专利名称：一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因构建方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及基因的构建方法，具体涉及一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因构建方法。
背景技术：
马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus, PLRV)是马铃薯生产中危害最重的病毒之一,在世界各马铃薯产区均有分布。PLRV靠蚜虫(主要是桃蚜(Myzus persicae))以持久、循环增殖型方式传播。马铃薯感染PLRV后，正常的生理功能受到破坏，叶片呈现卷曲、黄化，叶质厚而脆，枝条僵化，植株矮缩，块茎网状坏死，严重影响产量和品质。为了提高马铃薯对卷叶病毒的抗性，生产上采取茎尖脱毒组织培养措施生产病毒含量很低的种薯，但成本高、环节多、工作量大，需要专门的脱毒组培设施，脱毒后的种薯在栽培过程中会受耕作措施及蚜虫的侵染而重新感染病毒，种植两三年后产量又会严重下降；而马铃薯为同·源四倍体作物，无性繁殖，以常规育种改良品种，过程复杂需时较长，利用基因工程培育抗病毒马铃薯是从根本上解决病毒侵染的有效途径。随着本领域技术的发展，人们把PLRV的基因转入马铃薯，发现能提高抗病性，如张鹤龄(1995)、南相日(2007)分别将PLRV的外壳蛋白基因CP转入马铃薯，Kaniewski等(1994)把PLRV的复制酶基因NIb转入马铃薯，董江丽等(1999)把PLRV的基因间隔序列IS转化马铃薯，都获得了抗病性比非转基因马铃薯提高的植株，但抗病株率较低，抗病水平也不高，难以用于生产。由于这些转基因在马铃薯体内转录的RNA是完整的，有可能与侵入马铃薯体内的其它病毒的RNA发生同源重组或异源包装，引发生物风险。RNA干扰是近年来发现的生物对病毒的重大抗性机制。将病毒的某一序列设计成反向重复结构，转入植物体后，转录出的RNA会形成双链结构，被植物体内的核酸酶切割成21-23nt的小干扰RNA。如果供体病毒侵染植物体,这些小干扰RNA就会介导病毒mRNA与之同源的部分降解，阻断病毒的繁殖，赋予转基因植株稳定遗传的抗病毒性状。由于转基因表达的mRNA会降解，也就规避了与入侵病毒发生同源重组的潜在风险。RNA干扰已用于作物的抗病毒育种，但是，也有一些研究发现RNA干扰抗病效率不高甚至达不到抗病的效果。通过大量研究，人们发现RNA干扰的效率与形成的双链RNA的长度和同源性有密切关系。Wesley等(2001)发现，双链RNA的长度为400-800 bp时，基因沉默的效率最为稳定。Helliwell等(2003)发现，50-1000 bp的基因片段均能诱发基因沉默，但基因片段越短，基因沉默的效率越低，并认为片段长度为300-600 bp时是合适的，可以获得最高的基因沉默效率。较长的双链RNA可能诱发更高的沉默效率，但是在进行基因体外操作时将给基因的转化以及表达等产生不利的影响。RNA干扰效率也高度依赖于序列的同源性。植物病毒容易发生变异，形成不同的小种，因此选择病毒基因组中最为保守的区域进行基因沉默会提高抗病效率。也有研究表明，在同一载体中设计针对多个基因的靶位点的RNA干扰的途径对艾滋病毒具有很好的抑制效果。PLRV病毒是单链正义RNA病毒，属黄化病毒组iUiteovirus)，基因组全长6. O kb,中间有一段197 bp的非编码区，也称之为基因间隔区IS。IS将基因组分为5’和3’两个编码区。IS序列在PLRV基因组中比较保守，可能为PLRV亚基因组启动子，控制其下游亚基因组的表达。IS的5’端连接复制酶基因Nib，3’端连接外壳蛋白基因CP。利用RNA干扰沉默PLRV病毒多个基因尚未见报道。本发明利用RT-PCR克隆PLRV病毒的一段序列，该序列包含复制酶基因3’端、基因间隔区和外壳蛋白基因5’端。将克隆是这段序列构建成反向重复基因结构，以PLRV病毒的复制酶基因、基因间隔区序列和外壳蛋白基因为靶位点进行沉默，以期获得多基因沉默的抗PLRV病毒的马铃薯，提高抗病效率。
发明内容
本发明是为了解决现有提高马铃薯抗卷叶病毒的方法中存在的问题，提供了一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因构建方法。本发明是采用如下技术方案实现的· 一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因构建方法，包括以下步骤
(1)从感染PLRV病毒的马铃薯植物体内提取总RNA，通过RT-PCR扩增和基因克隆工序得到PLRV病毒的一段序列NiblsCp，该序列包括复制酶基因NIB的3’端、基因间隔区IS和外壳蛋白基因CP的5’端，位于卷叶病毒基因组的第3422至3790个核苷酸之间；
(2)将序列NibISCp以正向和反向连接到一个内含子的两侧，构建成I个反向重复基因结构 RNAiNibIsCp ；
(3)反向重复基因结构RNAiNibIsCp两端分别连接启动子和终止子。进一步地，所述的RT-PCR扩增，是取感染PLRV病毒的马铃薯块茎的RNA2PL，再加入 ΙΟμΜ 的反向引物 2PL，10mM dNTP 2μ , ddH20 12μ , 65°C水浴 5min，冰浴 2min，再加Λ 5XRT 缓冲液 5μ , RNasin^L(5U)，M-MLRV 酶 μ (100U)，混匀后，42°C 60min，再 85°CIOmin,终止反应。本发明所基于的理论基础是把源自病毒的基因构建成反向重复序列导入植物体，其转录产物会通过分子内序列互补形成双链RNA结构，这些双链RNA会被植物体内的核酸酶切割成小干扰RNA，如果供体病毒侵入植物体，这些小干扰RNA会介导病毒mRNA中与其同源的部分降解，阻止了病毒的复制和扩散，从而使转基因植物获得抗病性。将本发明构建好的抗PLRV病毒的基因RNAiNibIsCp通过DNA重组技术连接到可在细菌细胞或植物细胞中自我复制的植物表达载体上，例如衍生于大肠杆菌的质粒载体pUC18、pUC19，以及经过不同的修饰而造成不同的多克隆位点的一系列通称为pGEM的质粒载体(由Promega公司生产)和pBS_T载体(由天根公司生产),尤其是植物表达载体PCAMBIA3301、pBinl9、pROKII和pBI121系统等，在本发明的一系列优选实施方案中，选用pBS-T、pCAMBIA3301等，后者特别适于作为制备植物表达载体的工具质粒载体；然后将植物表达载体转入并整合到马铃薯基因组中，而抗病基因RNAiNibIsCp在马铃薯中的表达可赋予该植物对PLRV病毒的抗性，同时马铃薯的后代及任何部分的组织均具有抗性。上述将携带外源基因的表达载体导入宿主植物或其细胞内的许多方法都是本领域技术人员熟知的。这些方法包括a、农杆菌介导法、b、物理法，如基因枪法、电击融合法、显微注射法、超声波法等；c、化学法，如PEG介导的转化法、脂质体介导转化法等；d、种植系统转化法，如花粉管通道法、子房注射法、浸泡法等；e、以花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒载体所介导的转化法。与现有技术相比，本发明具有以下优点
(1)本发明所述的方法构建的多基因融合的反向重复序列的转录产物会形成一种序列自我互补的双链RNA结构，该结构会激发植株体内的RNAi机制，把该双链结构降解成小片段，因此转基因的mRNA不存在或存在量很少，也不会翻译成蛋白质，避免了常规抗病毒转基因方式可能引起病毒与转基因发生同源重组或异源包装的潜在生物风险；
(2)克隆的序列NibISCp由复制酶基因NIB的3’端序列、基因间隔区IS和外壳蛋白基因CP的5’端序列组成，在植物体内能同时沉默PLRV病毒的这3个基因，提高对PLRV病毒的抗性。
图I为马铃薯卷叶病毒基因片段的RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳结果；·
图2为本发明所述的抗性基因RNAiNibIsCp的构建过程示意图。
具体实施例方式以下是本发明的一个具体实施例
步骤一马铃薯卷叶病毒多基因融合序列的获得CCGACACGATCGTGAGCTCG
I、根据PLRV的基因组序列(Accession :NC_001747)，设计PCR引物
正向引物 I :5’-GCATCGATTCCGACACGATCGTGAGCTCGT-3’，其 5’端人工加有 ClaI 酶切位占.
反向引物 I :5’-CGTGGTTACCTGAACTGTTAGCGCGCCT-3’，其 5’端人工加有 BstEII 酶切位占.
正向引物 2 :5’-CTGGTACCGACACGATCGTGAGCTCGT-3’，其 5’端人工加有 KpnI 酶切位点； 反向引物 2 :5’ -TCAGATCTGAACTCTGTTAGCGCGCCT-3’，其 5’ 端人工加有 BglII 酶切位点。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。2、cDNA第一链合成提取感染PLRV病毒的马铃薯块茎的RNA，取2μ ，再加入ΙΟμΜ的反向引物 I 2PL，10mM dNTP 2μ , ddH20 12μ , 65°C水浴 5min，冰浴 2min，再加入 5XRT缓冲液 5μ , RNasin^L (5U) ,M-MLRV 酶 μ (100U)，混匀后，42°C 60min，再 85°C IOmin,终止反应。3、PCR扩增以步骤2反转录合成的第一链cDNA为模板，在正向引物I和反向引物I的引导下，PCR扩增PLRV的融合基因片段。PCR扩增得到的多基因融合序列两侧分别含有人工加上的ClaI酶切位点和BstEII酶切位点，该序列命名为BsCl。以步骤2反转录合成的第一链cDNA为模板，在正向引物2和反向引物2的引导下，PCR扩增PLRV的一段序列，该序列是一段多基因融合序列，由复制酶基因、基因间隔区和外壳蛋白基因组成。PCR扩增得到的多基因融合序列两侧分别含有人工加上的KpnI酶切位点和BglII酶切位点，该序列命名为BgKp。PCR反应程序是94°C变性 5min ;94°C变性 45s，58°C复性 lmin，72°C延伸 lmin，30个循环；然后70°C延伸lOmin。反应结束后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，用柱式回收试剂盒(博迈德)回收约370bp的扩增产物。图I为马铃薯卷叶病毒基因片段的RT-PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳结果；图中M为DNA分子量标准，I为利用正向引物I与反向引物I通过RT-PCR扩增的PLRV基因；2为利用正向引物2和反向引物2通过RT-PCR扩增的PLRV基因。4、基因克隆取步骤3回收的PCR产物与pBS-T克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，然后提取质粒进行酶切鉴定，将阳性克隆送三博远志生物技术有限责任公司进行核苷酸序列测定。测序结果表明，融合基因片段已插入PBS-T载体，得到重组克隆载体。插入了 BsCl序列的重组克隆载体命名为pBS-BsCl，插入了 BgKp序列的重组克隆载体命名为pBS-BgKp
表I是克隆的PLRV的一段序列所在的基因组信息
权利要求
1.一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因的构建方法，其特征是包括以下步骤 (1)从感染马铃薯卷叶病毒的植物体内经提取总RNA、通过RT-PCR扩增和基因克隆工序得到卷叶病毒的一段保守序列，所述保守序列包括复制酶基因、基因间隔区和外壳蛋白基因，位于卷叶病毒基因组的第3422至3790个核苷酸之间； (2)将步骤(I)获得的卷叶病毒的保守序列以正向和反向分别连接到一个内含子的两侦牝构建成一个反向重复序列，即为提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因RNAiNibIsCp ； (3)将基因RNAiNibIsCp两端分别连接启动子和终止子。
2.根据权利要求I所述的一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因的构建方法，其特征是所述的保守序列包括复制酶基因NIB的3’端、基因间隔区IS和外壳蛋白基因CP的5’端。
3.根据权利要求I或2所述的的一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因的构建方法，其特征是所述的RT-PCR扩增，是取感染PLRV病毒的马铃薯块茎的RNA2PL，再加入ΙΟμΜ的 反向引物 2PL，10mM dNTP 2μ , ddH20 12μ , 65°C水浴 5min，冰浴 2min，再加入 5XRT 缓冲液 5μ ，Rnasin μ (5U)，M-MLRV 酶 μ (100U)，混匀后，42°C 60min，再 85°C lOmin，终止反应。
全文摘要
本发明公开了一种提高马铃薯对卷叶病毒抗性的基因构建方法，属于生物技术领域。包括以下步骤从感染马铃薯卷叶病毒的植物体内经提取总RNA、通过RT-PCR扩增和基因克隆工序得到卷叶病毒的一段保守序列,所述保守序列包括复制酶基因、基因间隔区和外壳蛋白基因，位于卷叶病毒基因组的第3422至3790个核苷酸之间；将保守序列以正向和反向分别连接到一个内含子的两侧，构建成一个反向重复序列，即基因RNAiNibIsCp，然后在基因两端分别连接启动子和终止子。本发明避免了常规抗病毒转基因方式可能引起病毒与转基因发生同源重组或异源包装的潜在生物风险；克隆的序列NibISCp在植物体内能同时沉默PLRV病毒的这3个基因，提高对PLRV病毒的抗性。
文档编号C12N15/113GK102787126SQ20121025861
公开日2012年11月21日 申请日期2012年7月25日 优先权日2012年7月25日
发明者张忠梁, 张维锋, 施俊凤, 白云风, 郭志华, 闫建俊 申请人:山西省农业科学院作物科学研究所