(微量法）W上的鸡胚液混合，定量分装于安肅瓶中， 冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。
[0037]1. 1. 2.病毒含量；将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10入10人1(T93个 稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0. 1ml，置36~37°C继续解育，48小时 W前死亡的鸡胚弃去不计，在48~120小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度 的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至120小时，取出所有活胚，逐个收获 鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于1:128 (微量法）者判为感染，计算EIDg。，每 0. 1ml病毒含量应> 108'化IDs。。
[003引 1. 1. 3.纯净；按《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒 污染。
[0039] 1. 1. 4.毒种保存：在-15°CW下保存，应不超过6个月。
[0040] 1. 1. 5.毒种继代：应不超过3代。
[0041] 1. 2.H9亚型禽流感毒种繁殖与鉴定
[0042] 1. 2. 1毒种繁殖；将册亚型禽流感病毒SY株毒种用生理盐水作1〇-4稀释，尿囊腔 接种10日龄SPF鸡胚，每胚0. 1ml，置37°C解育。收集接种后72~96小时死亡且病变明 显的鸡胚，收获感染鸡胚液，装于无菌容器内。将检验无菌，且对1 %鸡红细胞凝集价不低于 1:512(微量法）的鸡胚液混合，定量分装，冷冻保存。注明收获日期、毒种代次等。
[00创 1. 2. 2.病毒含量；将毒种用灭菌生理盐水作10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-93个 稀释度，各尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0. 1ml，置37°C继续解育，24小时W前 死亡的鸡胚弃去不计，在24~96小时死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚 液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集效价，至96小时，取出所有活胚，逐个收获鸡胚 液，分别测定红细胞凝集效价，凝集价不低于1:32(微量法）者判为感染，计算EIDg。。每 0. 1ml病毒含量应> 108'化IDs。。
[0044] 1. 2. 3.按《中国兽药典》附录进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。
[0045] 1. 2. 4.毒种保存：在-15°CW下保存，应不超过6个月。
[0046] 1.2. 5毒种继代：应不超过3代。
[0047] 2.制苗用毒液的制备：
[0048] 2. 1.鸡新城疫病毒LaSota株制苗用毒液的制备；
[0049] 2.1.1.接种；取生产用毒种，用灭菌生理盐水适当（i(r4~1(T5)稀释，每胚尿囊腔 内接种0. 1ml，接种后密封针孔，置36~37°C继续解育，不必翻蛋。
[0化0] 2. 1. 2.解育与观察；鸡胚接种后，每天照蛋1次，将60小时前死亡的鸡胚弃去。此 后，每4~6小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至96小时。96小时后无论死亡与否， 全部取出，气室向上直立，置于2°C~8°C冷却4~24小时。
[0051] 2. 1.3.收获；将冷却的鸡胚取出，用舰町消毒气室部化然后W无菌手术剥除气 室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜（谨防卵黄破裂），吸取胚液。对每枚鸡胚在 吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。死胚和 活胚分别收获，每若干枚鸡胚分为一组，吸取胚液放于同一灭菌的容器内，每组抽样测定红 细胞凝集价，应不低于1:160 (微量法1:128)。同时按现行《中国兽药典》进行无菌检验，应 无细菌生长。毒液在-20°C下保存备用。
[0化2] 2. 2.H9亚型禽流感病毒SY株制苗用病毒液的制备；
[0化3] 2.2. 1.接种；取生产用毒种用灭菌生理盐水作1(T4稀释，每胚尿囊腔内接种 0. 1ml，接种后密封针孔，置37°C继续解育，不必翻蛋。
[0054] 2. 2. 2.解育与观察；将接种后24小时前死亡的鸡胚弃去。24小时后，每4~8小 时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至96小时。9化后不论死亡与否，全部取出，气室向上 直立，置于2~8°C冷却4~24小时。
[0055] 2. 2. 3.收获；将冷却的鸡胚取出，用舰町消毒气室部位，然后W无菌手术剥除气 室部卵壳，揭去卵壳膜，剪破绒毛尿囊膜及羊膜（勿使卵黄破裂），吸取胚液。对每枚鸡胚在 吸取胚液前均应注意检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者，弃去不用。每若干 枚鸡胚的胚液混合为一组，装于灭菌容器内，同时每组抽样按现行《中国兽药典》进行无菌 检验，应无菌生长。毒液在-20°C下保存备用。
[0056] 3.制苗用毒液的浓缩；将收获的两种病毒液用适当方法澄清，除去病毒液中的大 颗粒杂质，使其成为透明或半透明溶液。然后，用病毒超滤浓缩系统分别将二种病毒液浓缩 至原体积的1/2。
[0化7] 4.灭活；将检验合格的各病毒浓缩液分别混合于一个灭菌大容器内，然后各加入 10%的甲醒溶液，使甲醒终浓度为0. 1 %，随加随揽拌，使其充分混匀，加入甲醒溶液后应倾 倒于另一灭菌容器中，W避免瓶颈附近粘附的病毒未能接触灭活剂。然后分别置36~37°C 灭活16小时、24小时（W瓶内温度达到36°C开始计时）。期间每4小时振摇1次。灭活后 的病毒液在2~8°C保存，应不超过1个月。
[0化引 5.半成品检验；
[0化9] 5. 1.无菌检验；取灭活的胚液，按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。
[0060] 5. 2病毒含量测定；
[0061] 5.2. 1.将灭活前的鸡新城疫病毒浓缩液抽样检测，每0. 1ml病毒含量应 > 2xi〇8'〇eid5〇。
[0062] 5. 2. 2.将灭活前的禽流感病毒浓缩液抽样检测，每0. 1ml病毒含量应 > 2xi〇8'〇eid5〇。
[0063] 5. 3.灭活检验
[0064] 5. 3. 1.取灭活后的鸡新城疫病毒浓缩液，尿囊腔内接种9~11日龄SPF鸡胚10 枚，每胚0. 2ml，37°C下继续解育，剔除24小时内死亡鸡胚，观察5日，鸡胚非特异死亡不应 超过2枚，收获所有鸡胚的胚液，然后观察鸡胚胎儿病变，应全部为阴性。将收获的鸡胚液 混合，W上述相同方法进行盲传，取传代鸡胚的胚液进行HA试验，应全部为阴性。
[0065] 5. 3. 2.取灭活后的H9亚型禽流感病毒浓缩液，尿囊腔内接种9~11日龄SPF鸡 胚10枚，每胚0. 2ml，37°C下继续解育，剔除24小时内死亡鸡胚，观察4日，鸡胚非特异性死 亡应不超过2枚，收获所有鸡胚的胚液，然后观察鸡胚胎儿病变，应全部为阴性。将收获的 鸡胚液混合，W上述相同方法进行盲传，取传代鸡胚的胚液进行HA试验，应全部为阴性。
[0066] 6.油佐剂灭活疫苗的制备：
[0067] 6.1.油相制备；取注射用白油94份，加司盘-80 6份，混合后，加硬脂酸侣2份， 硬脂酸侣指的是2% (g/V)硬脂酸侣溶液，随加热随揽拌至透明为止，高压灭菌备用。
[0068] 6. 2.水相制备；将检验合格的鸡新城疫灭活胚液和禽流感灭活胚液按1:1的比例 充分混合。取吐温-80 4份装入带玻璃珠的瓶中灭菌，冷却后加入混合的灭活病毒液96份， 充分振摇，至吐温-80完全溶解为止。
[0069] 6. 3.乳化；将2~3份油相注入乳化罐内，慢速揽拌同时缓缓加入1份水相，加完 后，中速混合，然后高速乳化。在乳化终止前加入1%硫柳隶溶液，使其终浓度为0. 01%。乳 化后，取样10mlW3000r/min离屯、15分钟，应不出现分层。
[0070] 7.分装；定量分装，加盖密封并贴标签。
[0071] 实施例2
[0072] 一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗的安全性和效力检验；
[0073] 本发明一种鸡新城疫和H9亚型禽流感二联灭活疫苗，含有灭活的鸡新城疫病毒 LaSota株和H9亚型禽流感病毒SY株；所述H9亚型禽流感病毒SY株，其保藏编号为CGMCC No. 5968。灭活前每0. 1毫升鸡新城疫病毒LaSota株病毒和册亚型禽流感病毒SY株病毒 液中的病毒含量均> 2X108?化1町。。
[0074] 本实施例中使用的疫苗是按本发明提供的技术方案制备的3批鸡新城疫和H9亚 型禽流感二联灭活疫苗，批号分别为070601，070602和070603。
[00巧]1.安全性试验；
[0076] 1. 1.对14日龄SPF鸡的安全性试验；
[0077] 1. 1. 1.单剂量接种；每批疫苗使用20只14日龄SPF鸡，通过颈部皮下和肌肉两 种途径各接种10只，每只接种疫苗0. 3ml，免后14日内连同同批对照鸡5只观察有无局部 或全身不良反应；第14天剖检所