专利名称：在白喉杆菌中稳定复制的表达载体及含该载体的白喉杆菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种疫苗生产菌株领域，具体涉及ー种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体及携帯该载体的白喉杆菌。
背景技术：
白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)是引起小儿白喉的病原菌，属于棒状杆菌属(Corynebacterium),其生长周期短,繁埴速度快。白喉杆菌的致病物质主要是白喉毒素，白喉毒素以分泌型表达方式存在于胞质夕卜，且白喉杆菌其胞质外的分泌蛋白除白喉毒素外，其他杂蛋白含量极小，其对于白喉毒素的纯化十分有利，因此白喉杆菌广泛的应用于疫苗发酵生产中作为白喉毒素和白喉毒素突变体(CRM197)的生产工程菌株。而目前多采用的用于抗原发酵生产的表达体系有大肠杆菌，植物细胞等，其缺点 是杂蛋白含量较高，多为胞内或包涵体内表达，对于后期的纯化工艺有很高的时间和人力，物力成本；而分泌型的表达系统的建立多需要引导肽的引入，但往往其要求与抗原蛋白融合表达，则需要在后期エ艺中对引导肽进行切除处理，増加了エ艺的复杂度和操作的难度。至今未有报道利用白喉杆菌携帯可复制质粒用于抗原表达的研究和应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体。本发明的第二个目的是提供一种携带在白喉杆菌中稳定复制的表达载体的白喉杆菌。本发明的第三个目的是提供一种重组CRM197蛋白的表达方法。本发明的技术方案概述如下一种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体，所述载体包括由SEQ ID NO. I所示的在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列或具有与SEQ ID NO. I所示DNA序列功能相同的且相似度为90%以上的DNA序列，能表达SEQ ID NO. 2所示导肽蛋白序列的DNA序列和SEQIDN0. 3所示的CRM197重组蛋白编码基因的DNA序列。一种携带上述在白喉杆菌中稳定复制的表达载体的白喉杆菌。一种重组CRM197蛋白的表达方法，包括如下步骤a.将在白喉杆菌中稳定复制的表达载体通过结合转移的方法导入宿主白喉杆菌中；b.筛选得到携帯在白喉杆菌中稳定复制的表达载体的白喉杆菌；c.将步骤b获得的白喉杆菌进行蛋白表达和分泌，得到重组CRM197蛋白；所述在白喉杆菌中稳定复制的表达载体包括由SEQ ID NO. I所示的在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列或具有与SEQ ID NO. I所示DNA序列功能相同的且相似度为90%以上的DNA序列，能表达SEQ ID NO. 2所不导妝蛋白序列的DNA序列和SEQ ID NO. 3所不的CRM197
重组蛋白编码基因的DNA序列。所述宿主白喉杆菌优选编号为ATCC39255的白喉杆菌，ATCC43145的白喉杆菌或CMCC38007白喉杆菌。本发明的优点是白喉杆菌携帯的在白喉杆菌中稳定复制的表达载体，因其具有在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列，因而可以使得表达载体在白喉杆菌中稳定复制，同时表达载体上的能表达导妝蛋白序列的DNA序列可以使得表达的CRM197重组蛋白进行分泌表达并分泌到胞外，从而使得CRM197重组蛋白的表达量得到提高，使得表达的CRM197重组蛋白的纯化工艺进ー步简化，提高了蛋白得率，节约了生产时间和成本。
图I为ー种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体pCKM5. I酶切鉴定图谱。图2为携带pCKM5. I的白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)高效分泌表达蛋白 CRM197SDS-PAGE 图谱。图3为携带pCKM5. I的白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)发酵制备CRM197蛋白的 SDS-PAGE 图谱。(I Al 2 A2 3 A3 4 A4 5 A5 6 A6 7 A7 8 A8 9Marker)图4为携带pCKM5. 2的白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)高效分泌表达蛋白CRM197SDS-PAGE 图谱。图5为携带pCKM5. 2的白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)发酵制备CRM197蛋白的 SDS-PAGE 图谱。(I Al 2 A2 3 A3 4 A4 5 A5 6 A6 7 A7 8Marker)
具体实施例方式下面实施例中的方法若无特殊说明均为常规方法。下面各实施例所涉及的白喉杆菌均为购买所得。白喉杆菌(CMCC38007，中国医学细菌保藏管理中心，Pff8)下面结合具体实施例对本发明作进ー步的说明。实施例I在白喉杆菌中稳定复制的表达载体pCKM5. I的构建引物设计，PCR扩增目的抗原基因CRM197设计引物序列SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5，以白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)基因组DNA为模板，PCR反应程序如下(I) 95°C，3分钟；(2) 98°C，30秒，60°C，30秒，72°C，30秒，30循环；(3)72°C，2分钟。反应结束后，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化。经纯化回收的PCR产物通过T/A克隆连接于T载体pEASY-Tlsimple上，转化大肠杆菌DH5a中，挑取阳性克隆提取质粒，通过XhoI和SalI双酶切将目的抗原基因CRM197切下插入到pCKM4. I (SEQ ID NO. 6)中的SalI位点上，得到重组质粒，转化大肠杆菌DH5a，挑取阳性克隆并提取质粒，分别利用NheI，BglII和SalI进行酶切鉴定，其酶切鉴定图谱如图I所示，图I中泳道I为Markerlk plus，泳道2为经NheI酶切的重组质粒的酶切片段，泳道3为BglII和SalI双酶切的重组质粒酶切片段。对于酶切鉴定正确的重组质粒进行针对性测序，结果表明插入的目的抗原基因(CRM197重组蛋白编码基因)的核苷酸序列(SEQ IDNO. 3)经分析与原序列(參考文献1)99%吻合，其编码的氨基酸序列100%吻合。将测序包含有SEQ ID NO. 3的重组质粒命名为pCKM5. I (SEQ ID NO. 7所示)(分别从6967-9646为SEQ ID NO. I、1666-1740 (反向编码)为SEQ ID NO. 2的DNA编码序列、5-2091 (反向编码)SEQ ID NO. 3)。实施例2、pCKM5. I在白喉杆菌中表达CRM197将实施例I中获得的表达质粒PCKM5. I电转化至大肠杆菌s-17中，通过结合转移转化至白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)中，经筛选得到携帯有稳定复制表达质粒pCKM5. I的白喉杆菌菌落，接种于IOOml白喉杆菌培养基(ATCC medium: 1417Low IronYCmedium)中(含有25ug/ml的卡那霉素)，37 °C，250rpm摇床上培养待测定0D_至15-18后，离心收集上清，在每IOOml离心上清中加入45g硫酸铵，4°C沉淀，离心收集沉淀，用30mlTris-HCL pH=8. 0水溶液重悬后进行SDS-PAGE电泳分析，并以无任何质粒的白喉杆菌菌体上清作为对照。如图2所示，泳道I为protein marker I，泳道2，3为对照组野生型白喉杆菌分别在0. lg/L，lg/L游离铁离子浓度下的分泌上清，泳道4，5为携带在白喉杆菌中稳定复制的表达载体PCKM5. I的白喉杆菌菌株分别在0. lg/L，lg/L游离铁离子浓度下的分泌上清。经SDS-PAGE分析表明，CRM197重组蛋白的分子量与经氨基酸序列计算后的分子量相同，说明携帯有重组表达质粒的白喉杆菌菌株可以高效分泌表达目的CRM197重组蛋白，可用于发酵生产和后续的疫苗制备エ艺。
实验证明，将实施例I中获得的表达质粒PCKM5. I电转化至大肠杆菌s-17中，通过结合转移分别转化至ATCC43145白喉杆菌或CMCC38007白喉杆菌，也高效分泌表达出目的CRM197重组蛋白。实施例3、携带表达载体pCKM5. I的白喉杆菌进行CRM197的发酵制备和纯化将实施例I中获得的表达质粒PCKM5. I电转化至大肠杆菌s-17中，通过结合转移转化至白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)中，经筛选得到携帯有稳定复制表达质粒pCKM5. I的白喉杆菌菌落接种于200ml白喉杆菌培养基(ATCC medium: 1417Low Iron YCmedium)(含有25ug/ml的卡那霉素)中，37°C，250rpm摇床上培养待测定0D6(I(I=8. 0左右后，转接于2L的发酵罐中，条件控制下发酵培养至0D_=15左右后，再次转入50L发酵罐中，控制pH=7. 4，36°C条件下发酵至0D_=40-60左右后，停止培养收集菌液，经高速离心后，收集上清(2L和50L发酵罐中的发酵液均为白喉杆菌培养基)。将30L离心上清经过0. 22um无菌过滤后，通过30KD超滤浓缩至2L，取样保留以备电泳检测，记为Al。浓缩后使用IOL的IOmM PB缓冲液进行超滤,超滤至电导为9mS/cm,最终超滤后体积为2L，将超滤液过滤Q膜，取样保留以备电泳检测，记为A2。过滤液加入400g硫酸铵后搅拌均匀，IlOOOg离心保留上清，向上清中再继续添加450g硫酸铵，搅拌均匀后IlOOOg离心弃上清获得沉淀。加入I. 5L的IOmM PB缓冲液使沉淀复溶。复溶后溶液使用IOL的IOmM PB缓冲液进行超滤,超滤至电导为4mS/cm,取样保留以备电泳检测,记为A3。将超滤液通过0. 22um无菌过滤，取样保留以备电泳检测，记为A4。将过滤液过DEAE层析柱，先通过0. IM NaCl水溶液洗脱去掉杂质，再利用0. 5M NaCl水溶液洗脱得到目的蛋白CRM197，取样保留以备电泳检测，记为A5 ;将得到洗脱峰中的目的蛋白CRM197置换超滤至5%蔗糖水溶液中，取样保留以备电泳检测，记为A6;将超滤液通过0.22um过滤，取样保留以备电泳检测，记为A7;A7样品稀释10倍后样品记为A8;将过滤液冰冻干燥保存备用SDS-PAGE分析表明，经分离纯化后的CRM197含量百分比达到90%以上(A1-A8样品如图3中的1_8)，同时蛋白含量測定分析后表明同等发酵和纯化条件控制下，携帯表达载体PCKM5. I的白喉杆菌发酵后经分离纯化后CRM197相对于野生型白喉杆菌发酵后经分离纯化的CRM197的蛋白产量120mg/L提高到179mg/L，提高了 49. 1%。实施例4、在白喉杆菌中稳定复制的表达载体pCKM5. 2的构建将质粒pCKM5. I (SEQ ID NO. 7)序列中包含的在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列(SEQ ID NO. I)和导肽的编码核苷酸序列进行若干核苷酸突变，突变后的在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列与原序列具有90%以上的相似度，而突变后导肽的编码核苷酸序列其翻译的多肽序列不变，突变后的质粒序列为PCKM5. 2 (SEQ ID NO. 8)。实施例5、pCKM5. 2在白喉杆菌中表达CRM197将实施例4中获得的表达质粒PCKM5. 2电转化至大肠杆菌s_17中，通过结合转移转化至白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)中，经筛选得到携帯有稳定复制表达质粒pCKM5. 2的白喉杆菌菌落，接种于IOOml白喉杆菌培养基(ATCC medium: 1417Low IronYCmedium)中(含有25ug/ml的卡那霉素)，37°C，250rpm摇床上培养待测定0D_至15-18后，离心收集上清，在每IOOml离心上清中加入45g硫酸铵，4°C沉淀，离心收集沉淀，用30ml Tris-HCL pH=8. 0水溶液重悬后进行SDS-PAGE电泳分析，并以无任何质粒的白喉杆菌菌体上清作为对照。电泳图如图4所示,泳道I为protein marker I,泳道2为对照组野生型白喉杆菌分别在lg/L游离铁离子浓度下的分泌上清，泳道3为携带表达质粒pCKM5. 2的白喉杆菌菌株分别在lg/L游离铁离子浓度下的分泌上清。经SDS-PAGE分析表明，CRM197重组蛋白的分子量与经氨基酸序列计算后的分子量相同，说明携帯有重组表达质粒的白喉杆菌菌株可以高效分泌表达目的CRM197重组蛋白，可用于发酵生产和后续的疫苗制备エ艺。实验证明，将实施例4中获得的表达质粒PCKM5. 2电转化至大肠杆菌s_17中，通过结合转移转化至至ATCC43145白喉杆菌或CMCC38007白喉杆菌，也高效分泌表达出目的CRM197重组蛋白。实施例6、携带表达载体pCKM5. 2的白喉杆菌进行CRM197的发酵制备和纯化将实施例4中获得的表达质粒PCKM5. 2电转化至大肠杆菌s_17中，通过结合转移转化至白喉杆菌(ATCC39255的白喉杆菌)中，经筛选得到携帯有稳定复制表达质粒pCKM5. 2 的白喉杆菌菌落接种于 200ml 培养基(ATCC medium: 1417Low Iron YC medium)(含有25ug/ml的卡那霉素)中，37°C 250rpm摇床上培养待测定0D_=8. 0左右后，转接于2L的发酵罐中，条件控制下发酵培养至0D_=15左右后，再次转入50L发酵罐中，控制pH=7. 4，36°C条件下发酵至0D_=40-60左右后，停止培养收集菌液，经高速离心后，收集上清2L和50L发酵罐中的发酵液均为白喉杆菌培养基)。将30L离心上清经过0. 22um无菌过滤后，通过30KD超滤浓缩至2L，取样保留以备电泳检测，记为Al。浓缩后使用IOL的IOmM PB缓冲液进行超滤,超滤至电导为9mS/cm,最終超滤后体积为2L，将超滤液过滤Q膜，取样保留以备电泳检测，记为A2。过滤液加入400g硫酸铵后搅拌均勻，IlOOOg离心保留上清，向上清中再继续添加450g硫酸铵,搅拌均匀后IlOOOg离心弃上清获得沉淀。加入I. 5L的IOmM PB缓冲液使沉淀复溶。复溶后溶液使用IOL的IOmMPB缓冲液进行超滤，超滤至电导小于4mS/cm，取样保留以备电泳检测，记为A3。将超滤液通过0. 22um无菌过滤，取样保留以备电泳检测，记为A4。将过滤液过DEAE层析柱，先通过0. IM NaCl溶液洗脱去掉杂质，再利用0. 5M NaCl溶液洗脱得到目的蛋白CRM197，取样保留以备电泳检测，记为A5 ;将得到洗脱峰中的目的蛋白置换超滤至5%蔗糖溶液中，取样保留以备电泳检测，记为A6 ;将超滤液通过0. 22um过滤，取样保留以备电泳检测，记为A7。将过滤液冰冻干燥保存备用SDS-PAGE分析表明，经分离纯化后的CRM197含量百分比达到90%以上(A1-A7样品如图5中的1-7)，同时蛋白含量測定分析后表明同等发酵和纯化条件控制下，携帯表达载体PCKM5. 2的白喉杆菌发酵后经分离纯化后CRM197相对于野生型白喉杆菌发酵后经分离纯化的CRM197的蛋白产量120mg/L提高到185mg/L，提高了54. 1%。參考文献 I.The amino-acid sequence of two non-toxic mutants of diphtneriatoxin:CRM45and CRM197.Giannini G,Rappuoli R,Ratti G.Nucleic Acids Res.1984May25;12(10):4063-9。
权利要求
1.一种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体，其特征是所述载体包括由SEQ ID NO. I所示的在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列或具有与SEQ ID NO. I所示DNA序列功能相同的且相似度为90%以上的DNA序列，能表达SEQ ID NO. 2所示导肽蛋白序列的DNA序列和SEQ ID NO. 3所不的CRM197重组蛋白编码基因的DNA序列。
2.一种携带权利要求I在白喉杆菌中稳定复制的表达载体的白喉杆菌。
3.一种重组CRM197蛋白的表达方法，其特征是包括如下步骤 a.将在白喉杆菌中稳定复制的表达载体通过结合转移的方法导入宿主白喉杆菌中； b.筛选得到携带在白喉杆菌中稳定复制的表达载体的白喉杆菌； c.将步骤b获得的白喉杆菌进行蛋白表达和分泌，得到重组CRM197蛋白；所述在白喉杆菌中稳定复制的表达载体包括由SEQ ID NO. I所示的在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列或具有与SEQ ID NO. I所示DNA序列功能相同的且相似度为90%以上的DNA序列，能表达SEQ ID NO. 2所示导肽蛋白序列的DNA序列和SEQ ID NO. 3所示的CRM197重组蛋白编码基因的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是所述宿主白喉杆菌为编号为ATCC39255的白喉杆菌，ATCC 43145的白喉杆菌或CMCC 38007白喉杆菌或白喉杆菌CMCC 38007。
全文摘要
本发明公开了一种在白喉杆菌中稳定复制的表达载体及含该载体的白喉杆菌，所述载体包括在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列，能表达导肽蛋白序列的DNA序列和CRM197重组蛋白编码基因的DNA序列。白喉杆菌携带的在白喉杆菌中稳定复制的表达载体，因其具有在白喉杆菌中稳定复制的复制起点DNA序列，因而可以使得表达载体在白喉杆菌中稳定复制，同时表达载体上的能表达导肽蛋白序列的DNA序列可以使得表达的CRM197重组蛋白进行分泌表达并分泌到胞外，从而使得CRM197重组蛋白的表达量得到提高，使得表达的CRM197重组蛋白的纯化工艺进一步简化，提高了蛋白得率，节约了生产时间和成本。
文档编号C12N15/77GK102766647SQ20121025990
公开日2012年11月7日 申请日期2012年7月25日 优先权日2012年7月25日
发明者宇学锋, 朱涛, 段磊, 毛慧华, 邱东旭, 邵忠琦 申请人:天津康希诺生物技术有限公司