专利名称：可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体及其筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸适配体及其筛选和应用，尤其涉及一种可用于检测人肝癌细胞的核酸适体及其筛选方法和应用。
背景技术：
核酸适体(aptamer)是通过指数富集配基的系统进化技术(SELEX)筛选得到的，能特异结合IE物质的单链寡聚核苷酸(ssDNA或ssRNA)。核酸适体与抗体功能类似,但是与抗体相比具有更多的优势，具有更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够化学合成，成本低；可进行标记；稳定性好，易于保存等优点。核酸适体的靶分子更为广泛，包括金属离子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白质，并从单一靶标扩展至完整的病毒颗粒及细胞等复合物靶标。因此，核酸适体具有广泛的应用前景。肝癌是发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌，原发性肝癌是临 床上最常见的恶性肿瘤之一。全世界每年新发肝癌患者约60万，居恶性肿瘤的第五位。对于恶性肿瘤而言，如果能及早发现、尽早治疗，则癌症的病情往往容易得到控制，降低肝癌发病引起的死亡风险。因此，开发一种更加灵敏、简便、高效和具有特异性的肝癌检测手段，对于肝癌的临床治疗将具有十分重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性、无免疫原性、能够化学合成、分子量小、稳定、易于保存和标记的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体及其衍生物，还提供前述核酸适体的筛选方法和应用。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列包括以下序列I 序列4中的任意一条序列所示的DNA片段
序列I :
5，-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATAAACGGTCACCCGAGTAGAGGGTATGGACTTCGACGTATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’ ；
序列2
5，-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAATGGAATGTGGGAGGGGGACTCAGGACAGTCACGGGACATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’ ；
序列3
5，-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAGAGGACCCCAGGGTATGGACTTCGACGTCTGAGGTCATCTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’ ；
序列4 5 ’ -ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAAAGTTCAACAAGTGGGAGGGGGACTTAGGACAGTCATCTTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’。上述的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列上的某一位置可优选被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。上述的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列上优选结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。以上不论是经部分取代或者经过修饰后的核苷酸序列，都具有原核酸适体基本相同的性质和功能，即都可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种
(1)与上述所列核酸适体的核苷酸序列的同源性在60%以上；
(2)与上述所列核酸适体的核苷酸序列进行杂交的序列；或者
(3)上述所列核酸适体的核苷酸序列转录的RNA序列。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体衍生物，所述衍生物是上述所列核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。以上不论是衍生出的核酸适体还是衍生出的其他衍生物，都具有原核酸适体基本相同的性质和功能，即都可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404。作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的核酸适体的筛选方法，包括以下步骤
(1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物
随机文库 RS40 :5’ -ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA(40N) TGTAGGAGGGTGCGGAAGTA5’ 引物5’ -FAM-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-3’
3’ 引物5’ -Biotin-TACTTCCGCACCCTCCTACA-3’ ；
(2)Cell-SELEX获得人肝癌细胞株Bel-7404特异核酸适体培养Bel-7404细胞至基本铺满瓶底，去除培养基后用缓冲液洗涤，然后与随机序列在冰上孵育后，弃溶液；再将上述随机文库溶解、恒温振荡后与经前述处理后的Bel-7404细胞在冰上孵育；孵育完成后弃掉孵育瓶内的液体，并用缓冲液冲洗孵育瓶，然后用无菌水刮取孵育瓶内的Bel-7404细胞并置于沸水浴中加热，加热完成后再离心取上清，即为筛选所得的Bel-7404特异核酸适体文库；
(3)PCR扩增文库将步骤(2)中筛选所得的Bel-7404特异核酸适体文库进行常规PCR扩增，得到扩增产物；
(4)制备DNA单链文库将链霉亲和素修饰的琼脂糖微球离心去上清，再将步骤(3)中PCR扩增所得的双链DNA与琼脂糖微球在常温下孵育，通过双链DNA上的生物素与琼脂糖微球上的链霉亲和素的亲和作用将双链DNA充分捕获到琼脂糖微球表面，洗涤后加入碱液至琼脂糖微球中，常温下反应、离心、收集上清；将上清液过除盐柱后收集滴下的溶液，此即为DNA单链文库；
(5)重复筛选将步骤(4)得到的DNA单链文库重复上述步骤(2) (4)的过程一次；
(6)阴性筛选以人胆管癌QBC-939为对照，将步骤(5)后筛选得到的DNA单链文库进行阴性筛选，阴性筛选的具体操作为培养人胆管癌QBC-939细胞至基本铺满瓶底，去除培基后用缓冲液洗涤，然后与无关序列在冰上孵育后，弃溶液；再将筛选得到的DNA单链文库溶解、恒温振荡后与经前述处理后的人胆管癌QBC-939细胞在冰上孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的溶液；
(7)多轮筛选将步骤(6)所收集的溶液继续进行上述步骤(2) (4)的操作过程，然后再依次重复步骤(6)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)的过程；重复筛选过程中用流式细胞术监测文库对Bel-7404细胞识别能力的增强情况，直至文库对Bel-7404细胞的识别能力满足要求后，将所得产物经克隆测序分析，最终得到可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体。上述的核酸适体的筛选方法，所述PCR扩增时的工艺条件优选为94°C 3min,94°C 30sec,63°C 30sec, 72°C 30sec,经合适循环轮数(本领域人员经过不同循环轮数的产物进行琼脂糖电泳和凝胶成像，选择电泳条带清楚且没有非特异性扩增的产物的循环轮数，即为合适的循环轮数)，72°C 3min。上述的核酸适体的筛选方法，所述步骤(2)中，与无关序列在冰上孵育的时间优选控制在15 min 30min，与所述Bel-7404细胞在冰上孵育的时间优选控制在30 min 60min,所述沸水浴中的加热时间优选控制在10 min 15min ;所述步骤(4)中，与琼脂糖微球在常温下孵育的时间优选控制在30 min 45min，加入碱液后的反应时间优选控制在15min 20mino作为一个总的技术构思，本发明还提供一种上述的各核酸适体或者上述的核酸适体衍生物在识别人肝癌细胞株Bel-7404或者制备检测人肝癌细胞株Bel-7404的试剂盒中的应用。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明通过SELEX筛选得到的核酸适配体具有比蛋白抗体更高的亲和力与特异性；无免疫原性；能够化学合成，分子量小；可以对不同部位进行修饰和取代，且序列稳定，易于保存，便于标记等。采用本发明的核酸适体进行肝癌细胞的检测时，操作更为简单、迅速，由于核酸适体的合成成本较抗体制备成本低，且周期短，重现性好。本发明的可识别人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体均能特异性且高亲和力的识别人肝癌细胞株Bel-7404，利用本发明的核酸适体对其结合的靶分子进行研究，可以得到其肿瘤标志物，这对于肝癌的早期检测具有重要意义，在肝癌的诊断方面有良好的应用前景。
图I为本发明实施例中四条核酸适体识别人肝癌细胞Bel-7404的激光共聚焦图，其中，上两排为明场与荧光的叠加图，下排是荧光图(同一张照片在不同条件下拍摄的)。图2为本发明实施例中四条核酸适体对人肝癌细胞鉴定的流式结果对比图，其中，左图为四条核酸适体与对照细胞的流式结果，右图为与靶细胞的流式结果。图3为本发明实施例中流式细胞仪测定Isl序列核酸适体结合Bel-7404的解离常数绘制曲线。图4为本发明实施例中流式细胞仪测定ls2序列核酸适体结合Bel-7404的解离常数绘制曲线。
图5为本发明实施例中流式细胞仪测定ls3序列核酸适体结合Bel-7404的解离常数绘制曲线。图6为本发明实施例中流式细胞仪测定ls5序列核酸适体结合Bel-7404的解离常数绘制曲线。
具体实施例方式以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步描述。实施例
一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，该核酸适体的核苷酸序列包括以下序列I 序列4中的任意一条序列所示的DNA片段
FAM-Isl
5，-FAM-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATAAACGGTCACCCGAGTAGAGGGTATGGACTTCGACGTATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA -3’ ；
FAM-Is 2
5，-FAM-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAATGGAATGTGGGAGGGGGACTCAGGACAGTCACGGGACATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA _3’ ；
FAM-Is 3
5，-FAM-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAGAGGACCCCAGGGTATGGACTTCGACGTCTGAGGTCATCTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA -3’ ；
FAM-Is5
5，-FAM-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAAAGTTCAACAAGTGGGAGGGGGACTTAGGACAGTCATCTTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA -3’。上述的各核酸适体的核苷酸序列上的某一位置可被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。上述各核酸适体的核苷酸序列上可结合生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶标记。上述核酸适体的核苷酸序列的骨架还可衍生出可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的硫代磷酸酯骨架，还可衍生出其他的核酸适体，衍生出的核酸适体的核苷酸序列可以为以下三种序列中的任意一种
(1)与上述所列核酸适体的核苷酸序列的同源性在60%以上；
(2)与上述所列核酸适体的核苷酸序列进行杂交的序列；或者
(3)上述所列核酸适体的核苷酸序列转录的RNA序列。本实施例的上述四条可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体主要采用以下筛选方法筛选得到
I.合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物
随机文库 RS40 :5’ -ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA (40N) TGTAGGAGGGTGCGGAAGTA
5 ’ 引物5 ’ -FAM-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-3，
3 ’ 引物5 ’ -FAM-TACTTCCGCACCCTCCTACA-3，。2. Cell-SELEX获得人肝癌细胞株Bel-7404特异核酸适体。
2. I 1640培养基加12%小牛血清培养Bel-7404细胞至铺满瓶底95%，去除培养基后用IOmL washing buffer洗漆，与ImL含InM无关序列的binding buffer在冰上孵育15min,弃溶液。2. 2用300 u I binding buffer溶解IOnmol上述的随机单链DNA文库，95°C恒温振荡5min,迅速放入冰中；在随机文库中补充binding buffer至终体积为ImL,与步骤2. I中已经处理好的Bel-7404细胞在冰上孵育lh。2. 3孵育完成后倒出孵育培养瓶内的液体，用IOmL washing buffer洗涤孵育培养瓶中的细胞；用ImL无菌水刮取孵育培养瓶内细胞，置于EP管中沸水浴加热lOmin，12000rmp离心取上清，即为筛选所得的Bel-7404特异核酸适体文库。3.进行PCR扩增文库取IOOiU筛选所得的Bel-7404特异核酸适体文库进行常规 PCR 扩增，扩增条件为94°C 3min,94°C 30sec,63°C 30sec,72°C 30sec，经合适循环轮数，72°C 3min。第一轮筛选后需将全部所得的Bel-7404特异核酸适体文库预扩增10个循环，再进行本步骤的扩增，得到扩增产物。
4.制备DNA单链文库将100 U I链霉亲和素修饰的琼脂糖微球5000rmp离心去上清，再用500 u I PBS洗涤，离心去上清；重复洗涤一次。将步骤3中PCR扩增所得的双链DNA与琼脂糖微球在常温下孵育半小时，通过双链(PCR扩增后得到的为双链DNA)DNA上的生物素与琼脂糖微球上的链霉亲和素的亲和作用将双链DNA充分捕获到琼脂糖微球表面；5000rmp离心去上清，用PBS离心洗涤两次。然后加入200mM NaOH溶液500 U I至琼脂糖微球中，常温反应15min,5000rmp离心5min,收集上清。除盐柱用IOmL无菌水洗漆后,加入收集得到的上清液，自然滴完。加入ImL无菌水，收集滴下的溶液，此即为DNA单链文库。5.重复筛选将步骤(4)得到的DNA单链文库重复上述步骤2 4所示的阳性筛选(即步骤2)、PCR扩增及制取单链DNA文库过程。6.阴性筛选在第三轮筛选及以后，以人胆管癌QBC-939为对照，将步骤(5)后筛选得到的DNA单链文库进行阴性筛选，阴性筛选的具体操作为培养人胆管癌QBC-939细胞至铺满瓶底，去除培基后用缓冲液洗涤，然后与无关序列在冰上孵育后，弃溶液；再将筛选得到的DNA单链文库溶解、恒温振荡后与经前述处理后的人胆管癌QBC-939细胞在冰上孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的溶液。7.多轮筛选将步骤6所收集的溶液继续进行上述步骤2 4的操作过程，然后再依次重复步骤6、步骤2、步骤3、步骤4的过程；重复筛选过程中用流式细胞术监测所得文库对Bel-7404细胞识别能力的增强情况，直至15轮筛选后文库对Bel-7404细胞的识别能力满足要求，将所得产物经克隆测序分析，最终得到本实施例的四条可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体。考察I :激光共聚焦检测四条核酸适体识别人肝癌细胞Bel-7404及其特异性。在激光共聚焦小皿中分别培养人肝癌细胞Bel-7404和人胆管癌细胞QBC-939，倒出培养基，用PBS将细胞洗涤三次。细胞与含250nM上述本实施例四条核酸适体的bindingbuffer冰上孵育半小时，倒出反应液，用binding buffer洗漆两次，最后加入200 U Ibinding buffer用于检测,结果如图I所示。检测结果表明本实施例的四条核酸适体均能很好地识别人肝癌细胞Bel-7404，对人胆管癌细胞QBC-939不识别。考察2 :流式细胞仪验证四条核酸适体检测人肝癌细胞Bel-7404。
将处于对数期生长的人肝癌细胞Bel-7404用胰酶消化打散，在培养基中悬浮培养4h，2000rpm离心去上清，用5ml PBS离心洗涤两次。细胞与含250nM上述本实施例四条核酸适体的binding buffer冰上孵育半小时,2000rmp去上清,用ImL binding buffer洗漆两次；最后加入400ul binding buffer,用于流式细胞仪检测,检测结果如图2所示。图2的检测结果表明四条核酸适体均能很好地检测人肝癌细胞Bel-7404。考察3 :流式细胞仪测定四条核酸适体对Bel-7404的解离常数。解离常数测定的操作与考察2的操作基本一致，平行配制不同浓度的含本实施例核酸适体的反应液，以流式细胞仪的荧光值为纵坐标，以核酸适体的浓度为横坐标，由Y=Bfflax*X/(Kd+X)方程模拟曲线，得到本实施例四条核酸适体的解离常数绘制曲线如图3 图6，由此可得到解离常数Kd如下表I所示。图3 图6及表I的检测结果表明lsl、ls2、ls3、ls5与靶细胞Bel-7404细胞的结合能力很强，解离常数均在纳摩尔级别。表I :四条核酸适体的解离常数_
权利要求
1.一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，所述核酸适体的核苷酸序列包括以下序列I 序列4中的任意一条序列所示的DNA片段 序列I :5，-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTATAAACGGTCACCCGAGTAGAGGGTATGGACTTCGACGTATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’ ； 序列2 5，-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAATGGAATGTGGGAGGGGGACTCAGGACAGTCACGGGACATGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’ ； 序列3 5，-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAGAGGACCCCAGGGTATGGACTTCGACGTCTGAGGTCATCTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’ ； 序列4 5，-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTAAAGTTCAACAAGTGGGAGGGGGACTTAGGACAGTCATCTTGTAGGAGGGTGCGGAAGTA-3’。
2.根据权利要求I所述的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，其特征在于所述核酸适体的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
3.根据权利要求I或2所述的可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，其特征在于所述核酸适体的核苷酸序列上结合有生物素、地高辛、荧光物质、纳米发光材料或酶 T 己 O
4.一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，其特征在于所述核酸适体的核苷酸序列包括以下三种序列中的任意一种 (O与权利要求I或2或3中所述核酸适体的核苷酸序列的同源性在60%以上； (2)与权利要求I或2或3中所述核酸适体的核苷酸序列进行杂交的序列；或者 (3)权利要求I或2或3中所述核酸适体的核苷酸序列转录的RNA序列。
5.一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体衍生物，其特征在于所述衍生物是权利要求I或2或3中所述核酸适体的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架。
6.一种如权利要求I所述的核酸适体的筛选方法，包括以下步骤 (1)合成以下序列所示的随机单链DNA文库和引物 随机文库 RS40 :5’ -ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA(40N) TGTAGGAGGGTGCGGAAGTA 5’ 引物5’ -FAM-ATGAGAGCGTCGGTGTGGTA-3’3’ 引物5’ -Biotin-TACTTCCGCACCCTCCTACA-3’ ； (2)Cell-SELEX获得人肝癌细胞株Bel-7404特异核酸适体培养Bel-7404细胞至基本铺满瓶底，去除培养基后用缓冲液洗涤，然后与随机序列在冰上孵育后，弃溶液；再将上述随机文库溶解、恒温振荡后与经前述处理后的Bel-7404细胞在冰上孵育；孵育完成后弃掉孵育瓶内的液体，并用缓冲液冲洗孵育瓶，然后用无菌水刮取孵育瓶内的Bel-7404细胞并置于沸水浴中加热，加热完成后再离心取上清，即为筛选所得的Bel-7404特异核酸适体文库； (3)PCR扩增文库将步骤(2)中筛选所得的Bel-7404特异核酸适体文库进行常规PCR扩增，得到扩增产物； (4)制备DNA单链文库将链霉亲和素修饰的琼脂糖微球离心去上清，再将步骤(3)中PCR扩增所得的双链DNA与琼脂糖微球在常温下孵育，通过双链DNA上的生物素与琼脂糖微球上的链霉亲和素的亲和作用将双链DNA充分捕获到琼脂糖微球表面，洗涤后加入碱液至琼脂糖微球中，常温下反应、离心、收集上清；将上清液过除盐柱后收集滴下的溶液，此即为DNA单链文库； (5)重复筛选将步骤(4)得到的DNA单链文库重复上述步骤(2) (4)的过程一次； (6)阴性筛选以人胆管癌QBC-939为对照，将步骤(5)后筛选得到的DNA单链文库进行阴性筛选，阴性筛选的具体操作为培养人胆管癌QBC-939细胞至基本铺满瓶底，去除培基后用缓冲液洗涤，然后与无关序列在冰上孵育后，弃溶液；再将筛选得到的DNA单链文库溶解、恒温振荡后与经前述处理后的人胆管癌QBC-939细胞在冰上孵育，孵育完成后收集细胞孵育后的溶液； (7)多轮筛选将步骤(6)所收集的溶液继续进行上述步骤(2) (4)的操作过程，然后再依次重复步骤(6)、步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)的过程；重复筛选过程中用流式细胞术监测文库对Bel-7404细胞识别能力的增强情况，直至文库对Bel-7404细胞的识别能力满足要求后，将所得产物经克隆测序分析，最終得到可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其特征在于，所述PCR扩增时的エ艺条件为94°C3min，94°C 30sec，63°C 30sec，72°C 30sec，经合适循环轮数，72°C 3min。
8.根据权利要求6或7所述的筛选方法，其特征在于所述步骤(2)中，与随机序列在冰上孵育的时间控制在15min 30min，与所述Bel-7404细胞在冰上孵育的时间控制在30min 60min,所述沸水浴中的加热时间控制在IOmin 15min ;所述步骤(4)中，与琼脂糖微球在常温下孵育的时间控制在30min 45min,加入碱液后的反应时间控制在15min 20mino
9.一种如权利要求I 4中任一项所述的核酸适体或者如权利要求5所述的核酸适体衍生物在识别人肝癌细胞株Bel-7404或者制备检测人肝癌细胞株Bel-7404的试剂盒中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体，包括序列1～序列4中所示的DNA片段，还包括该核酸序列的一系列衍生物。本发明核酸适体的筛选方法包括以下步骤首先合成随机单链DNA文库和引物，然后Cell-SELEX获得人肝癌细胞株Bel-7404特异核酸适体，PCR扩增文库，制备DNA单链文库，然后经过重复筛选、阴性筛选、多轮筛选等步骤后，得到可用于检测人肝癌细胞株Bel-7404的核酸适体。本发明的核酸适体可在识别人肝癌细胞株Bel-7404或者制备检测人肝癌细胞株Bel-7404的试剂盒中应用，具有特异性强、无免疫原性、分子量小、稳定、易于保存和标记等优点。
文档编号C12N15/115GK102766633SQ20121025917
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月25日 优先权日2012年7月25日
发明者刘小丹, 王柯敏, 羊小海, 谭誉宇, 郭秋平 申请人:湖南大学