专利名称：一种柑橘CrNCED1基因及其在植物抗非生物胁迫中的应用的制作方法
技术领域：
本专利属于植物基因工程领域。具体涉及ー种从印度酸橘(Citrus reshni)中分离、克隆得到一个ABA合成关键酶NCED(9-cis_epoxycarotenoid dioxygenase,9_顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶)的编码基因CrNCEDl，本发明还涉及ー种CrNCEDl基因在植物抗非生物胁迫环境中的应用，将该基因导入到烟草中，获得的转基因植株抗旱、抗盐和氧化胁迫能力明显提尚。
背景技术：
植物经常遭受一系列的环境胁迫，包括干旱、高温、低温、盐碱、淹水等，其中，干旱是影响作物生长发育和产量及限制植物地理分布最为重要的因素之一。在漫长的进化过程 中，植物已经形成一套复杂的机制来适应和生存非生物逆境。对植物抗逆性的研究表明，植物对逆境的适应受遗传因素和植物激素两方面因素的控制，这两者可以通过逆境基因表达控制或代谢作用改变细胞膜系统，提高植物的抗逆能力。植物激素可能是抗逆性基因表达的启动物质，逆境胁迫改变了植物体内的激素平衡水平，从而使代谢途径发生变化，使得植物对逆境胁迫的抵抗能力增强(Nan等，2002;Wang等，2008)。脱落酸(Abscisic acid，ABA)是ー种重要的胁迫激素，又称应激激素，它调节植物对逆境胁迫的适应(Meurs等，1992)。ABA不仅可以作为胞间信号转导物质调节整个植株的抗逆反应，同时作为细胞逆境信号物质直接调控多个抗逆基因的表达(Bray，2002; Ishitani等，1997)。在逆境胁迫下，植物体内ABA合成系统启动，合成大量的ABA，促进气孔关闭，抑制气孔开放，減少蒸腾失水；并能通过增加根的透性和水的通导性来促进水分吸收，从而增强植物抵抗逆境胁迫的能力(Ji等，2011;Webb and Hetherington, 1997)。植物体内ABA的积累受到合成途径和降解途径的控制。对ABA合成途径的研究表明NCED (9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶)是ABA合成过程中的关键酶。NCED催化9-顺式紫黄质和9-顺式新黄质发生氧化裂解反应，生成ABA的前体物质黄质醛。NCED是ー个多基因家族，不同植物的NCED基因承担着不同的作用，众多的NCED基因家族的成员不但在ABA合成过程中担负着重要的作用，而且在抵抗逆境胁迫维持植物生理形态等方面也发挥着重要的作用(Schwartz等，2003)。已开展的研究表明，胁迫诱导的NCED基因在逆境应答反应和抗逆中起着重要作用，主要表现在以下几个方面第一，在玉米(Burbidge等，1997)、番爺(Schwartz等，1997 ;Thompson 等，2000)、豆子(Qin 等，1999)、紅豆(Iuchi 等，2000)、鳄梨(Chern ys 等，2000)、拟南芥(Iuchi 等，2001 ；Frey 等,2012)、花生(Wan 等，2005)、柱花草(Stylosanthesguianensis) (Yang and Guo，2007)等多种植物中，正常生长条件时，NCED基因表达量很低，逆境胁迫下其表达量迅速上升，并且NCED基因的表达早于ABA积累；而一旦胁迫解除，其表达水平和ABA量又迅速回落到基准水平(Schwartz等，2003)，表明NCED基因表达的诱导是胁迫下ABA生物合成的主要原因，从另ー个方面也说明ABA生物合成是通过NCED基因在转录水平上进行调节(Qin等，1999 ；Iuchi等，2000);第二，在烟草和拟南芥上的研究表明，与NCED基因有关的ABA合成突变体或NCED反义基因转化植株中ABA合成受到严重影响，其抗逆性也明显下降(Iuchi等，2000)，外源加入ABA则能够提高突变体的抗性；在突变体中超量表达NCED基因后ABA合成得到恢复，抗性随之增强(Wan等，2006)，进ー步说明逆境下NCED介导的ABA合成是植物抗逆的ー个重要因素；第三，超量表达NCED基因的转基因植株中ABA含量增高，转基因植株的抗性显著增强(Iuchi等，2001 ；Qin等，2002 ；Aswath等，2005 ;Thompson 等，2007 ；Zhu 等，2007 ；Hu 等，2010)。由于ABA是植物逆境信号传递途径中的重要信使，它能够激活在此途径中的ー些重要激酶和转录因子，引起下游较多的逆境应答基因表达，类似于ー种“集团作战”的方式。超量表达NCED基因与转化某些单ー的功能基因(如LEA、脯氨酸合成相关基因等)相比，前者在提高抗旱性上更有优势(Yamaguchi-Shinozaki等，2005)。因此，NCED基因是用于遗传、工程提高植物抗旱性的重要基因资源。
发明内容
本发明的ー个目的是提供了ー种从抗旱的印度酸橘(Citrus reshni)中分离、克隆得到ー个NCED基因，申请人将其命名为CrNCEDl，其核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示。本发明的另ー个目的是提供了ー种CrNCEDl基因在植物抗非生物胁迫中的应用。通过农杆菌介导的遗传转化方法将该基因转化烟草，鉴定其抗旱功能，为植物抗逆分子设计育种提供新的基因资源，以为实施緑色农业、节水农业提供新的遗传资源。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案申请人:利用植物基因克隆技术从印度酸橘中克隆得到ー个新基因CrNCEDl，其核苷酸序列为序列表SEQ ID NO :1所示,在SEQ ID NO :1所示序列的l_1821bp处为该基因的编码区，它包含1821bp的开放阅读框，编码606个氨基酸；其编码的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO :2所示，等电点为6. 05，预测的分子量为67. OkDa。申请人:设计了克隆上述基因CrNCEDl的cDNA序列的引物对，其核苷酸序列如下所示正向引物5’-TTCGGATCCATGGCGGCAGCAACTAC-3’，即 SEQ ID NO. 3 ；反向引物5’ -TTCGAGCTCTTAGGCCTGCTTGGCCA-3，，即 SEQ ID NO. 4。ー种CrNCEDl基因在植物抗非生物胁迫中的应用，其应用过程是将该基因通过农杆菌介导的遗传转化转入烟草，获得转基因植株抗脱水、抗旱、抗盐和抗氧化胁迫。与现有技术相比，本发明具有以下优点I、利用该基因转化，获得的转基因植株对多种非生物胁迫(脱水、抗旱、盐和氧化胁迫)具有抗性，从而实现ー个基因提高多种抗性。2、该基因的发现为植物抗逆基因工程提供了重要的基因资源，以为实施緑色农业提供新的遗传资源。
图I为ー种本发明的技术流程示意图。图2为ー种CrNCEDl基因在脱水、盐、低温胁迫和ABA处理及恢复后的表达模式示意图。图2A是印度酸橘在室温下失水0、1、3、6、9、12小时及恢复1、3、6小时后的表达；图2B是印度酸橘在200mM氯化钠、100 u M ABA处理和4度处理O、1、3、6、9、12、24、72、120小时及恢复1、3、6、9小时的表达。图3为ー种CrNCEDl基因载体构建示意图。图4为ー种CrNCEDl基因转化烟草过程示意图。图4A，转基因烟草再生愈伤；图4B，转基因烟草再生生芽；图4C，转基因烟草植株生根。图5为ー种CrNCEDl基因转化烟草再生植株的PCR鉴定示意图。
图5A，CrNCEDl转化烟草后得到的TO代植株的PCR鉴定(上图为CrNCEDl特异引物扩增图，下图为NPTII基因特异引物扩增图)。图5B，CrNCEDl转化烟草后得到的T2代植株PCR鉴定(上图为CrNCEDl特异引物扩增图，下图为NPTII基因特异引物扩增图)。图6为ー种阳性转基因植株转基因CrNCEDl的表达量分析示意图。图6A，TO代2个阳性转基因植株中CrNCEDl基因RT-PCR分析結果。图6B，T2代阳性转基因植株中CrNCEDl基因RT-PCR分析結果。WT为野生型植株，其余编号为转基因植株。P-Actin基因用作内參。图I为ー种CrNCEDl转基因烟草T2代三个系(C5_6、C7_4和C9-4)与野生型(WT)叶片脱水下的抗性比较和生理指标测定示意图。图7A是转基因烟草和野生型叶片脱水前(上)和脱水80分钟(下)后的表型。图7B是烟草转基因系和野生型叶片脱水处理下的相对失水率变化。图7C是叶片脱水后的相对电导率检测結果。图8为ー种CrNCEDl转基因烟草T2代三个系(C5_6、C7_4和C9-4三个系)和野生型(WT)叶片脱水处理SOmin后叶片活性氧含量分析示意图。图8A是采用NBT (氯化硝基四氮唑蓝)染色的结果，显示02_含量(染色越深，含量越高)。图8B是采用DAB(ニ氨基联苯胺)染色的结果，显示H2O2含量(染色越深，含量越高)。图9为ー种60天大小的CrNCEDl转基因烟草T2代三个系(C5-6、C7-4和C9-4)与野生型(WT)盆栽苗抗旱性比较示意图。图9A是烟草转基因植株和野生型控水(干旱处理)7天后的表型。图9B是烟草转基因植株和野生型干旱处理7天后叶片含水量的測定結果。图9C是CrNCEDl基因转化烟草和野生型干旱处理7天后的相对电导率检测結果。图10为ー种CrNCEDl转基因烟草T2代三个系(C5-6、C7-4和C9-4)与野生型(WT)盐(200mM NaCl)处理4天后的表型及生理測定示意图。图IOA是叶圆片盐处理前和处理4天后的表型。图IOB是处理4天后相对电导率检测結果。图IOC是采用DAB分析处理前(上)和处理后(下)叶圆片中的H2O2含量。图IOD是处理4天后采用NBT分析处理前(上)和处理后(下)叶圆片中的02_含量。图11为ー种CrNCEDl转基因烟草T2代两个系(C7-4和C9-4)与野生型(WT)在1%H202处理4天后表型和叶绿素含量測定示意图。图IlA是叶圆片处理前和1%H202处理4天后的表型。图IlB是H2O2处理叶圆片4天后叶绿素含量測定結果。
具体实施例方式以下结合具体实施对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件，具体实施方式
中为特别说明的实验方法，均为常规实验方法。实施例1，CrNCEDl基因分离克隆及表达分析使用Trizol试剂盒抽提印度酸橘叶片RNA(试剂盒购自Invitrogen公司，抽提按照提供的说明书操作)，将抽提的I y g总RNA经IU的DNaseI (购自Fermentas公司)室温处理30分钟后，加入I U I EDTA (25mM),于65°C温育10分钟。用MBI反转录试剂盒合成第一链cDNA (货号K1621,购自Fermentas公司，按照试剂盒说明书操作),所得的第一链cDNA用于扩增CrNCEDl基因全长。根据NCBI 中的 NCED 基因序列(AAR11193、AARl 1194、NP_188062、NP_193569、NP_177960)，采用同源序列法，先利用多个序列找出高度保守区，再用Premier5. 0设计带有BamHI、SacI酶切位点的引物，根据酶切特点加保护碱基。用RT-PCR的方法扩出全长。50ii I的反应体系中包括200ng cDNAUX缓冲液(TransStart FastPfu缓冲液)、IOmMdNTPUU Taq聚合酶(前述缓冲液和聚合酶购自TRANS公司)及I. Oii M上述引物。PCR反应在ABI9700 (Applied Biosystem)扩增仪上按以下程序完成94°C 5分钟；94°C变性30秒、58°C退火50秒、72°C延伸90秒(共35个循环)；循环完成后72°C延伸15分钟。PCR扩增获得一条特异带，经1%的琼脂糖凝胶电泳后，用E,Z.N.A*DNA凝胶回收试剂盒(购自Omega公司，美国)回收特异带(提取步骤參照使用说明)。回收纯化的DNA溶液与PMD18-T载体(购自宝生物工程大连有限公司，即TaKaRa公司)进行连接反应(按说明书操作)，连接反应体系中回收产物与PMD18-T载体的摩尔比为3 :1，连接反应总体积是lOiil，包括5iil的2X缓冲液(购自宝生物工程大连有限公司)，I. 5 ill纯化的PCR产物和0. 5 illPMD18-T载体。16°C连接过夜。取IOiU连接产物，热激法转化大肠杆菌DH5 a，在含有100mg/L氨苄青霉素的LB固体平板中筛选阳性克隆，挑取克隆送上海联合基因公司测序。测序结果表明，该基因长1821bp。通过测序、比对确定为NCED基因(命名为CrNCEDl)，编码由606个氨基酸组成的多肽，其分子量为67kDa，等电点为6. 05。BLASTX分析发现CrNCEDl与其它植物的NCED基因有很高的同源性。为分析CrNCEDl基因是否响应非生物胁迫和外源ABA，采用半定量PCR分析该基因在高盐、干旱、低温和ABA处理下的表达。结果表明，干旱(见图2A)、盐和外源ABA (见图2B)处理均能诱导CrNCEDl基因的表达，表明它是ー个逆境应答基因，但低温对CrNCEDl基因的表达量影响不大。实施例2，植物转化超表达载体构建根据pBI121载体的多克隆位点和CrNCEDl基因的编码区序列上的酶切位点，选择BamHI和SalI作为内切酶。首先将以CrNCEDl基因的克隆子为模板进行PCR扩增，再通过TA克隆连接到pMD18-T载体上，从而构建ー个重组载体pMD18-T-CrNCEDl。双酶切体系总体积为40iU，其中含有pMD18-T-CrNCEDl质粒8 ylUOXM缓冲液(购自Takana) 4 U I,BamHI及SalI各2 ill、双蒸水24 ill。在37°C酶切3_4h后纯化回收。pBI121载体的双酶、切体系同上。连接反应体系中CrNCEDl基因与载体pBI121分别为6^1和2 yl，反应总体积为10111，10父了4连接缓冲液1111，T4连接酶liil，16°C连接14-16小时。连接产物转化大肠杆菌菌株DH5 a，在含有100mg/L卡那霉素的LB固体平板中筛选，挑单克隆PCR检测呈阳性后抽提质粒进行酶切，测序确定读码框没有突变后，即pBI121-CrNCEDl重组载体构建成功。将重组载体CrNCEDl转到农杆菌EHA105中并保存菌株。构建完成的载体图见图3。实施例3，烟草遗传转化I、实验材料准备取烟草种子，在超净工作台上先用75%的酒精浸泡灭菌30秒，弃去酒精无菌水洗涤I次，再用2%的次氯酸钠浸泡灭菌8-12min，用灭菌的接种针播种于MS培养基上，置于培 养室。2、农杆菌菌液的制备农杆菌在含有卡那霉素50mg/L的固体LB培养基上划线，28°C暗培养两天；挑取单菌落接种在新的加有卡那霉素的LB平板上，28°C暗培养2_3天；用手术刀刮下已长好的农杆菌，接种在不加抗生素的液MS培养基中，同时加20mg/L (IOOuM) AS, 280C 200r/min振荡培养2h (同时在这段时间准备切烟草叶片)；用分光光度计测量菌液的OD6tltl值，用MS液体培养基调整0D_值到0. 4-0. 55进行侵染。3、外植体准备取烟草叶片，于超净工作台上切掉叶片大的叶脉和叶片边缘，然后将叶片切成约
0.5X0. 5cm大小，切好的叶片暂时放于灭菌的空三角瓶中(加少量水保湿)，待农杆菌菌液制备完成后用于转化。4、侵染与共培养将切好的外植体浸泡在已制备好的农杆菌菌液里，侵染8-10min，中间摇动几次。侵染完后用无菌吸水纸吸干外植体表面菌液，再接种到共培养培养基上21-23°C暗处共培养3天。5、筛选培养与再生共培养3天后，将共培养的叶片用500mg/L头孢霉素洗一次，无菌水洗3_5次，再用无菌吸水纸吸干表面的农杆菌，转到加有卡那霉素100mg/L及头孢霉素400mg/L的筛选培养基上，25°C光照条件下培养。在筛选培养基上长出抗性芽，当抗性芽长至2-3cm左右时，切下并转入加IOOmgL卡那霉素(或不加)和400mgL头孢霉素生根培养基诱导生根，烟草转化过程见图4。常用培养基配方LB固体培养基蛋白胨10g/l+酵母提取物5g/l+NaC110g/l+琼脂15g/l烟草共培养及筛选培养基MS+6-BA2. 25mg/l+NAA0. 3mgl+琼脂7. 5g/l+蔗糖30g/I (pH 为 5. 8)烟草生根培养基MS++NAA0.3mg/l+ 琼脂 7. 5g/l+ 蔗糖 30g/l (pH 为 5. 8)实施例4，转化植株分子及生理鉴定I、烟草叶片DNA提取
取适量的叶片放入I. 5mL离心管中，加液氮，充分研磨；然后加入700 yl65°C预热的十六烷基三こ基溴化铵(简称CTAB)DNA提取缓冲液(配方100mM Tris-HCl,pH8. 0，I. 5MNaCl，50mM EDTA, pH8. 0，1%聚こ烯吡咯烷酮，2% (体积)CTAB)，65°C温浴60-90分钟(温浴过程中每15分钟取出离心管上下轻轻颠倒混匀)；10000Xg离心10分钟；取上清，加600 ill氯仿，颠倒混匀静置3分钟；10000 Xg离心15分钟；取上清450 yl，加入900 U I预冷无水こ醇，34iU5M NaCl，混匀后，冰冻30分钟，IOOOOXg离心10分钟；弃上清后，用Iml75%的こ醇，洗涤3次后，加适量双蒸水溶解。2、阳性转基因植株PCR检测采用NPTII引物和CrNCEDl基因特异性引物进行PCR扩增。引物序列、反应程序及体系分别见表I、表2。采用NPTII引物和CrNCEDl基因特异性引物对烟草再生植株进行PCR鉴定，对TO代的21个转基因株系的鉴定结果显示一共有17个阳性株系(图5A)。对TO代转基因烟草进行繁殖，得到T2代转基因烟草。NPTII引物和CrNCEDl基因特异性引物鉴 定结果显示，T2代エ得到了 8个纯合阳性转基因株系(图5B)。表I、引物序列信息
SW f引物序列退火溢度长度(bp)
NPTII S- AGACAATCGGCTGCTCTGAT -3'56742
5,- TCATTTCGAACCCCAGAGTC -3'
CrNCEDi 特 I S- ATGGCGGCAGCAACTAC -3'62895
引衡I
I 5' GACTTCCOTATCACCiTGCCiCGT -3*表2、PCR反应程序
步骤 94 V 56 V/62V 72 V 4 V 循环数
ipmi 4分钟I
0B230 #(56*C) 55 秒(5CTC)30
30 秒 45 秒(621) 2 分钟(6 步骤35分钟I
MM 430分钟表3、PCR反应体系
权利要求
1.一种分离的基因，其特征在于基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO: I所示。
2.根据权利要求I所述的ー种分离的基因，其特征在于，所述基因的正向引物为5’ - TTCGGATCCATGGCGGCAGCAACTAC -3，，即 SEQ ID NO. 3 ;反向引物为5’ -TTCGAGCTCTTAGGCCTGCTTGGCCA -3，，即 SEQ ID NO. 4。
3.权利要求I所述的基因在植物抗非生物胁迫中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种柑橘CrNCED1基因及其在植物抗非生物胁迫中的应用，从抗旱的印度酸橘(Citrusreshni)中分离、克隆得到一个NCED基因，申请人将其命名为CrNCED1，它包含1821bp的开放阅读框，编码606个氨基酸，等电点为6.05，预测的分子量为67.0kDa。本发明将CrNCED1基因转化烟草，获得的转基因植株的抗脱水、抗旱、抗盐和抗氧化胁迫能力均明显增强。本发明为植物抗逆基因工程提供了重要的基因资源，以为实施绿色农业、节水农业提供新的遗传资源。
文档编号C12N15/53GK102747093SQ201210258028
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者刘继红, 吴娟, 鲜黎红 申请人:华中农业大学