-36小吋。挑取单菌落用目标质粒的特异性引物进行菌落PCR验证。下述实施例中的Halomonas sp. TDOl的2_甲基朽1樣酸合成酶(2-methylcitratesynthase) PrpC的核苷酸序列为序列表中的序列I ;PHA降解酶I phaZl、PHA降解酶2phaZ2、PHA降解酶3 phaZ3的编码基因的核苷酸序列依次为序列表中的序列2，3，4。实施例l、Halomonas sp. TD04菌株的构建及其功能鉴定(敲除2_甲基朽1檬酸合成酶(PrpC))经过实验摸索，发现以自杀质 粒(pRE112_phaABC_6IsceI,不能在盐单胞菌中进行复制的质粒)介导的利用同源重组进行的定向基因组DNA敲除技术是适用于Halomonassp. TDOl的高效的敲除方法。优点是可彻底对基因组DNA进行缺失突变，不存在回复突变的可能性，同时不会给基因组DNA引入任何抗性标记，利于后续分子生物学工作的进行。通过优化负筛方式，即通过额外表达归位内切酶I-Scel，在插入突变株基因组的6个I-SceI位点进行切割产生双链的DNA缺ロ，能強烈诱导第二次同源重组的发生，相对于传统的高蔗糖负筛方法，敲除效率大大提高。这种负筛方式在大肠杆菌中被证明有效[(;yfirgyPosfai et al. Markeriess gene replacement m Escherichia coll stimulated by adouble-strand break in the chromosome. Nucleic Acids Res 1999，27:4409-4415],但在Halomonas sp. TDOl中是首次成功被应用。一、Halomonas sp. TD04 菌株的构建I、构建敲除载体以Halomonas sp. TDOl 的基因组 DNA 为模板，用引物 prpC-Hl-F (ATCG TCTAGAGGGCTTAGACGCTGCCATCG，斜体加粗为XbaI酶切位点及保护碱基，下同)和引物prpC_Hl-R(￡TTCTCAGGACCAGTGTAGTCGGCGCTTTGTCCACGGAGTCCT,划线部分为重叠序列便于讲行重叠延伸PCR (简称SOE PCR)，下同)进行扩增，得到501bp的产物(HI片段，2-甲基柠檬酸合成酶编码基因的上游同源臂)；用 prpC-H2-F (AGGACTCCGTGGACAAAGCGCCGACTACACTGGTCCTGAGAAG)和 prpC-H2-R (ATCG 'GAGCTC CATTGGCTGTTGAGCACGCAG,斜体加粗为 SacI 酶切位点及保护碱基，下同)进行扩增，得到492bp的产物(H2片段，2-甲基柠檬酸合成酶编码基因的下游同源臂)。以Hl片段和H2片段为模板，以prpC-Hl-F和prpC_H2-R为引物，进行PCR，得到993bp的融合PCR产物(H1-H2片段)，经过测序，该融合PCR产物具有序列表中序列I所示的核苷酸(含有2-甲基柠檬酸合成酶编码基因同源臂的DNA分子)。将上述融合PCR产物经XbaI和SacI酶切，得到酶切产物，将酶切产物与经过同样酶切的自杀质粒pRE112-phaABC-6ISCeI (该载体的核苷酸序列为序列表中的序列5，为自行构建的自杀质粒，即在pRE112[Robert A. Edwards. Improved allelic exchange vectorsand their use to analyze 987P fimbria gene expression.Gene207(1998) 149 -157]质粒中通过酶切连接的方式插入了 6个I-SceI位点，图1A)连接，得到重组质粒pRE112-phaABC-6IsceI-A (将序列 I 插入 pRE112-phaABC_6IsceI 的 XbaI 和 SacI 酶切位点间得到的载体)。2、一次同源重组将上述重组质粒pRE112-phaABC-6IsceI_A作为目标质粒先通过电转化方法转入大肠杆菌S17-lpir中，然后通过接合转化方法转入Halomonas sp. TDOl中(具体方法如前所述)，利用自杀质粒不能在宿主菌内复制的特性，用25 y g/mL氯霉素抗性的60LB平板筛选出阳性克隆I。在阳性克隆I中，带有同源片段的自杀质粒整合到基因组特定位置(经过测序，该阳性克隆I基因组中含有pRE112-phaABC-6IsceI-A的全序列)。3、筛选二次同源重组突变株诱导质粒pMCSl-Spe-araC-IScel(该载体的核苷酸序列为序列表中的序列6，自行构建的载体，在pBBRlMCSl [Kovach, M. E. Four new derivatives of the broad-host-rangecloning vector pBBRlMCS, carrying different antibiotic-resistant cassettes.Genel66 (1995) 175 - 176]的多克隆位点处插入了壮观霉素抗性基因及阿拉伯糖启动子控制下的I-SceI基因，图1B)表达ー种归位内切酶I-Scel，将在一次同源重组后产生的插入突变株基因组的6个I-SceI位点进行切割，产生双链的DNA缺ロ(Double-Strand-Break)，这一行为将強烈的诱发第二次同源重组的发生，产生突变型或者野生型，然后通过特异的PCR引物将突变株筛选出来。最后将PCR产物进行测序进一步确认，具体步骤如下将上述阳性克隆I通过接合转化导入诱导质粒pMCSl-Spe-araC-IScel，在含有25 u g/mL氯霉素和100 u g/mL壮观霉素的60LB平板上筛选得到阳性克隆2。在阿拉伯糖诱导下培养(在含有0. 3%阿拉伯糖浓度的60LB固体平板上，37°C培养24h)阳性克隆2，对得到的单克隆用上述引物prpC-Hl-F和prpC_H2-R进行菌落PCR验证。得到993bp的PCR产物为阳性克隆3。测序该阳性克隆3的基因组DNA，发现其为将Halomonas sp. TDOl敲除prpC基因(序列I)得到的菌株，命名为Halomonas sp. TD04。ニ、Halomonas sp. TD04 菌株的功能鉴定I、培养基配方种子液活化采用60LB培养基5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，60g/L NaCl，其余为水。121°C高压蒸汽灭菌20分钟。摇瓶发酵采用优化MM-G培养基I升优化MM-G培养基按照如下方法制备基底30g葡萄糖、60g氯化钠、Ig酵母粉，890mL蒸馏水溶解，112°C灭菌20分钟；组分I :2g/L氯化铵、0. 2g/L硫酸镁，配制成50倍母液，121°C灭菌20分钟；组分II :1. 5g/L磷酸ニ氢钾、9. 65g/L十二水合磷酸氢ニ钠，配制成50倍母液，121°C灭菌20分钟；微量元素微量元素I10ml/L、微量元素II lml/L，配制成50倍母液，母液pH值调节至4. 0-5. 0，121°C灭菌20分钟；微量元素I和微量元素II配制同下；I升所述微量元素I按照如下方法制备将柠檬酸铁铵5g、ニ水合氯化钙2g和0. 5mol/L盐酸水溶液混合，用0. 5mol/L盐酸水溶液补足至I升，得到所述微量元素I ;I升微量元素II按照如下方法制备将七水合硫酸锌lOOmg、四水合氯化锰30mg、硼酸300mg、六水合氯化钴200mg、五水合硫酸铜10mg、六水合氯化镍20mg、ニ水合钥酸钠30mg和0. 5mol/L盐酸水溶液混合，用0. 5mol/L盐酸水溶液补足至I升，得到所述微量元素II。
基底、组分I、组分II、微量元素分别单独灭菌，冷却后，分别取20mL组分I母液、20mL组分II母液和20mL微量元素母液加入基底，再调节pH至9. O。在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100 Ii g/mL氨节青霉素，50 u g/mL硫酸卡那霉素和25 u g/mL的氯霉素。发酵罐发酵采用培养基如下I升发酵初始培养基由氯化钠60g，葡萄糖30g，酵母粉lg，氯化铵2g，尿素3g，硫酸镁0. 2g，磷酸ニ氢钾I. 5g，十二水合 磷酸氢ニ钠9. 65g，IOmL微量元素I、ImL微量元素II和自来水组成，用自来水定容至I升。微量元素I，II的配制如前所述。发酵补料培养基配制I升补料培养基I :600g葡萄糖,60g氯化铵,用自来水定容至I升。I升补料培养基II :600g葡萄糖,用自来水定容至I升。发酵初始条件 .温度为37°C，pH值为9. 0，DO设置为50%，空气通气量为3升/分钟，DO与转速相偶联，最低转速200转/分，最高转速800转/分。在6L 发酵罐(Bioflo 3000, New Brunswick, NJ, USA)中配制 2. 7L 发酵初始培养基，不进行灭菌，所用水为自来水。当发酵初始条件(温度、pH、D0)调试完成后，接入300mLニ级种子培养液，开始发酵。发酵12小时后，每隔4小时加入IOOmL补料培养基I ;发酵24小时后，每隔4小时加入IOOmL补料培养基II。整个过程包括初始培养基，补料培养基，发酵罐体等均不灭菌。500L中试发酵(工作体积300L)在山东鲁抗集团进行，发酵条件同上。2、发酵Halomonas sp. TDOl野生型在添加丙酸作为辅助碳源时，能积累PHBV中3HV的比例维持在2-3mol%[薛源生.利用Halomonas sp. TDOl生产低成本聚羟基脂肪酸酷.清华大学理学硕士论文.2011]，这种低比例影响了材料的性能，所以需要提高PHBV中3HV的比例。丙酸在Halomonas sp. TDOl中的代谢途径显示，丙酸在细胞内被转化成丙酰辅酶A后，一部分会进入PHBV的合成途径，另一部分会被2-甲基柠檬酸合成酶PrpC催化成2-甲基柠檬酸合成酶，随后进入三羧酸循环被代谢掉，用于细胞生长。敲除关键酶2-甲基柠檬酸合成酶PrpC后，加入的丙酸将不能进入三羧酸循环用于细胞生长。A)、摇瓶实验I)种子活化培养将上述得到的Halomonas sp. TD04菌株接种于相应60LB培养基，在37°C、200转/分摇床中培养12h，得到种子培养液。2)摇瓶发酵将上述I)得到的种子培养液按5% (体积百分含量)接种量接入装有IOOmL含有不同浓度丙酸优化MM-G培养基的500mL三角瓶中，丙酸浓度分别为0g/L，0. Ig/L，0. 3g/L，0. 5g/L，0. 8g/L，I. Og/L，I. 5g/L，2. Og/L，2. 5g/L，3. Og/L，37°C、pH9. 0、200 转 / 分条件下，摇床培养48小吋，收集发酵产物。3)发酵产物分析(I)细胞干重取出25mL发酵产物12000转/分(20670xg，离心直径115mm)离心10分钟收集菌体，用去离子水洗涤两次，冷冻冰干，得到TD04冰干后菌体，冰干后菌体称重计算细胞干重(CDff)0实验重复三次，结果取平均值。(2 )、PHBV产量和3HV占PHBV的比例取30mg TD04冰干后菌体进行酯化，气相色谱(GC)检测PHBV含量，实验重复三次，结果取平均值；具体如下酷化方法为取30mg冰干菌体于酯化管中，加入2mL氯仿、2mL酷化液混匀，加盖密闭，100°C烘箱中酯化4小吋。冷却至室温后，加入ImL蒸馏水，充分振荡混匀，静置分层。待氯仿相与水完全分离后，取氯仿相进行气相色谱分析。I升酯化液配置方法lg苯甲酸、30mL浓硫酸溶于970mL甲醇,得到酯化液。同时取IOmg的标样物质进行酯化。气相色谱(GC)分析依照HP公司Hewlett Packard 6890 (HP, USA)气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。设定柱头温度为140°C，进样器温度为200°C，检测器温度为220°C，柱头压カ为0. 25Mpa，程序升温条件为140°C I分钟，以20°C /分的速度升温至220°C，并在此温度保持I分钟。样品进样量为lul。液相色谱(HPLC)分析用于检测培养液中的葡萄糖及各类酸，流动相为5mMH2SO4,流速为 0. 5ml/min (BioRad, Aminexs HPX-87H, 7. 8*300mm2 离子交换柱，示差折光检测器)。上述两个实验的结果如表I和图2所示。表I为Halomonas sp. TD04生产PHBV的丙酸摇瓶梯度实验结果
权利要求
1.ー种重组菌，是对生产聚羟基脂肪酸酷的盐单胞菌进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为失活所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中与丙酸代谢途径相关的ー个或多个基因；所述与丙酸代谢途径相关的ー个或多个基因为2-甲基柠檬酸合成酶编码基因、PHA降解酶I编码基因、PHA降解酶2编码基因和PHA降解酶3编码基因中的至少ー种。
2.根据权利要求I所述的重组菌，其特征在于 所述生产聚羟基脂肪酸酷的盐单胞菌为Halomonas sp. TDOl，保藏号为CGMCCNo. 4353。
3.根据权利要求I或2所述的重组菌，其特征在于 所述失活生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中的与丙酸代谢途径相关的ー个或多个基因为删除各种所述基因的全部编码框。
4.ー种构建权利要求1-3任一所述重组菌的方法，包括如下步骤失活生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中的所述与丙酸代谢途径相关的ー个或多个基因，得到的重组菌； 所述失活生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中的所述与丙酸代谢途径相关的ー个或多个基因具体通过同源重组实现。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述同源重组包括如下步骤 1)将含有待敲除基因同源臂的DNA分子插入自杀质粒中，得到重组自杀质粒； 所述含有待敲除基因同源臂的DNA分子由在所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌基因组中待敲除基因的上下游两条同源臂组成； 2)将所述重组自杀质粒导入出发菌中，得到同源重组菌I; 3)将诱导质粒导入所述同源重组菌I中，即得到所述重组菌。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于 在上述方法的步骤3)中，还包括将诱导质粒导入所述同源重组菌I中得到的阳性克隆进行阿拉伯糖诱导，得到所述重组菌的步骤； 所述生产聚轻基脂肪酸酯的盐单胞菌为Halomonas sp. TDO I,保藏号为CGMCCNo. 4353 ； 所述自杀质粒为带有6个I-SceI位点的自杀质粒pRE112-phaABC-6IsceI ； 所述诱导质粒为表达归位内切酶I-SceI的质粒pMCSl-Spe-araC-IScel。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于 所述同源重组中，步骤I)的所述待敲除基因为2-甲基柠檬酸合成酶编码基因，步骤2)的出发菌为所述生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌，步骤3)得到重组菌A。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于 所述同源重组中，步骤I)的所述待敲除基因为PHA降解酶I编码基因，步骤2)的出发菌为所述生产聚羟基脂肪酸酷的盐单胞菌，步骤3)得到重组菌B。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于对所述重组菌B进行权利要求5或6所述的方法中的同源重组，步骤I)的所述待敲除基因为PHA降解酶2编码基因，步骤2)的出发菌为所述重组菌B，步骤3)得到重组菌C。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于对所述重组菌C进行权利要求5或6所述的方法中的同源重组，步骤I)的所述待敲除基因为PHA降解酶3编码基因，步骤2)的出发菌为所述重组菌C，步骤3)得到重组菌D。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于对所述重组菌D进行权利要求5或6所述的方法中的同源重组，步骤I)的所述待敲除基因为2-甲基柠檬酸合成酶编码基因，步骤2)的出发菌为所述重组菌D，步骤3)得到重组菌E。
12.权利要求1-3中任一所述的重组菌在制备聚羟基丁酸戊酸共聚酯中的应用。
13.权利要求1-3中任一所述的重组菌在提高聚羟基丁酸戊酸共聚酯中3-羟基戊酸单体所占的摩尔百分比中的应用。
14.一种制备聚羟基丁酸戊酸共聚酯的方法，包括如下步骤在含有丙酸的发酵培养基中发酵培养权利要求1-3中任一所述的重组菌，收集菌体，即得到聚羟基丁酸戊酸共聚酷。
15.权利要求14所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中的丙酸终浓度为0.5g/L-lg/L，所述发酵培养基中的丙酸终浓度具体为0. 5g/L。
16.权利要求14或15所述的方法，其特征在于 所述发酵培养基中含有氯化钠，所述氯化钠的浓度为250g/L以下，所述发酵培养基中氯化钠的浓度具体为60g/L。
全文摘要
本发明公开了一株盐单胞菌多基因敲除株的构建和应用。本发明提供了一种重组菌，为失活生产聚羟基脂肪酸酯的盐单胞菌中的与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因后得到的重组菌；所述与丙酸代谢途径相关的一个或多个基因为2-甲基柠檬酸合成酶编码基因、PHA降解酶1编码基因、PHA降解酶2编码基因和PHA降解酶3编码基因中的至少一种。本发明的实验证明，本发明通过对盐单胞菌Halomonas sp.TD01进行分子改造，敲除2-甲基柠檬酸合成酶PrpC及3个PHA降解酶得到新的重组菌，可高效的利用丙酸生产材料性能更加优良的PHBV，大大提高了生产出的聚羟基丁酸戊酸共聚酯中3-羟基戊酸单体的比例及底物丙酸的转化率。
文档编号C12R1/01GK102816729SQ201210258589
公开日2012年12月12日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者陈国强, 谭丹, 李腾 申请人:清华大学