专利名称：人工条件下黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明所属的领域为生物技术领域，尤其是涉及一种人工条件下黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒的方法及其应用。
背景技术：
水稻矮缩病毒(Rice drawf virus，RDV)是一种常见的水稻病毒病之一，属于呼肠孤病毒科(Reoviridae),植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)。该病毒病最早于1939年在四川省西昌发现，六十年代后期在我国开始流行，现今主要流行于日本、朝鲜、东南亚以及我国东南部等水稻产区。目前该病毒病在我国的一些水稻产区对水稻生产造成危害。水稻矮缩病毒病除危害水稻外，还危害大麦、小麦等禾本科植物。水稻从苗期至分蘖期易感此病，在这期间感病后，整体症状表现为植株矮缩、分蘖增多、叶片浓绿、僵直。生长后期感病水稻不能抽穗结实，病叶症状则表现分为白点型和扭曲型两种。白点型症状表现为植株矮 缩、分蘖增多、叶色浓绿；叶片或叶鞘上出现与叶脉平行的虚线状黄白色点条斑，以基部最明显；病株根系发育不良；孕穗后期发病，只在剑叶、叶鞘上出现清晰的点条病斑；抽穗后发病，仅在剑叶鞘上表现病斑。扭曲型症状表现为病株生长缓慢、显著矮缩、分蘖增多、叶片浓绿，在光照不足情况下，心叶抽出呈扭曲状，随心叶伸展，叶片边缘出现波状缺刻，色泽淡黄；孕穗期发病，多在剑叶叶片和叶鞘上出现白色点条，穗颈缩短，形成包颈或半包颈穗。近几年该病毒病在在福建、浙江、广西、贵州、河南等稻区发生，而在云南寻甸县、嵩明县的水稻产区发病较普遍，中部的昆明、东北部区的曲靖和昭通、南部和西南部的景洪和德宏的部分水稻产区也都有发生。在自然条件下水稻矮缩病毒通过黑尾叶蝶{Nephotetix cincticeps)和电光叶蝶(.Recilia dorsalIa)传播，能在昆虫体内复制，一旦获毒，即终身带毒，并可通过虫卵传给下一代，若虫及成虫均能传毒，且高效传毒。黑尾叶蝉在病稻上吸汁最短获毒时间5分钟，获毒后需经一段循回期才能传毒，循回期20°C时为17天，29. 2°C时为12. 4天。叶蝉获毒15-20天后，体内病毒浓度迅速增加，之后以持久性方式传毒给寄主植物，并且存在明显的间歇传毒特性。病毒可在黑尾叶蝉体内越冬，黑尾叶蝉在看麦娘上以若虫形态越冬，翌春羽化迁回稻田为害，早稻收割后，迁至晚稻上为害，晚稻收获后，迁至看麦娘、冬稻等38种禾本科植物上越冬，带毒虫量是影响该病发生的主要因子。所以对于黑尾叶蝉及水稻矮缩病毒的早期监测和预警十分必要。以单抗为核心建立的血清学方法是最经济、最有效的检测黑尾叶蝉体内及水稻中RDV的高通量的检测方法，因而筛选合适的抗体尤为重要；此外筛选抗病品种是防治水稻病毒病最经济、最有效的方法。通过利用水稻病叶饲喂黑尾叶蝉，获得携带RDV的黑尾叶蝉，可用于抗RDV单抗的筛选，用以单抗为核心建立的血清学方法对该病毒病的发生流行情况进行预报、预警；并可接种水稻品系，有助于快速鉴定抗水稻矮缩病毒病的水稻品种，为抗水稻矮缩病毒病的水稻资源的发掘、抗性品种选育；携带RDV的黑尾叶蝉的获得能为RDV与寄主及其媒介昆虫之间的互作研究提供物质基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种人工条件下黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒的方法及其应用。人工饲喂条件下黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒的方法，其特征在于包括如下步骤
1)黑尾叶蝉的获得
从非水稻矮缩病发生地区的水稻田间采集捕获黑尾叶蝉后在室内用无毒稻苗饲养，待黑尾叶蝉成虫交配后单头虫单独产卵，随机抽取群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR方法检测带毒情况，保留不带毒雌虫的后代并建立室内种群；
2)黑尾叶蝉的获毒
黑尾叶蝉从冷冻保存的感染RDV水稻或活的感病水稻病株中获毒
饲毒前，黑尾叶蝉在滤纸保湿的烧杯中饥饿I 3小时；从-10°C至_80°C保存冰箱中取出冷冻保存的病株，移入烧杯内，每个烧杯放I 10株病株；接入20 300头3 4龄无毒的黑尾叶蝉若虫，烧杯用尼龙纱布封口 ；把烧杯放入温室或植物生长箱内饲养，温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L 8D ;饲毒I 2天后将存活的黑尾叶蝉移入生长于温室或植物生长箱的健康水稻苗上喂养，温度为26 30°C，相对湿度为60% 75 %，光周期为16L :8D，直至渡过病毒的循回期，约15 20天；饲毒后的单头黑尾叶蝉在健康水稻上单独产卵，随机抽取其后代群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR方法检测带毒情况，保留带毒雌虫的后代并建立室内带毒种群，即获得携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉；或者，黑尾叶蝉从种植于温室或植物生长箱内的水稻病株上获毒
饲毒前，黑尾叶蝉在滤纸保湿的烧杯中饥饿I 3小时；感染水稻矮缩病毒的水稻病株，用尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器封闭在温湿度控制的植物生长箱中培养，每个塑料容器放I 3株病株植物；每个装置中放入20 200头3 4龄无毒的黑尾叶蝉若虫，饲喂培养温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L 8D ;饲毒I 3天后将存活的黑尾叶蝉移入新鲜健康水稻苗上饲养直至渡过病毒的循回期，约15 20天；饲毒后的单头黑尾叶蝉在健康水稻上单独产卵，随机抽取其后代群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR方法检测带毒情况，保留带毒雌虫的后代并建立室内带毒种群，即获得携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉。携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种的抗性，用于筛选水稻的抗病品种，并为抗水稻矮缩病毒抗病育种服务。携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种抗性的方法为将携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉移入待鉴定的种植于温室或植物生长箱的2-5叶期水稻苗，采用单苗10头虫方法接种待鉴定水稻品种，饲养3-7天后移出全部黑尾叶蝉，将稻苗移栽至温室或植物生长箱内，培养温度为26-30°C，相对湿度为65 %-75 %，光周期为16L:8D ;7天以后开始观察病毒症状，连续调查20-50天；用RT-PCR和dot-ELISA方法检测水稻；根据饲喂接毒水稻的病毒症状及其RT-PCR和dot-ELISA检测结果判断水稻的抗性。携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉用于筛选抗水稻矮缩病毒特异、灵敏的单抗，从而建立以单抗为核心的检测水稻及黑尾叶蝉体内水稻矮缩病毒的血清学方法。携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉用于研究水稻矮缩病毒与水稻寄主及其介体昆虫之间的互作机理提供物质基础。
本发明与现有技术相比具有的有益效果是1)人工饲喂条件下，可使黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒，解决了患病植株难以长期保存的问题；2)携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉筛选抗RDV的单抗，从而为建立检测RDV的血清学方法打下基础；3)建立了人工条件下快速鉴定抗水稻矮缩病毒病的水稻品种的方法，为抗水稻矮缩病毒病的水稻资源的发掘、抗性品种选育；4)携带RDV的黑尾叶蝉的获得能为RDV与寄主及其媒介昆虫之间的互作研究提供物质基础。
图I是RT-PCR方法检测水稻样品中RDV的结果；
图2是Dot-ELISA方法检测水稻样品中RDV的结果；
图3是冷冻病叶饲喂黑尾叶蝉获毒的装置图；
图4是Dot-ELISA方法检测冷冻病叶饲喂的黑尾叶蝉样品中RDV的结果；
图5是新鲜病叶饲喂黑尾叶蝉获毒的装置 图6是RT-PCR方法检测新鲜病叶饲喂的黑尾叶蝉样品中RDV的结果；
图7是黑尾叶蝉传毒实验装置 图8 Dot-ELISA方法检测接种水稻中RDV的结果；
图9是获毒黑尾叶蝉用于筛选水稻抗性装置图。
具体实施例方式本发明利用携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉可筛选抗RDV的单抗用于病毒的检测以及建立水稻矮缩病毒病的品种抗性的鉴定方法，为抗水稻矮缩病毒病的水稻资源的发掘、抗性品种选育提供基础的研究手段，还可为进一步研究RDV与寄主及其媒介昆虫之间的互作研究提供物质基础。人工饲喂条件下黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒的方法包括如下步骤
1)黑尾叶蝉的获得
从非水稻矮缩病发生地区的水稻田间采集捕获黑尾叶蝉后在室内用无毒稻苗饲养，待黑尾叶蝉成虫交配后单头虫单独产卵，随机抽取群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR方法检测带毒情况，保留不带毒雌虫的后代并建立室内种群；
2)黑尾叶蝉的获毒
黑尾叶蝉从冷冻保存的感染RDV水稻或活的感病水稻病株中获毒
饲毒前，黑尾叶蝉在滤纸保湿的烧杯中饥饿I 3小时；从-10°C至_80°C保存冰箱中取出冷冻保存的病株，移入烧杯内，每个烧杯放I 10株病株；接入20 300头3 4龄无毒的黑尾叶蝉若虫，烧杯用尼龙纱布封口 ；把烧杯放入温室或植物生长箱内饲养，温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L 8D ;饲毒I 2天后将存活的黑尾叶蝉移入生长于温室或植物生长箱的健康水稻苗上喂养，温度为26 30°C，相对湿度为60% 75 %，光周期为16L :8D，直至渡过病毒的循回期，约15 20天；饲毒后的单头黑尾叶蝉在健康水稻上单独产卵，随机抽取其后代群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR方法检测带毒情况，保留带毒雌虫的后代并建立室内带毒种群，即获得携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉；或者，黑尾叶蝉从种植于温室或植物生长箱内的水稻病株上获毒饲毒前，黑尾叶蝉在滤纸保湿的烧杯中饥饿I 3小时；感染水稻矮缩病毒的水稻病株，用尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器封闭在温湿度控制的植物生长箱中培养，每个塑料容器放I 3株病株植物；每个装置中放入20 200头3 4龄无毒的黑尾叶蝉若虫，饲喂培养温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L 8D ;饲毒I 3天后将存活的黑尾叶蝉移入新鲜健康水稻苗上饲养直至渡过病毒的循回期，约15 20天；饲毒后的单头黑尾叶蝉在健康水稻上单独产卵，随机抽取其后代群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR方法检测带毒情况，保留带毒雌虫的后代并建立室内带毒种群，即获得携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉。携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种的抗性，用于筛选水稻的抗病品种，并为抗水稻矮缩病毒抗病育种服务。携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种抗性的方法为将携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉移入待鉴定的种植于温室或植物生长箱的2-5叶期水稻苗，采用单苗10头虫方法接种待鉴定水稻品种，饲养3-7天后移出全部黑尾叶蝉，将稻苗移栽至温室或植物生长箱内，培养温度为26-30°C，相对湿度为65 %-75 %，光周期为16L: 8D ;7天以后开始观察病毒症状，连续调查20-50天；用RT-PCR和dot-ELISA方法检测水稻；根据饲喂接毒水稻的病毒症状及其RT-PCR和dot-ELISA检测结果判断水稻的抗性。携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉用于筛选抗水稻矮缩病毒特异、灵敏的单抗，从而建立以单抗为核心的检测水稻及黑尾叶蝉体内水稻矮缩病毒的血清学方法。携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉用于研究水稻矮缩病毒与水稻寄主及其介体昆虫之间的互作机理提供物质基础。下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。I、感染RDV水稻的获得
2011年于南寻甸县水稻矮缩病毒发生区采集具有植株矮缩、分蘖增多、叶色浓绿，叶片或叶鞘上出现与叶脉平行的虚线状黄白色点条斑以及心叶抽出呈扭曲状，叶片边缘出现波状缺刻的水稻病样。(I) RT-PCR方法检测水稻是否带毒
参照Trizol试剂提取水稻病样的总RNA，根据GenBank中报道的水稻矮缩病毒的衣壳蛋白基因(CP基因)序列设计引物RDV-CP-F: TACTTT/CTCCGGGCTCACAACAGG (对应CP基因 84-101 位)和 RDV-CP-R CCCCGCAACAGACCGAAACAA (对应 CP 基因 466-486 位)，并由上海英骏生物技术有限公司合成。采用RT-PCR方法检测确定病样感染水稻矮缩病毒。反转录参照M-MLV反转录酶(Promega公司产品)说明书进行，PCR反应体系为即cDNA模板 μ ，5XPrimeSTARTM Buffer (含]\%2+)10μ1，dNTP Mix 4μ1, PrimeSTARTM DNA Polymerase(2.5 U/μυθ. 5μ1，上下游引物各 μ ，最后双蒸无菌水补足反应终体积为50μ1。PCR反应体系如下预变性94°C 2 min,变性94°C 45 s,退火57°C 45 s,延伸72°C I min30s，循环扩增35次，最后延伸72°C 10 min。扩增产物于O. 8%琼脂糖凝胶进行电泳分析(图1)，并用PCR凝胶回收试剂盒(AxyGEN)回收DNA片段，具体操作参考试剂盒说明书进行。将纯化的PCR产物末端加A与克隆载体pMD-18T vector连接，重组质粒命名为pMD18_T_CP，并转化到大肠杆菌DH 5α的感受态细胞中，用质粒提取试剂盒(AxyGEN)提取重组质粒，对提取的重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，并通过测序验证重组克隆载体PMD18-T-CP中所携带的CP基因序列及读码框的正确性，序列分析软件为DNAstar、NCBI-BLAST，所用的数据库为GeneBank等。确定水稻样品所带病毒为RDV。(2) Dot-ELISA检测水稻是否带毒
将水稻叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10 30 (w/v, g /11^)加入0.01 mol/LPBS (pH7. 4)后研磨；病汁液5000 rpm离心3 min;取3 μ I上清点到NC上，同时设置健康和感病水稻叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST (含O. 05% Tween-20的O. 01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min ； NC膜放入1:5000倍稀释的单抗中室温孵育30-60 min ;用PBST洗膜3 4次，每次3 min ； NC膜放入1:8000倍稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG 二抗中室温孵育30 60 min; PBST洗膜4 5次，每次3 min; 66 μ L NBT和33 μ L BCIP底物(Promega)加入到10 ml底物缓冲液(O. I mol/L Tris C1,0. I mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、ρΗ9· 5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果，结果如图2所示,进一步确定水稻感染RDV。··2、黑尾叶蝉的获得
从非病毒区田间采集捕获的黑尾叶蝉若虫，在水稻感病品种上进行饲养，交配后单头虫单独产卵，随机抽取群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR和Dot-ELISA方法检测此虫带毒情况，保留不带毒雌虫的后代，以后每代随机抽取群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR和Dot-ELISA方法确定其确实不带毒，即获得不带RDV的黑尾叶蝉，为避免传毒介体污染，每次饲毒前取100头黑尾叶蝉进行检测，确定其为无毒虫。3、黑尾叶蝉从感染RDV的水稻中获毒 Cl)黑尾叶蝉从冷冻水稻病叶中获毒
从-20°C (或者_70°C)取出冷冻病叶，4°C放置2小时后，放置温室中，3小时后移入烧杯内，由于冷冻叶片较干燥，在叶片底部可用浸湿的棉花固定，并加入少量水来避免叶片太干，影响饲毒效果。(烧杯用尼龙纱布封口，既有较好的空气流动使黑尾叶蝉存活，又可避免黑尾叶蝉逃逸)(图3)，每个烧杯接入60只2-3龄无毒的黑尾叶蝉，饲毒前使其饥饿3小时。饲毒48小时后将存活的黑尾叶蝉移入健康水稻苗上喂养15-20天左右，渡过病毒的循回期，并记录存活的黑尾叶蝉数量。之后将黑尾叶蝉接种感病水稻品种，观察水稻是否表现出水稻矮缩病的症状，并通过免疫学方法和分子技术进行验证。接种后对移出的30只左右黑尾叶蝉进行RT-PCR和Dot-ELISA检测，冷冻叶片饲毒的黑尾叶蝉平均带毒率为55% (图
4)。饲毒后的单头黑尾叶蝉在健康水稻上单独产卵，随机抽取其后代群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR方法检测带毒情况，保留带毒雌虫的后代并建立室内带毒种群，即获得携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉。(2)黑尾叶蝉从培养的新鲜水稻病植株上获毒
水稻病植株用尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器封闭在温湿度控制培养箱中培养(图
5)，良好的空气流动确保植株与黑尾叶蝉的存活，又避免黑尾叶蝉的逃逸。同上，每个装置中放入接入60只2-3龄无毒的黑尾叶蝉，饲毒前使其饥饿3小时。饲毒2-5天后将存活的黑尾叶蝉移入新鲜健康水稻苗上喂养直至渡过病毒的循回期，并记录存活的黑尾叶蝉数量。之后将黑尾叶蝉接种感病水稻品种，观察记录水稻是否表现出水稻矮缩病的症状，并通过免疫学方法和分子技术进行验证。接种后对移出的30只左右黑尾叶蝉进行RT-PCR和Dot-ELISA检测，其带毒率为75% (图6)。饲毒后的单头黑尾叶蝉在健康水稻上单独产卵，随机抽取其后代群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR方法检测带毒情况，保留带毒雌虫的后代并建立室内带毒种群，即获得携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉。4、获毒黑尾叶蝉在单抗筛选工作中的应用
单头黑尾叶蝶放入I. 5 mL的eppendorf的离心管中，并加入100 μ L PBS (O. Olmol/L，pH7. 4)，用牙签捣烂黑尾叶蝉后、5000 rpm离心3 min，取3 μ I上清点到NC上，同时设置健康和带毒黑尾叶蝉分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST (含O. 05% Tween-20的O. 01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min ； NC膜放入适度稀释的单抗中室温孵育30-60 min ;用PBST洗膜3 4次 ，每次3 min ； NC膜放入适度稀释的HRP酶标记羊抗鼠IgG 二抗中室温孵育3(T60 min; PBST洗膜4 5次，每次3 min; A显色底物是HRP的显色底物，S卩如TMB沉淀型显色底物等。如果有阳性反应，则说明抗体可用于病毒的检测，从而以该单抗为核心建立合适的血清学方法对田间的水稻和黑尾叶蝉进行检测，对RDV的发生流行进行预测预警。5、获毒黑尾叶蝉的传毒及在水稻品种抗性鉴定中的应用
选择感病水稻品种进行传毒实验，将5-10只携毒黑尾叶蝉单苗接种，于尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器中培养(图7)，苗龄在二叶一心期，传毒2-3 d后将黑尾叶蝉移出，然后观察并记录水稻的发病情况。调查标准参照水稻矮缩病的典型症状植株矮缩、分蘖增多、叶色浓绿，叶片或叶鞘上出现与叶脉平行的虚线状黄白色点条斑以及心叶抽出呈扭曲状，叶片边缘出现波状缺刻等。用Dot-ELISA方法检测接种后的水稻叶片(图8)，有典型症状的水稻均能现出紫色斑点，无发病症状的水稻保持颜色不变，这表明黑尾叶蝉从冷冻病叶和新鲜病叶上获得水稻矮缩病毒后可以接种至水稻品种上。获毒黑尾叶蝉可用于水稻品种的抗性鉴定，将渡过循回期的获毒黑尾叶蝉置于防虫箱内接种水稻(图9)，接种水稻苗龄为二叶一心期，每苗有带毒叶蝉1-2头，让其传毒取食5-7 d，每天用竿子在网笼内赶虫2-3次，尽量保证传毒的相对一致。然后将接种后的稻苗移栽于泥土中，罩上防虫网，观察水稻发病情况并记录数据及统计发病率，并用RT-PCR和dot-ELISA方法检测水稻是否感染RDV。按照全国水稻病毒病科研协作组统一制定的抗性分级标准，以对照品种岫136-12的发病率为100%，统计各品种的相对发病率.依据发病率划分抗性等级，共5级。O级免疫(immunity, IM),不发病；I级高抗(highly resistant, HR),发病率为 O. 10% -5. 00% ;2 级中抗(moderately resistant,MR)，发病率为 5. 10 % -30. 00 % ;3 级中感(moderately susceptible, MS)，发病率为30. 10% -60. 00% ;4 级高感(highly susceptible, HS)，发病率为 60. 10% 以上。
权利要求
1.一种人工饲喂条件下黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒的方法，其特征在于包括如下步骤 1)黑尾叶蝉的获得 从非水稻矮缩病发生地区的水稻田间采集捕获黑尾叶蝉后在室内用无毒稻苗饲养，待黑尾叶蝉成虫交配后单头虫单独产卵，随机抽取群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR方法检测带毒情况，保留不带毒雌虫的后代并建立室内种群； 2)黑尾叶蝉的获毒 黑尾叶蝉从冷冻保存的感染RDV水稻或活的感病水稻病株中获毒 饲毒前，黑尾叶蝉在滤纸保湿的烧杯中饥饿I 3小时；从-10°C至_80°C保存冰箱中 取出冷冻保存的病株，移入烧杯内，每个烧杯放I 10株病株；接入20 300头3 4龄无毒的黑尾叶蝉若虫，烧杯用尼龙纱布封口 ；把烧杯放入温室或植物生长箱内饲养，温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L 8D ;饲毒I 2天后将存活的黑尾叶蝉移入生长于温室或植物生长箱的健康水稻苗上喂养，温度为26 30°C，相对湿度为60% 75 %，光周期为16L :8D，直至渡过病毒的循回期，约15 20天；饲毒后的单头黑尾叶蝉在健康水稻上单独产卵，随机抽取其后代群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR方法检测带毒情况，保留带毒雌虫的后代并建立室内带毒种群，即获得携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉； 或者，黑尾叶蝉从种植于温室或植物生长箱内的水稻病株上获毒 饲毒前，黑尾叶蝉在滤纸保湿的烧杯中饥饿I 3小时；感染水稻矮缩病毒的水稻病株，用尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器封闭在温湿度控制的植物生长箱中培养，每个塑料容器放I 3株病株植物；每个装置中放入20 200头3 4龄无毒的黑尾叶蝉若虫，饲喂培养温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L 8D ;饲毒I 3天后将存活的黑尾叶蝉移入新鲜健康水稻苗上饲养直至渡过病毒的循回期，约15 20天；饲毒后的单头黑尾叶蝉在健康水稻上单独产卵，随机抽取其后代群体中10%的黑尾叶蝉用RT-PCR方法检测带毒情况，保留带毒雌虫的后代并建立室内带毒种群，即获得携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉。
2.一种如权利要求I所述方法获得的携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉的应用，其特征在于所述的携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种的抗性，用于筛选水稻的抗病品种，并为抗水稻矮缩病毒抗病育种服务。
3.如权利要求2所述的一种携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉的应用，其特征在于所述的携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种抗性的方法为将携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉移入待鉴定的种植于温室或植物生长箱的2-5叶期水稻苗，采用单苗10头虫方法接种待鉴定水稻品种，饲养3-7天后移出全部黑尾叶蝉，将稻苗移栽至温室或植物生长箱内，培养温度为26-30°C，相对湿度为65 %-75 %，光周期为16L 8D ；7天以后开始观察病毒症状，连续调查20-50天；用RT-PCR和dot-ELISA方法检测水稻；根据饲喂接毒水稻的病毒症状及其RT-PCR和dot-ELISA检测结果判断水稻的抗性。
4.一种如权利要求I所述方法获得的携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉的应用，其特征在于所述的携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉用于筛选抗水稻矮缩病毒特异、灵敏的单抗，从而建立以单抗为核心的检测水稻及黑尾叶蝉体内水稻矮缩病毒的血清学方法。
5.一种如权利要求I所述方法获得的携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉的应用，其特征在于所述的携带水稻矮缩病毒的黑尾叶蝉用于研究水稻矮缩病毒与水稻 寄主及其介体昆虫之间的互作机理提供物质基础。
全文摘要
本发明公开了一种人工饲喂条件下黑尾叶蝉获得水稻矮缩病毒(Ricedrawfvirus，RDV)的方法及应用。用培养的感染水稻矮缩病毒的水稻或者冷冻保存的水稻病叶饲喂黑尾叶蝉，使黑尾叶蝉获毒，接着将黑尾叶蝉转移至健康水稻上饲喂，直到渡过病毒的循回期，利用RT-PCR技术和血清学方法对黑尾叶蝉的带毒情况进行鉴定。利用该发明获得的携带RDV的黑尾叶蝉可用于筛选抗RDV的单抗，从而以单抗为核心建立dot-ELISA和TAS-ELISA等血清学方法，进而对该病毒病的发生流行进行监测；此外，获毒的黑尾叶蝉可进行水稻接种实验鉴定水稻品种的抗性，从而筛选抗病品种；还可用于研究RDV与寄主、传毒媒介之间的互作关系，为阐述该病毒病的致病机理及提出有效的防治策略打下理论基础。
文档编号C12Q1/68GK102754623SQ20121025747
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者倪越群, 吴建祥, 周雪平 申请人:浙江大学