一种鸡新城疫和h9亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制品技术领域，具体设及一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭 活疫苗及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 新城疫（Newcastledisease,ND)又称亚洲鸡癌或伪鸡癌，是由新城疫病毒 (Newcastlediseasevirus,NDV)引起的禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染 病，W高热、呼吸困难、下频、神经素乱、黏膜和浆膜出血为特征。该病具有很高的发病率和 死亡率，对养鸡业危害严重，是危害养禽业的一种主要传染病，OIE将其列为A类疫病，我国 也将其划分一类动物疫病。
[0003] 禽流感病毒（AvianInfluenzavirus,AIV)隶属于正黏病毒科A型流感病毒属， 因为该病毒基因组为分节段、单股负链RNA病毒，所W很容易发生变异并不断突破其感染 宿主的种属障碍，引起新的流感流行。该病毒有多种血清亚型，其中H9N2亚型禽流感虽属 于低致病性禽流感，死亡率低，但临床上发病率高，主要临床表现为轻度呼吸道症状，食量 减少，产蛋率可从90 %降至20 %W下，甚至绝产，对商品肉鸡可导致30 %左右的死亡，且极 易与大肠杆菌混合感染，严重影响家禽的生产性能，给养禽业带来严重的经济损失。此外， 该亚型AIV可W穿越宿主障碍感染哺乳动物包括人，所W对H9亚型禽流感的防制具有重要 的公共卫生意义。
[0004] 目前，新城疫和H9亚型禽流感严重危害着养禽业的健康发展，在各种防控措施 中，疫苗免疫仍为最重要的措施。市场上已有新城疫和H9亚型禽流感的相应灭活单苗和二 联苗，但是普遍存在抗体水平低、免疫效果不稳定，对流行毒株交叉保护率不高等问题，给 免疫鸡群带来一定的风险。因此，研制一种具有广谱抗原性的鸡新城疫、H9亚型禽流感二 联灭活疫苗尤为重要。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种免疫原性 好，产生的抗体水平高，并对同源/非同源的H9亚型禽流感病毒流行株均具有较强的免疫 预防作用的鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为，一种鸡新城疫和H9亚型禽流感 二联灭活疫苗，含有灭活的鸡新城疫病毒LaSota株和H9亚型禽流感病毒SY株；H9亚型 禽流感病毒SY株，其保藏编号为CGMCCNo. 5968。
[0007] 进一步地，灭活前每0. 1毫升鸡新城疫病毒LaSota株病毒和册亚型禽流感病毒 SY株病毒液中的病毒含量均> 2Xl〇s°EIDw。
[000引本发明还提供了上述鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法，用鸡 胚繁殖鸡新城疫病毒LaSota株和H9亚型禽流感病毒SY株，分别收获相应的病毒液，分别 浓缩和灭活，然后将灭活后的病毒液混合均匀，得到混合抗原液，将所述混合抗原液乳化， 得到所述鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗。
[0009] 进一步地，该混合抗原液中灭活鸡新城疫病毒LaSota株抗原液和灭活H9亚型禽 流感病毒SY株抗原液的量相等。
[0010] 进一步地，该混合抗原液乳化的过程如下；将所述混合抗原液和灭菌的吐温-80 按照体积比96:4混合均匀，得水相溶液；将注射用白油和司本-80按照体积比94:6混合， 然后加硬脂酸侣2份，随加热随揽拌至透明为止，高压灭菌得油相溶液；将所述水相溶液和 油相溶液混合乳化均匀。
[0011] 进一步地，该水相溶液和油相溶液的体积为1:2~3。
[0012] 本发明一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗及其制备方法具有如下优 点：
[0013] 1.优选制苗毒株：本发明中鸡新城疫病毒LaSota株，购自中国兽医药品监察所。 实验证明对目前流行的NDV具有较强的交叉保护性。H9亚型禽流感病毒制苗毒株SY株，是 从陕西省某地区临床疑似禽流感病毒感染死亡鸡病料上分离到一株低致病性禽流感病毒， 具有稳定、良好的特异性和免疫原性，抗体产生时间短，效价高，免疫持续期长，对同源/非 同源的H9亚型禽流感病毒流行株均具有较强的免疫预防作用。
[0014] 2.该鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗质量稳定、安全有效、成本低，可一 针防两种疫病，减轻劳动力成本。
[0015] 3.该二联灭活疫苗中的H9亚型禽流感病毒SY株，免疫原性好，产生的抗体水平 高，免疫持续期长，并对同源/非同源的H9亚型禽流感病毒流行株均具有较强的免疫预防 作用。
[0016] 本发明中该H9亚型禽流感病毒SY株经哈尔滨兽医研究所国家禽流感研究中屯、鉴 定，为H9N2亚型禽流感病毒，命名为A/Chicken/aiaanxi/SY/97(H9N2)株，分类命名；A型 流感病毒H9N2亚型。
[0017] 保藏信息如下：
[0018] 保藏单位；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、；
[0019] 单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；
[0020] 保藏日期；2012年4月11日；
[0021] 保藏编号；CGMCCNo. 5968。
[0022] 本发明中册亚型禽流感病毒SY株具有W下特点：
[002引 1.病毒含量；将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取i(T7、i(r8、i(r93个稀释 度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0.Iml，置37°C继续解育，24小时W内死亡 的鸡胚弃去不计，在24小时~96小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚 液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集效价，当到96小时时，取出所有鸡活胚，逐个收 获鸡胚液，分别测定红细胞凝集效价，凝集价不低于1:32 (微量法）者判为感染，计算EIDg。。 每0. 1ml病毒含量应> 108'化IDg。。
[0024] 2.对鸡胚的毒力：将毒种用灭菌生理盐水作1(T4稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF 鸡胚10枚，每胚0. 1ml，置37°C解育96小时。应至少有8枚鸡胚死亡，胚体表现重度充血、 出血等病变。
[0025] 3.对维鸡的毒力：将毒种用灭菌生理盐水作10倍稀释，滴鼻接种4周龄SPF鸡10 只，每只0. 1ml，另取条件相同的SPF鸡5只，不接种作为对照，在同条件下分别饲养，观察 14日，应不出现死亡或明显异常反应。接种后第5日，采集鸡喉头和泄殖腔棉拭子，用9~ 11日龄SPF鸡胚分离病毒。试验组中应至少9只为阳性，对照鸡应全部为阴性。
[0026] 4.特异性：将毒种稀释至含105?化1〇5。/0. 1ml，与等量的抗册亚型禽流感病毒特异 性血清混合，室温中和1小时后，接种SPF鸡胚10枚，观察96小时。在24~96小时内，应 不引起特异性死亡，且至少存活8枚；取鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴性。
[0027] 5.免疫原性；将毒种接种鸡胚制备病毒液，经甲醒灭活后，按本规程油佐剂配方 制成灭活疫苗。取4周龄SPF鸡15只，其中10只各皮下或肌肉接种该灭活疫苗0.3ml，另 5只不接种，作为对照。接种后21日，分别采血，分离血清，用H9亚型禽流感抗原检测HI抗 体。免疫鸡HI抗体效价的几何平均值应不低于1:64 (微量法），对照鸡HI抗体效价的几何 平均值应不高于1:4(微量法）。
[002引 6.纯净；按《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污 染。
[0029] 7.基础种子代数；E3~E10代。
【具体实施方式】
[0030] 本发明实施例中所用的SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。 禽流感册、H7、H9阳性血清购自哈尔滨维科生物技术有限公司，新城疫（ND)、减蛋综合征 (邸巧阳性血清购自中国兽医药品监察所。
[0031] 实施例1
[0032] 本发明一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗，含有灭活的鸡新城疫病毒 LaSota株和H9亚型禽流感病毒SY株；所述H9亚型禽流感病毒SY株，其保藏编号为CGMCC No. 5968。灭活前每0. 1毫升鸡新城疫病毒LaSota株病毒和册亚型禽流感病毒SY株病 毒液中的病毒含量均> 2X108?化1〇5。。
[0033] 上述该鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法：
[0034] 1.生产用毒种制备；
[0035] 1. 1新城疫毒种繁殖与鉴定：
[0036] 1. 1. 1.毒种繁殖：将鸡新城疫病毒LaSota株毒种用灭菌生理盐水适当稀释（如 10一4或10 ―5)，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚，每胚0. 1ml。选接种后72~120小时之间死 亡，且病痕明显的鸡胚，分别收获鸡胚液（尿囊液及羊水），装于灭菌容器内。将检验无菌， 且对1 %鸡红细胞悬液凝集价在1:512