专利名称：制备转基因哺乳动物的pamam-d介导的精子载体法的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程。
技术背景当前，制备转基因动物存在一个急待解决的重要问题，就是一般采 用的受精卵显微注射法设备昂贵，操作技术复杂，效率低，生产成本高， 人们在试图寻求一种简单、高效的转基因方法，精子载体法受到极大的关注。1971年Brackett等用同位素标记的SV40病毒DNA与家兔精子共卵 育，首次证实精子可以作为载体进行外源基因转移。18年后，Arezzo(1989 年)用吸附pSRVCAT或pSV2CAT的海星子精子与卵子受精后，外源基因 在胚胎中获得表达。同年，Lavitrano等(1989年)用小白鼠附睾精子 作为外源DNA载体，与卵子体外受精后，后代中30%是转基因小鼠。此后， 相继在多种动物上获得进展(1998年)。Lavitrano等又在2002年和2005 年分别以人衰变加速因子(hDAF)基因及3种荧光蛋白基因作为外源DNA， 培育转基因猪获得成功。以精子作为载体进行基因转移制备转基因动物 方法简便，成本低，可以达到很高的效率，对卵原核无损害，符合生理 受精过程，可与人工受精结合，可在几乎所有动物上应用，便于规模生 产，前景诱人。但是，Brinster等的大量小鼠试验却未获得阳性后代。 精子载体法由于转基因效率不稳定、不同作者可重复性差，难以得到实 际应用。精子载体法建立转基因动物首先需外源DNA与精子结合，成熟的动 物精子生理结构与功能上具有结合外源DNA并使其核内化的能力。精子 膜上存在30—35KD的外源DNA潜在结合蛋白，外源DNA与结合蛋白特异 性结合，然后进入精子细胞内。在精子生成过程中MHC-II基因的表达使 精子具有结合外源DNA能力，同时也使成熟的精子头部的CD4分子将结 合的外源DNA导入细胞核内。精子结合外源DNA的量是恒定的，部分DNA(总结合DNA的15—22%)进入精子核内。外源DNA整合到细胞染色体上 可能与拓朴异构酶有关，基质区的染色体在拓朴异构酶II的作用下整合 外源DNA.但是动物精子存在保护自身免受外源遗传物质侵入的生理屏 障，从而确保动物在长期的进化过程中维持遗传的可靠性和物种的稳定 性。精液中存在着某些影响精子膜通透性的因子，哺乳动物精液含有一 定量的核酸酶(DNase I )能降解外源DNA分子；特别是分子量为37KD 的糖基化蛋白(inhibitory factor-1， IF-1)广泛存在于精清中及无精 清的低等动物精子表面，它与外源DNA同样选择性地结合到精子的核后 区，可以直接作用于外源DNA分子，或与结合蛋白竞争性结合，使精子 表面外源DNA结合位点失去结合外源DNA的能力。外源DNA进入精子可 能引起核酸裂解酶活性增高，可将外源DNA降解，难以进入精子细胞的 核内。外源DNA可能在染色体外以附加体的形式存在。受精后受精卵内 外源DNA可能发生降解或者重排。以精子载体培育转基因动物最先采用的是直接共孵育法，对精子充 分洗涤是其关键措施。经洗涤去除精清从而清除IF-1，消除外源DNA与精 子结合的主要障碍，有利于外源DNA与精子的结合。但如上所述，该方法 外源DNA与精子结合的随机性较大，结果不稳定，可重复性差。因此，又 出现了多种试图促进外源DNA与精子结合的改进技术，主要有电穿孔法、 病毒介导法、脂质体法等。电穿孔法可以提高精子对外源DNA的携带率， 但过早引起顶体反应，使受精率明显下降。病毒载体构建方法复杂，容 纳外源DNA的大小也有限，而且获得转基因动物嵌合体比例大，特别是因 存在多种潜在危险而令人生畏。脂质体介导法利用阳离子脂质体与带负 电的DNA形成脂质体/DNA复合物，通过静电作用被细胞吸附，进而由细胞 融合或胞吞作用进入细胞，脂质体包裹DNA还可以防止胞质内核酸酶的降 解及防止DNA被稀释，从而提高外源DNA与精子的结合能力，从而相应提 高制作转基因动物的效率。但脂质体-基因体系不稳定，组织特异性较差， 过量的脂质体对精子产生毒害作用。随机性大、可重复性差的问题仍然 难以得到根本改观，外源DNA稳定地与精子结合并且不被降解整合到生殖 细胞染色体上仍未有效解决，方法有待改进。近年来 一 种新型纳米材料一聚酰胺-胺型树枝状聚合物(Polyamidoamine dendrimers， PAMAM-D)，是一类由中心向外对称发散 的而高度分枝的大分子化合物，G1 G4代为平面状，G5 G10为球形结 构，表面有大量的功能基团，能与DNA表达载体相互接触自我组装形成 PAMAM-D/DNA复合物，通过其表面所携带的正电荷阳离子与细胞膜表面带 有负电荷的糖蛋白及磷脂结合通过胞吞作用进入细胞，并介导外源基因 在多种细胞染色体中的整合与持续稳定的表达。与病毒及传统的非病毒 载体的介导作用相比，PAMAM-D具有以下明显优势①由于PAMAM-D是非 生物材料，没有免疫原性，不引起机体免疫反应；②PAMAM-D进入细胞内 数小时即可降解为C02和NH厶无遗传毒性与细胞毒性，不会导致细胞的 转化与细胞死亡；③由于其特殊的表面星状或树枝状结构及表面电荷， 具有很高的基因转移效率；④可以介导外源基因在宿主细胞染色体中的 整合，从而获得转基因的长期、稳定表达；⑤可保护转基因不受机体血 浆、组织细胞中各种补体及各种酶的破坏，从而使外源基因在进入细胞 后，能更好、更稳定地发挥作用。显然，这些特点非常有助于外源DNA 与精子的结合及其在染色体的整合。将PAMAM-D介导引入精子载体法进 行基因转移和制备转基因动物，必然会提高转基因效率，增强稳定性， 可解决可重复性差的问题。 发明内容针对现有的精子载体转基因技术存在基因转移随机性大、可重复性 差的缺点，本发明的目的在于利用PAMAM-D的结构和性能特点，建立一 种制备转基因哺乳动物的PAMAM-D介导的精子载体法，以提高基因转移 效率，增强基因转移效果的稳定性。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案一种制备转基因哺乳动物的PAMAM-D介导的精子载体法，其特征在 于它包括以下几个步骤 (一)外源DNA质粒酶切成末端为粘性的线性构型，针对不同精子和目 的基因，确定外源DNA的用量范围；在PAMAM-D合成代数G5以上 及其与外源DNA电荷比2 50: l的范围内，以不同合成代数和剂 量的PAMAM-D与外源DNA混合，形成复合物转染精子，以原位杂 交法检测，将转染率高而不损伤精子活力的复合物作为最佳组合，其外源DNA的用量与PAMAM-D代数和剂量作为最佳组合条件，制 备最佳组合的PAMAM-D/外源DNA复合物用于转染精子细胞；(二) 将采集的精子用培养液进行充分洗涤，彻底去除精清中的工F-1， 以利外源DNA与精子的结合；对洗涤后的上清液以斑点杂交法监 测IF-1，以上清液IF-1达到阴性的洗涤次数作为应洗涤的次数， 将取得的精子密度调整至107ml备用。(三) 制备转染外源DNA的精子，其方法有二，①体外法用由步骤(一) 所得PAMAM-D/外源DNA复合物与歩骤(二)取得的去除了精清的 精子共孵育，在体外制取转染外源DNA的精子；②体内法将由 步骤(一)取得的PAMAM-D/外源DNA复合物打点式注入睾丸内， 在体内形成转染外源DNA的精子；(四) 将由步骤(三)中经体外共孵育法处理的的精子，以荧光蛋白标 记用流式细胞仪进行分选，将转染外源DNA的精子筛选并提取， 以单一转染外源DNA的精子用于受精，以提高外源DNA在受精卵 中的结合率；在分选前先进行洗涤并以DNaseI消化处理，以消除 假阳性；(五) 由步骤(三)体外共孵育并经步骤(四)筛选的转染外源DNA的 精子，用人工体内授精，或经体外共孵育受精后培育受精卵进行 胚胎植入，也可以用睾丸内注入由步骤(一)形成的PAMAM-D/外 源DNA复合物，通过自然交配或者采集精液进行人工授精；由以 上方式使雌性动物受孕，产生转基因动物。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案中的各个步骤，兹结合与技术方案中各步骤相对应的具体实施例详细叙述为下实施例1:外源DNA构型与用量质粒DNA必须呈线性在染色体上整 合，进入细胞内的基因构型为环状者在与染色体整合时，破坏机率高，整合率低，而且影响其表达，因此，在与PAMAM-D形成复合物前，外源 DNA先经合理酶切，成为末端为粘性的线性构型。剂量过小影响转染效果， 但大剂量的DNA会抑制精子的运动，并且激活精子细胞的内源性核酸酶 引发降解。因而需针对拟制备转基因动物的精子种类与外源DNA大小，确定外源DNA用量。本实施例拟制备的转基因动物是猪，外源DNA是hDAF 基因重组质粒，用内切酶SacI酶切成线性，末端呈粘性末端。针对1X 107ral的精子，hDAF重组基因质粒采用2 ii g、 4 " g、 6 p g、 8 u g和10 yg用量，以备与不同合成代数和剂量PAMAM-D形成复合物，经筛选确定 其最佳用量。实施例2: PAMAM-D的合成代数和剂量的筛选PAMAM-D介导外源DNA 转移的效率因细胞种类不同而存在差异，进入细胞核的能力也可能随细 胞类型不同而有所不同。完整的PAMAM-D中只有合成代数〉G5才能有效地 介导外源DNA转移，而且在一定范围内转移率随着合成代数的增加而呈指 数增加。在复合物的形成及与精子相结合的过程中PAMAM-D分子的电荷密 度具有决定意义，随着PAMAM-D与外源DNA电荷比的递增(如>20)，低密 度、可溶性复合物的产生增多。当PAMAM-D的浓度提高时，其与DNA的电 荷比加大，将导致复合物的形成增加。转染率还与外源DNA分子的大小有 关，核苷酸分子越大，则在产生高密度复合物时所需要的PAMAM-D的浓度 越低。对不同精子细胞必须采用合适的PAMM-D的合成代数和剂量及相关 与外源DNA的用量，即最佳组合条件，才能形成高转染率复合物。最佳组 合条件由转染精子所用的PAMAM-D—般剂量筛选而得， 一般PAMAM-D合成 代数为G5以上，其与外源DNA电荷比2 50: 1。本实施例所用的PAMAM-D (核心分子为乙二胺)合成代数为G7，剂量范围以与外源DNA的电荷比10 40: 1计算，所选用的PAMAM-D以SF1液溶解，并将浓度调整至lg/L备用。 .实施例3: PAMAM-D/外源DNA复合物的制备以实施例2不同合成代数 和剂量的PAMAM-D，在PAMAM-D的浓度为lg/L的SFM溶液中，加入实施例l所备选的不同用量的外源DNA,形成系列的电荷比为2: 1、 5: 1、 10: 1、20: 1、 30: 1、 40: 1、 50: 1的PAMAM-D/外源DNA复合物用以转染精子，以原位杂交法检测，将转染率高而又不损害精子活力的作为最佳复合物， 将其外源DNA用量与PAMAM-D合成代数和剂量确定最佳组合条件。本实施 例针对lX107ml猪精子，以4u g的hDAF线状质粒与电荷比20: l的 PAMAM-D (G7)制备复合物，符合上述最佳组合条件。以最佳组合条件制 备的PAMAM-D/外源DNA复合物将用以转染精子。实施例4:对精子进行洗涤当采用体外共孵育法使外源DNA转染精子，首先是外源DNA与精子表面的结合蛋白结合。存在于精清中的IF-1 通过蛋白质一蛋白质作用阻断外源DNA与结合蛋白的结合，使精子表面 的外源DNA结合位点失去结合外源DNA的能力。为提高精子结合外源DNA 的效率，必须彻底清除IF-1，这就需要对精子进行充分的洗涤，同时又 必须保持精子的活力。将采集的猪精液以1: 10稀释于37。C的SFM/BSA 液中，室温下离心(3500rpmxlOmin)，弃上清液，重复洗涤，对洗涤后 的上清液以斑点杂交检测IF-1的含量，以上清液IF-1为阴性的次数作 为应洗涤次数，用SFM液将取得的精子密度调整至107ml备用。实施例5: PAMAM-D/外源DNA复合物转染精子PAMAM-D/外源DNA复合 物可以通过体外和体内途径转染精子，睾丸内注射通过外源DNA转染各发 育阶段的精子细胞(包括精原干细胞)，转染精子，经体内成熟后通过射 精排出体外，然后用自然交配或人工受精获得转基因动物。睾丸内注射 阳性率相对较高，而且在注射后产生转染精子的能力可较长时间保持。 体内转染的方法能避免体外操作的多诸多环节，减少操作过程中人为因 素的影响。在睾丸中转染精子，避免了精清中IF-1对转基因效率的影响。 同时转染成功的精子可在附睾内成熟，经过生理状态的调整，其活力可 能与未转染精子相同，不影响精子生存和受精能力。但是，睾丸内注射 对精子细胞的转染机会是随机的，可能不利于转基因效果的稳定性。体 外共孵育法外源DNA对精子转染的机会是均等的，而且经彻底清除精清消 除了与精子结合的障碍，有可能得到较高的基因转染率。为由不同途径 获得外源DNA对精子的高转染率，结合实际应用的需要，PAMAM-D/外源DNA 复合物转染精可采用两种途径本实施例之一为采用体外共孵育法，将 实施例3所获得的PAMAM-D/ hDAFcDNA复合物转染由实施例4所获得的经 过洗涤的猪精子；上述体内法为将实施例3所获得的PAMAM-D/hDAFcDNA复 合物打点式注入猪睾丸。实施例6:将共孵育后的精子进行分选精子与PAMAM-D/外源DNA 复合物体外共孵育使外源DNA与精子结合，但因有一定数量的精子未被 转染，以二者混合的精子使卵子受精，必然会降低外源DNA在受精卵的 结合率，加之转染外源DNA的精子在活动力等方面的改变，这种降低更会加剧。如果将共孵育后的精子加以分选，把转染外源DNA的精子筛选 并提取出来，以单一转染了外源DNA的精子进行受精，可提高受精卵结 合外源DM的效率。本实施例，以荧光蛋白标记并用流式细胞仪对实施 例5体外共孵育后精子加以分选，将转染hDAF基因的精子筛选并提取； 分选前对精子进行洗涤并以DNase I消化处理，以消除假阳性。实施例7:受精与受孕方式其方式有体外受精胚胎植入、人工体内 受精与自然交配；当PAMAM-D/外源DNA复合物转染精子采用体外共孵育 法时，经筛选的精子可以用于人工体内受精，亦可与卵子体外受精经体 外培养后进行胚胎植入；当PAMAM-D/外源DNA复合物采用睾丸内注射法 转染精子，则可采用与雌性猪自然交配或采集精液进行人工受精。发明效果采用PAMAM-D介导的精子载体法，以PAMAM-D介导、以猪精子为载 体、以hDAF基因为外源DNA，制备转染hDAF基因的猪精子。经筛选筛选， 确定针对猪精子hDAF基因的用量与PAMAM-D最佳组合条件。以最佳组合 条件制取PAMAM-D/hDAF基因复合物，将复合物与洗涤后的猪精子细胞共 孵育，对孵育后的精子以原位杂交法检测hDAF基因与猪精子细胞的结合， 并在光镜下观测精子的活力。。原位杂交法可见，猪精子细胞与hDAF基 因共孵育后可在猪精子细胞头部，特别是顶体后区见到转染的颗粒状物。 被转染精子活力无改变。对107ml猪精子转染效率最高的是以4"g的 hDAF线性质粒加入电荷比20:1的PAMAM-D (G7)，形成PAMAM-D/hDAF基 因复合物，其转染效率比未用PAMAM-D介导的提高了 70%; PAMAM-D分子 能阻止PAMAM-D/hDAFcDNA复合物中DNA的电泳迁移；对PAMAM/hDAFcDNA 复合物进行酶切消化，其中DNA分子不被限制性内切酶降解。表明以 PAMAM-D介导可以提高外源DNA对精子的转染效率，有利于外源DNA在精 子细胞核的结合，增强转基因的稳定性。
权利要求
1. 一种制备转基因哺乳动物的PAMAM-D介导的精子载体法，其特征在于它包括以下几个步骤(一)外源DNA质粒酶切成末端为粘性的线性构型，针对不同精子和目的基因，确定外源DNA的用量范围；在PAMAM-D合成代数G5以上及其与外源DNA电荷比2～50∶1的范围内，以不同合成代数和剂量的PAMAM-D与外源DNA混合，形成复合物转染精子，以原位杂交法检测，将转染率高而不损伤精子活力的复合物作为最佳组合，其外源DNA的用量与PAMAM-D代数和剂量作为最佳组合条件，制备最佳组合的PAMAM-D/外源DNA复合物用于转染精子细胞；(二)将采集的精子用培养液进行充分洗涤，彻底去除精清中的IF-1，以利外源DNA与精子的结合；对洗涤后的上清液以斑点杂交法监测IF-1，以上清液IF-1达到阴性的洗涤次数作为应洗涤的次数，将取得的精子密度调整至107/ml备用。(三)制备转染外源DNA的精子，其方法有二，①体外法用由步骤(一)所得PAMAM-D/外源DNA复合物与步骤(二)取得的去除了精清的精子共孵育，在体外制取转染外源DNA的精子；②体内法将由步骤(一)取得的PAMAM-D/外源DNA复合物打点式注入睾丸内，在体内形成转染外源DNA的精子；(四)将由步骤(三)中经体外共孵育法处理的的精子，以荧光蛋白标记用流式细胞仪进行分选，将转染外源DNA的精子筛选并提取，以单一转染外源DNA的精子用于受精，以提高外源DNA在受精卵中的结合率；在分选前先进行洗涤并以DNaseI消化处理，以消除假阳性；(五)由步骤(三)体外共孵育并经步骤(四)筛选的转染外源DNA的精子，用人工体内授精，或经体外共孵育受精后培育受精卵进行胚胎植入，也可以用睾丸内注入由步骤(一)形成的PAMAM-D/外源DNA复合物，通过自然交配或者采集精液进行人工授精；由以上方式使雌性动物受孕，产生转基因动物。
全文摘要
一种培育转基因哺乳动物的PAMAM-D介导的精子载体法，包括以下步骤外源基因酶切呈末端粘性的线性构型，针对不同精子确定其用量范围；在合成代数大于G5及其与外源DNA电荷比2～50∶1的范围内对PAMAM-D进行筛选，以外源DNA转染精子效率高又能保持精子活力的外源DNA用量与PAMAM-D代数和剂量为最佳组合条件，以此制取PAMAM-D/外源DNA复合物；在对洗涤后上清液IF-1监测下，充分洗涤采集的精子；采用共孵育法使复合物体外转染精子，经分选提取单一转染外源DNA的精子，或以睾丸内注射形成转染外源DNA的精子，经体外授精胚胎移植、体内人工授精及自然交配使雌性动物受孕，培育转基因动物。
文档编号C12N15/87GK101275148SQ20071005700
公开日2008年10月1日 申请日期2007年3月27日 优先权日2007年3月27日
发明者乔宝民, 刘春雨, 玥 张, 李胜芝, 杨惠祥, 王广有, 马腾骧 申请人:天津市泌尿外科研究所