2)延伸的条件，60°C 4min ;
[0190] 13)4°C保温；
[0191] 每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
[0192] 测序产物纯化
[0193] 10μ1反应体系，96孔板，EDTA法；
[0194] 1)每管加入1μ1 125mMEDTA到管底，室温放置15min;
[0195]2) 10°C，4000rpm离心 30min，马上倒置，1200rpm离心lmin;
[0196]3)每管加入100μ1 70 %酒精，离心15min;5°C，3600rpm离心30min，马上倒置， 1200rpm离心lmin;
[0197] 4)室温挥发净酒精，加入10μ1Hi-Di Formamide溶解DNA;
[0198] 5)95°(：变性511^11，4°(：保温41^11，加样上机 ；
[0199] 7)测序纯化：ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit;
[0200] PCR检测，包括：
[0201] 1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对 照和样本均采用复孔；
[0202] 在C0MT基因突变位点两端设计一对特异性引物；
[0203] 所述引物C0MT-F的核苷酸序列为：
[0204]5'-CCTACTGTGGCTACTCAGCTG-3'，
[0205] 所述引物C0MT-R的核苷酸序列为：
[0206] 5'-CAGTGAACGTGGTGTGAACAC-3'；
[0207] 所述引物PCR扩增出目的片段模板；
[0208] 所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条 带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/ μ1，作为检 测阴性对照用；
[0209] 2) 25μ1反应体系检测：
[0210]
[0211] 混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDxPCR系统仪器中进行程序性检 测；
[0212] 结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
[0213] 所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95°C预变性5min，94°C变性30sec， 61°C退火30sec，72°C延伸lmin，共循环35次，最后于72°C延伸lOmin。
[0214] 实施例4
[0215] 样本处理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4°C保存；
[0216]DNA提取，取200μ1抗凝血用试剂盒提取DNA，包括：
[0217] 1)加200μlBufferBL，震荡混合，于70°C孵育10分钟；
[0218] 2)加200 μ 1无水乙醇震荡混合约20秒；
[0219] 3) 12000rpm离心 1 分钟；
[0220] 4)取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟；
[0221] 5)将收集柱置一个新的收集管上，加入500μ1HBsolution，室温放置5分钟；
[0222] 6) 12000rpm离心 2 分钟；
[0223] 7)加入 700μ1washBuffer，12000rpm离心 2 分钟；
[0224] 8)将收集柱置一个新的收集管上，加入700μ1washBuffer，12000rpm离心2分 钟；
[0225] 9)弃收集管内液体，12000rpm离心2min;
[0226] 10)将收集柱放入一个新的1. 5ml离心管内，加入50μ1 70°C预热的洗脱液，室 温放置l_2min，12000rpm离心2分钟，滤液即为模板DNA;
[0227] PCR扩增
[0228]PCR反应体系：
[0229] 10XPCR Buffer 2.5μ1；
[0230] HotStarTaq DNA Polymerase按kit标准调整；
[0231]dNTPmix2μ1 ；
[0232]上游引物PrimerU1μ1 ;
[0233]下游引物PrimerL1μ1 ;
[0234] DNA模板xμ1 ;
[0235] 灭菌蒸馏水25μ1 上述总体积；
[0236] PCR产物电泳：1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；
[0237] PCR产物纯化
[0238] 每管内加入100μ1PCR-A液，混匀，转入纯化柱内，12000rpm离心2min;
[0239] 弃收集管内液体，加入700 μ1 washing buffer，12000rpm离心2min;
[0240]弃收集管内液体，加入400μ1 washing buffer，12000rpm离心2min;
[0241] 弃收集管内液体，12000rpm离心2min;
[0242] 柱内加入30μ1 70°C预热洗脱液，12000rpm离心3min;
[0243] 测序反应
[0244]反应体系：0·8μlBigDye+1.5μ1 BigDye Seq Buffer+3μ1引物+1μ1PCR纯化 产物+3.5μ1ddH20 ;
[0245] 测序PCR热循环条件：
[0246] 1)变性的条件，96°C1Osec;
[0247] 14)退火的条件，（首先 96°C10sec，其次 50°C5sec，然后 60°C4min)X25 个循 环；
[0248] 15)延伸的条件，60°C4min;
[0249] 16)4°C保温；
[0250] 每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算；
[0251] 测序产物纯化
[0252] 10μ1反应体系，96孔板，NaAc法；
[0253] 1)每管加入1μ1 3MNaAc到管底，然后震荡混勾，室温放置15min;
[0254] 2) 10°C，4000rpm离心 30min，马上倒置，1200rpm离心lmin;
[0255] 3)每管加入100μ1 70 %酒精，离心15min;5°C，3600rpm离心30min，马上倒置， 1200rpm离心lmin;
[0256] 4)室温挥发净酒精，加入10μ1Hi-DiFormamide溶解DNA;
[0257] 5) 95°C变性 5min，4°C保温 4min，加样上机；
[0258] PCR检测，包括：
[0259] 1)对照孔的设立和检测重复孔：样本检测同时设有对照实验，包括阴性对照；对 照和样本均采用复孔；
[0260] 在C0MT基因突变位点两端设计一对特异性引物；
[0261] 所述引物C0MT-F的核苷酸序列为：
[0262]5'-CCTACTGTGGCTACTCAGCTG-3'，
[0263] 所述引物C0MT-R的核苷酸序列为：
[0264] 5'-CAGTGAACGTGGTGTGAACAC-3'；
[0265] 所述引物PCR扩增出目的片段模板；
[0266] 所述目的片段的获取包括：以上述引物分别对人基因组DNA进行PCR扩增得到条 带单一的目的基因片段；将目的片段稀释至1万-10万倍，终浓度为10-20ng/μ1，作为检 测阴性对照用；
[0267] 2) 25μ1反应体系检测：
[0268]
[0270] 混合均匀；所有样本混合完后，将ABIVeritiDx PCR系统仪器中进行程序性检 测；
[0271] 结果分析及判定：对PCR产物进行测序分析。
[0272] 所述PCR的反应条件：置ABI-2700型扩增仪中95°C预变性5min，94°C变性30sec， 61°C退火30sec，72°C延伸lmin，共循环35次，最后于72°C延伸lOmin。
[0273] 优选地，PCR缓冲液中各物质的浓度分别为10-40mMTriscl，50-200mM氯化钾 (KCL)，0-5.0mM二硫苏糖醇（DTT)，0-1.0mM乙二胺四乙酸二钠钙（EDTA)，0-2.0% (V/V) 乙基苯基聚乙二醇0*)111(16〇?-40,0-2.0%(￥/^)吐温20〇^?^1120)，30-70%&八）甘 油（glycerol)，稳定剂（stabilizer) :ρΗ7· 0-10. 0(20 °C)。优选浓度为 20mMTriscl、 lOOmMKCL、lmMDTT、0.1mMEDTA、0.5% (V/V)NonidetΡ-40、0·5% (V/V)Tween20、50% glycerol(v/v)，稳定剂，终pH值为9. 0。DNA模板为用常规方法从患者抗凝全血中提取获 得的DNA。
[0274]优选地，引物是单股寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适长度取决于该引物的设计用 途，但在一般在15~25个核苷酸之间，较短的引物分子通常需要较低的温度，从而与模板 形成充分稳定的杂交复合物。引物不必反应模板的准确序列，但必须充分互补，已与模板杂 交并引发DNA合成。
[0275] 优选地，引物设计遵循原则：第一，引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异 性。第二，产物不能形成二级结构。第三，引物长度一般在15~30碱基之间。第四，G+C 含量在40%~60%之间。第五，碱基要随机分布。第六，引物自身不能有连续4个碱基的 互补。第七，引物之间不能有连续4个碱基的互补。第八，引物5'端可以修饰。第九，弓丨 物3'端不可修饰。第十，引物3'端要避开密码子的第3位。引物合成采用的方法为亚磷 酰胺三酯法，将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的 3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3' -5'磷酸二酯键连接。
[0276] 优选地，试剂盒包括：1)序列如SEQID NO:1、SEQID N0:2所示的引物；2)PCR反 应体系；3)分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。