专利名称：一种牡蛎鳃部菌群的pcr-dgge分析方法
技术领域：
本发明涉及一种牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法。
背景技术：
牡蛎是福建省大宗特色水产品，每年产量约占全国产量1/2，不仅产量丰富，而且具有较高的营养价值和药用价值，其软体部分蛋白质含量高达50%，素有“海洋牛奶”之称，同时含有丰富的ω — 3多不饱和脂肪酸。但由于牡蛎体内富含浸出物，体表被覆多种黏液，尤其是开壳后的牡蛎，更有利于微生物繁殖，给牡蛎的食用品质和安全品质带来潜在的隐患。牡蛎作为滤食性的海洋贝类，其鳃部在摄食中富集营养物质的同时也聚集了大量微生物，在开壳后，由于该部位营养丰富，微生物大量繁殖而导致牡蛎发酸发臭，最终失去食用价值。很多学者也因此而致力于研究牡蛎保鲜技术和保鲜过程中微生物的变化规律，曹荣发表了“一种复合型生物保鲜剂在牡蛎保鲜中的应用研究”和“气调包装对太平洋牡蛎冷藏保鲜效果的研究”，庄荣玉发表了 “净化后的褶牡蛎细菌菌相分析”的文献，在文献中分别采用涂膜保鲜和气调保鲜技术，用传统的分离培养，并分析了牡蛎中的优势菌。该方法工作繁重，耗时长，未有效分析肠道和鳃部菌群的变化。目前关于保鲜牡蛎微生物的研究仍然以传统的分离培养为主，该方法存在以下四个方面的问题一是自然界的微生物有70%是无法培养的，而鳃部菌群复杂，有些是不可培养的；二是该方法的分离培养周期长，操作繁琐，需要耗费大量的人力物力；三是该方法无法真实而直接反映牡蛎鳃部菌群原始状态，无法准确分析牡蛎腐败菌群；四是保鲜方法大部分是对牡蛎外部菌群的控制，特别是鳃部的微生物，而目前的研究在分析不同保鲜技术对菌群影响时，对整个牡蛎机体的菌群进行传统分离培养，导致大部分肠道菌群干扰分析的准确性。变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术是Muyzer等人在1993年首次应用于微生物群落结构研究，并在之后十几年内得到迅速的发展和完善。DGGE是一种可以将长度相同但核苷酸序列不同的双链DNA片段分开的一种方法，进而研究微生物群落结构的变化。DGGE对于研究微生态系统的菌群具有高通量，快速，有效，准确等优点。
发明内容
本发明是以牡蛎为研究对象，解决传统分离培养方法应用于研究微生物所带来的不足，而建立的一种牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法。为实现上述目的，本发明的具体步骤如下
本发明的分析方法包括DNA提取、巢式PCR扩增、变性梯度凝胶电泳DGGE、对DGGE指纹图谱进行聚类分析；其中所述DNA提取的步骤如下
(I)取牡蛎鳃部组织I 5g，剪碎后，加入50mL的生理盐水中，150rpm震荡20min，200目絹布过滤，取滤液800rpm离心IOmin,去沉淀,清液8000rpm离心IOmin,收集菌体重悬浮于TE中，_20°C保存备用；(2)菌体样品经裂解、抽提、异丙醇沉淀和乙醇洗涤，所得DNA沉淀溶解于TE，-20°C保存备用；
步骤(2)所述的裂解采用溶菌酶和SDS :首先在菌体样品中加入20 100 μ L 10mg/mL的溶菌酶，37°C保温lh，然后依次加入100 μ L 10% SDS和0.3 O. 5mg蛋白酶K干粉，55°C保温Ih ；
步骤(2)所述的抽提参数为氯仿异戍醇v/v=24:1抽提,2000 5000rpm离心5 IOmin,上清用酹氯仿:异戍醇v/v=25:24:1抽提, 3000 8000rpm离心5 IOmin,上清用氯仿异戊醇v/v=24:l再次抽提，10000 rpm离心5 lOmin，吸取上清，用于异丙醇沉淀。DNA提取的步骤中所提取的DNA无需进一步纯化，直接用于巢式PCR扩增。所述巢式PCR扩增，分两个步骤第一步采用细菌通用引物对27F，1492R进行16SrDNA扩增；第二步采用带40GC夹子的引物对338F-GC，518R进行V3区扩增。所述巢式PCR扩增，对第一步的扩增产物稀释50 100倍，取I μ L稀释液作为第二步扩增的模板。取V3区扩增产250 350ng，用于DGGE上样，DGGE胶的浓度为8%的变性聚丙烯酰胺胶，变性梯度范围34% 52%，设定电泳条件60°C，150V，390min，电泳缓冲液为1XTAE，电泳结束后染色25 30min，并立即进行拍照和切胶用于条带分析。所述变性聚丙烯酰胺胶以7M尿素和40%去离子甲酰胺为变性剂。所述巢式PCR扩增，第一步扩增程序94°C预变性5min，94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸I. 5min，循环35次，72°C延伸IOmin ;第二步扩增程序94°C预变性5min，94°〇变性458，601退火 lmin，72°C延伸 30s，循环 35 次，72°C延伸 IOmin0该方法能有效去除牡蛎蛋白质，减少其对菌群总DNA提取效果的影响，还能在分子生物学的基础上达到对牡蛎鳃部细菌总DNA高效提取、有效扩增、菌群微生态准确分析。本发明的显著优点为
(I)本发明将变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术用于牡蛎鳃部菌群研究，可以避免传统分离培养的耗时大，工作繁重，操作繁琐，同时由于传统的方法无法对所有的微生物进行分离培养，可能造成原始菌缺失，无法获取实时和全面的菌群信息，而采用DGGE可以检测到菌群中相对含量1%以上的菌，并可对微生物谱图进行分析。(2)提取高蛋白含量样品的菌群DNA时使用差速离心，使大小不同的蛋白质和脂肪及杂质等在较长的时间内沉淀，防止高速离心造成共沉导致DNA大量损失。提取的DNA质量好，无需回收即可用于扩增，提高效率，节省成本。(3)采用巢式PCR，减少非特异性扩增，样品可直接用于DGGE分析，采用的变性梯度范围及设定的电泳条件，条带在变性胶上迁移距离不同，有效分开，有利于条带回收及后续的分析。
图I为常温贮藏牡蛎和气调保鲜牡蛎鳃部菌群V3区扩增结果。图2为常温贮藏牡蛎和气调保鲜牡蛎鳃部菌群DGGE图谱。
具体实施例方式I、样品DNA的提取
(I)收集菌体取牡蛎鳃部组织2g，剪碎后，加入50mL的生理盐水中，150rpm/min震荡20min, 200目絹布过滤,800rpm/min离心IOmin,去沉淀 ,8000rpm离心IOmin,取沉淀重悬浮于ImLTE中，-20°C冻藏，备用。(2)裂解溶菌酶 30yL 10mg/mL 的溶菌酶，37°C 保温 lh，100yL 10% SDS 和
O.5mg蛋白酶K干粉，55°C保温lh。(3)抽提氯仿异戍醇(24:1)抽提，2000离心10min,3000rpm离心5min,酹氯仿异戍醇(25:24:1)抽提,5000rpm离心lOmin, 7000rpm离心5min,氯仿:异戍醇(24:1)抽提再次抽提，10000 rpm离心IOmin,取上清液至I. 5mL干净管中；
(4)沉淀加O. 6倍体积异丙醇,轻轻颠倒混合，静止IOmin,沉淀DNA。12000rpm离心15min,去上清液,留沉淀。(5)漂洗和风干DNA沉淀加入预冷70%乙醇漂洗后，12000rpm离心IOmin,置于无菌操作台中，用垂直风吹干，沉淀溶解于30μ LTE，_20°C保存备用。2、无需进行纯化，取IyL提取的总DNA作为模板，第一步采用细菌通用引物对(8-27f，1492r)进行16SrDNA扩增，参考程序94°C预变性5min，35个循环(94°C变性lmin, 55°C退火lmin, 72°C延伸I. 5min), 72°C延伸IOmin ;第二步采用带40GC夹子的引物对(338f-GC，518r)扩增，对第一步扩增产物进行稀释100倍，取I μ L稀释液作为V3区扩增的模板，参考程序94°C预变性5min，35个循环(94°C变性45s，60°C退火lmin，72°C延伸30s)，72°C延伸IOmin ;电泳结束后，用1%的琼脂糖凝胶电泳并拍照。3、取V3区扩增产物15 μ L，扩增产物可以直接用于DGGE实验，用于DGGE上样。DGGE胶的浓度为8%的聚丙烯酰胺胶，120ul 10%APS和30ulTEMED加入到30mL的变性丙烯酰胺胶溶液中，待凝胶2h以上，可过夜使用。变性剂梯度范围34% 52% (以7M的尿素和40%的去离子甲酰胺为100%的变性剂)，采用Bio-Rad公司的Dcode电泳仪进行电泳，设定电泳条件60°C，150V，390min，电泳缓冲液为1XTAE。电泳结束后，采用1:5000的Syber-green I溶液染色30min,并立即进行拍照和切胶用于条带分析；
4、DGGE条带图谱分析方法,可进一步采用quantity one及DNAMAN软件进行菌群分布和聚类分析。5、图I、图2中，F为新鲜样品，Al、A2为新鲜样品冷藏6d和12d ;B1、B2为CO2:N2 ( (30±2)%: (70 + 2)%)气调贮藏 8d 和 16d 样品菌群；C1，C2 为 CO2 = N2 ( (50±2)%:(50±2)%)气调贮藏8d和16d样品菌群。图I中V3区扩增结果可以看出，条带单一明亮，无非特异性扩增，说明经该方法提取的细菌总DNA可直接用于巢式PCR扩增，获得较好的扩增样品。图2 PCR-DGGE电泳结果可以看出各条带分开，条带清晰明亮，在低温贮藏过程中DGGE条带较多，说明微生物具有较高的多样性，经气调包装处理后，条带具有显著差异性。条带经切胶，回收，连接转化，测序，比对，结果见表1，条带11和13为是未培养菌，气调包装牡蛎鳃部主要是乳酸菌属。该方法可以鉴定传统方法无法培养的菌，快速准确分离和鉴定出各个菌种。表I DGGE图谱分离细菌V3区序列相似性比较结果
权利要求
1.一种牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法，其特征在于所述方法包括DNA提取、巢式PCR扩增、变性梯度凝胶电泳DGGEj^ DGGE指纹图谱进行聚类分析；其中所述DNA提取的步骤如下 (1)取牡蛎鳃部组织I 5g，剪碎后，加入50mL的生理盐水中，150rpm震荡20min，200目絹布过滤，取滤液800rpm离心IOmin,去沉淀,清液8000rpm离心IOmin,收集菌体重悬浮于TE中，_20°C保存备用； (2)菌体样品经裂解、抽提、异丙醇沉淀和乙醇洗涤，所得DNA沉淀溶解于TE，-20°C保存备用； 步骤(2)所述的裂解采用溶菌酶和SDS :首先在菌体样品中加入20 100 μ L 10mg/mL的溶菌酶，37°C保温lh，然后依次加入100 μ L 10% SDS和0.3 O. 5mg蛋白酶K干粉，55°C保温Ih ； 步骤(2)所述的抽提参数为氯仿异戍醇v/v=24:1抽提,2000 5000rpm离心5 IOmin,上清用酌·:氯仿:异戍醇v/v=25:24:1抽提,3000 8000rpm离心5 IOmin,上清 用氯仿异戊醇v/v=24:l再次抽提，10000 rpm离心5 lOmin，吸取上清，用于异丙醇沉淀。
2.根据权利要求I所述的牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法，其特征在于DNA提取的步骤中所提取的DNA无需进一步纯化，直接用于巢式PCR扩增。
3.根据权利要求I所述的牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法，其特征在于所述巢式PCR扩增，分两个步骤第一步采用细菌通用引物对27F，1492R进行16SrDNA扩增；第二步采用带40GC夹子的引物对338F-GC，518R进行V3区扩增。
4.根据权利要求3所述的牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法，其特征在于所述巢式PCR扩增，对第一步的扩增产物稀释50 100倍，取I μ L稀释液作为第二步扩增的模板。
5.根据权利要求3所述的牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法，其特征在于取V3区扩增产250 350ng，用于DGGE上样，DGGE胶的浓度为8%的变性聚丙烯酰胺胶，变性梯度范围34% 52%，设定电泳条件60°C，150V，390min，电泳缓冲液为1XTAE，电泳结束后染色25 30min，并立即进行拍照和切胶用于条带分析。
6.根据权利要求5所述的牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法，其特征在于所述变性聚丙烯酰胺胶以7M尿素和40%去离子甲酰胺为变性剂。
7.根据权利要求3所述的牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法，其特征在于所述巢式PCR扩增，第一步扩增程序94°C预变性5min，94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸·1.5min，循环35次，72°C延伸IOmin ;第二步扩增程序94°C预变性5min，94°C变性45s，60°C退火 lmin，72°C延伸 30s，循环 35 次，72°C延伸 IOmin0
全文摘要
本发明涉及一种牡蛎鳃部菌群的PCR-DGGE分析方法。所述方法包括DNA提取、巢式PCR扩增、变性梯度凝胶电泳DGGE、对DGGE指纹图谱进行聚类分析；其中所述DNA提取的步骤为(1)取牡蛎鳃部组织经生理盐水震荡、过滤，取滤液离心，去沉淀，清液离心，收集菌体；(2)菌体样品经裂解、抽提、异丙醇沉淀和乙醇洗涤；本发明是以牡蛎为研究对象，解决传统分离培养方法应用于研究微生物所带来的不足，该方法可以用于保鲜或者养殖过程中牡蛎鳃部主要菌群的分析，可避免传统分离培养的耗时大，工作繁重，操作繁琐，实现对含高蛋白的牡蛎样品中菌群总DNA的高效提取、有效扩增以及菌群微生态准确分析。
文档编号C12Q1/04GK102747164SQ201210258308
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月25日 优先权日2012年7月25日
发明者熊君, 王梅英, 陈团伟, 陈慧斌, 陈绍军 申请人:福建农林大学