一种配体介导的靶向树突状细胞的Texosomes仿生体作为肿瘤疫苗的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药技术领域，是一种配体介导的靶向树突状细胞的Texosomes仿生体作为肿瘤疫苗的应用。
【背景技术】
[0002]肿瘤的形成是肿瘤抗原免疫逃逸的结果，机体的免疫耐受和免疫抑制促进了肿瘤的生长和转移。如何能启动和增强肿瘤患者自身固有的免疫应答来抑制肿瘤，减少其逃逸免疫监视的可能性，是现代肿瘤治疗的主要目标。肿瘤免疫治疗是通过调动宿主的天然防卫机制，增强宿主的免疫防御效应，降低宿主的免疫抑制，来提高机体对肿瘤细胞的免疫应答能力，从而杀伤或抑制肿瘤细胞。目前该治疗方式已成为继手术、化疗、放疗之外的第四种重要的肿瘤治疗模式，具有治愈肿瘤的潜力。机体的免疫反应首先是由抗原提呈细胞(APC)捕获抗原，经其加工处理后将抗原信息传递给T、B淋巴细胞进而诱发一系列特异性免疫应答。因此，APC是机体免疫反应的首要环节，能否进行有效的抗原提呈直接关系到免疫激活或免疫耐受的诱导，其中树突状细胞是目前所知的机体内功能最强的抗原提呈细胞。近年来，以树突状细胞(dendritic cells, DC)为基础的肿瘤免疫治疗已成为国内外研宄的热点之一，越来越多的证据表明由DC激活的细胞免疫特别是T细胞介导的CTL反应在机体抗肿瘤中起着主导作用，而且最近DC疫苗的临床1、II期试验也取得了令人鼓舞的结果，显示出DC疫苗在肿瘤等疾病的治疗中的巨大前景，因此DC疫苗尤其是DC抗肿瘤疫苗的研宄和应用倍受人们的关注。
[0003]但现有树突状细胞肿瘤疫苗存在一定不足。用已知肿瘤抗原肽、肿瘤抗原蛋白、编码肿瘤抗原RNA、肿瘤细胞裂解液、肿瘤细胞提取物、凋亡肿瘤细胞等不同形式和来源的肿瘤抗原体外负载或冲击树突状细胞而制备的肿瘤疫苗均有报道。然而目前，已知的肿瘤特异性抗原种类非常有限，有恶性黑色素瘤细胞特异表达的MAR-Tl、MAGE-3、gplOO和酪氨酸酶，前列腺癌细胞表达前列腺特异膜抗原(PSMP)，低分化非霍奇金氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤细胞表达独特型免疫球蛋白，肝癌细胞分泌的甲胎蛋白、结肠癌细胞分泌的癌胚抗原(CEA)等。应用抗原或抗原多肽在体外冲击致敏DC，然后将之回输或免疫接种至荷瘤宿主，进行肿瘤免疫治疗，该方法制备的DC疫苗只针对某个个体有效，即特异性强，不具有通用性；技术难度高，且无法大量生产和保存，临床难以大规模应用；由于该方法仅能激活树突细胞活性，而不一定会完全使T细胞对肿瘤细胞有效识别，故其临床有效率并不高。另外一个潜在危险是其长期作用有可能会诱发机体的自身免疫反应，有报道，过量的DC回输会导致T细胞耗竭而免疫功能下调，或引发自身免疫病，而且这种方式也存在的MHC(主要组织相容性复合物)限制性，使得此类树突状细胞肿瘤疫苗的应用受到严重限制。要使DC肿瘤疫苗真正成为临床上能广泛应用的肿瘤疫苗还面临着各种桃战，如制备的最优方法以及接种的最佳程序还不完全清楚，这都将影响DC肿瘤疫苗的临床应用。
[0004]利用树突状细胞来进行肿瘤治疗的制剂方法已有部分报道。曾有专利(CN1340361 A)公开了一种脂质体异体、自体肿瘤疫苗的制备方法。其主要方法是取人新鲜肿瘤组织处理成细胞混悬后，进行碎裂和灭活，经过提取和纯化过程，将特定部分的多肽、蛋白作为内容物包裹在脂质体内部进行给药，预激发DC细胞。但该方法不仅处理过程繁琐，承载内容物的脂质体进入体内后，如何靶向树突状细胞并未能解决；而且即使找到该脂质体后，DC细胞能否进行有效的免疫应答的问题也未能回答。
[0005]也有专利(CN 101690805 A)公开了一种树突状细胞靶向纳米脂质体瘤苗的制备工艺。其采用薄膜分散法来制备纳米脂质体，以从兔红细胞膜中提取的a l，3Gal糖脂修饰脂质体，靶向树突状细胞表面的Toll样受体。该专利糖脂提取工艺复杂，对制剂表面修饰的配体和树突状细胞表面受体具有很强的限制性，不具有广泛适用性。
【发明内容】
[0006]有效的肿瘤主动免疫治疗需要将目的抗原肽靶向输送到树突状细胞内，才能诱导强烈的免疫应答，这一过程必须借助载体的协助才能完成，因此，如何构建对DC具有高度靶向性的投放载体是对提高肿瘤抗原的传递效率，启动和维持配体介导的免疫应答具有十分重要的意义。将在DC表面高度受体表达的单克隆抗体连接到纳米制剂表面，能高效地将抗原加载到MHC分子上并提呈给T淋巴细胞，从而增加其对DC的靶向性，提高肿瘤疫苗的有效性。本发明针对上述现有技术中的不足，提供了一种广泛适用、制备简单、具有高效性、通用性和靶向性的树突状细胞肿瘤疫苗的构建方法。
[0007]为解决上述问题，本发明采用的技术方案是:
[0008]通过将肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽-热休克蛋白复合物包载于Texosomes仿生体内，提高了肿瘤抗原和免疫刺激因子水平，进而改善了免疫诱导能力；通过在仿生体制备中加入正电荷脂质，提高了与细胞膜表面荷负电的树突状细胞的结合能力，进而改善了摄取率；通过对仿生体表面进行配体的修饰，提高了与树突状细胞表面DEC205受体、甘露糖受体或热休克蛋白受体的靶向效率，进而达到了增强疫苗免疫原性、克服肿瘤免疫逃逸的目的。经树突状细胞对该载体进行摄取、加工和处理后，将抗原信息提呈到细胞表面，进而实现T细胞对肿瘤抗原信息的识别，激活分化为具有特异性杀伤肿瘤细胞功能的细胞毒性T淋巴细胞，从而使机体产生主动免疫，消灭肿瘤细胞，达到对肿瘤的治疗作用。
[0009]本发明还提供了一种配体介导的靶向树突状细胞的Texosomes仿生体作为肿瘤疫苗载体的构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤:
[0010](I)Texosomes 仿生体的制备。
[0011]Texosomes仿生体采用微乳-胶束层层组装法制备。W/0型微乳以质量比小于1:1的聚氧乙稀蓖麻油和磷脂为混合乳化剂，溶于乙醚中作为油相，质量浓度为Img?5mg/ml。肿瘤抗原肽或肿瘤抗原肽与热休克蛋白复合物溶于PBS中作为水相，质量浓度为50 μ g?lmg/ml，4°C?25°C，在磁力搅拌下将水相逐滴加入油相中，形成微乳，其中，水相与油相体积比小于1:5，优选比例是1:8?1:25。胶束层以二油酰基磷脂酰乙醇胺，氨基甲酰基胆固醇盐酸盐和胆固醇单琥珀酸酯作为脂质材料，至圆底烧瓶中，加入乙醚使之溶解，20°C?40°C减压成膜后，加入蒸馏水和乙醇的混合溶剂，于30°C?60°C水浴中水化后，制得胶束相。其中，水和乙醇体积比为1:1?8:1，优选比例是2:1?5:1。以上所述微乳中磷脂和胶束中二油酰基磷脂酰乙醇胺的质量比小于1:1，优选1:3?4:5。将胶束相加入到微乳相中，涡旋混合5-10min后，30°C?60°C减压蒸发除去有机溶剂，冰浴下探头超声2_10min，制得Texosomes仿生体，并于4°C密封保存。其中，胶束相与微乳相的体积比是1:15?1:3，优选1:10?1:5。
[0012](2) Texosomes仿生体表面配体的修饰。
[0013]Texosomes仿生体表面配体修饰的方法为:按步骤(I)方法形成Texosomes仿生体后，按胆固醇单琥珀酸酯(CHS):N-羟基丁二酰亚胺(NHS):碳二亚胺盐酸盐(EDC)=1:1?3:1?3的摩尔比进行投料，0°C?4°C反应12?24h后，透析除去过量的反应物NHS和EDC。取相等体积的透析内液与浓度为100-1000 μ g/ml的DEC205单克隆抗体的PBS溶液，在温度为0°C?4°C，孵化2?12小时，得到DEC205单克隆抗体修饰的Texosomes仿生体。其中，胆固醇单琥珀酸酯和DEC205单克隆抗体的质量比为50:1?5:1，得到配体介导的革巴向树突状细胞的Texosomes仿生体。
[0014]与现有技术相比，本发明的优点如下:
[0015](I)本发明以Texosomes仿