专利名称：一种双孔酶固定化反应器的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种双孔酶固定化反应器的制备方法。
技术背景伴随着经济、社会的快速发展，人们对环境污染的危害也日益关注。环境污染的实质是 人类活动中将大量的污染物排入环境，影响其自净能力，扰乱了生态系统的功能。在引入环 境的各种化学品中，持久性有机污染物尤为引人关注。因其具有长期残留性、生物蓄 积性、半挥发性和高毒性，对环境和人类健康具有严重的危害。国内外对持久性有机污染物的降解技术进行了广泛地研究，常用的方法有生物法、化 学法。但已有的处理技术都存在一些不足。如采用单一的生物法难以对高浓度的污染物进行 快速的降解，釆用化学法往往需要一定的反应条件，其降解效率与处理成本之间存在矛盾。人们在研究中发现，酶作为一种生物催化剂，其催化作用具有高选择性、高催化活性、 反应条件温和、无环境污染等特点。随着酶工业的技术进步，酶提取的成本已大为降低，酶 技术在污染物治理领域的应用极具前景。过氧化物酶如辣根过氧化氢酶已被用于催化降解废 水中的氯酚类污染物。但游离状态的酶对热、强碱、强酸、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差、易失活，并 且反应后易混入催化产物，纯化困难，不能重复使用。为了克服这些问题，酶固定化技术应 运而生。传统的酶固定化方法大致可分为四类吸附法、交联法、包埋法、共价结合法。这 些方法在使用中各存在一些缺点。如吸附法，酶和载体之间结合力弱，酶易于脱落；交联法 需采用交联剂，只能用作其他固定化法的辅助手段；包埋法固定化酶常存在扩散限制等问题， 不宜催化大分子底物；共价结合法需要剧烈的反应，固定化酶活性损失严重。因此，开发新型固定化酶的方法显得尤为必要，其指导思想是实现在较为温和的条件 下进行酶的固定化，尽量减少或避免酶活力的损失。由于载体对固定化酶有较大影响，要制得理想的固定化酶，既要选用合理有效的固定化 方法，同时又要有良好的载体。国内外学者围绕着新型载体材料的合成、改性，已经进行了 大量的工作。已有研究表明具有大的比表面积和表面具有高浓度弱酸性硅醇基团的中孔分子 筛有望成为理想的酶固定化载体。近几年来中孔材料的研究非常活跃，在合成方面取得了长足的进展。其中表面活性剂模 板法得到了广泛地应用，已经合成了许多具有不同网络成分和孔结构的中孔材料。然而，有关中孔材料还有许多值得研究和解决的问题。由于它们通常是粒径为l一15pm的细粉，虽具 有大的表面积，但在实际应用中也具有很大的缺陷。比如，在液相反应中，不易分离、回收， 在固定化酶后通常要装填成酶柱使用。粉体载体的粒径越细，固定化酶的量越高，但水的传 质阻力也越高。本发明就是针对上述问题，提供一种双孔酶固定化反应器的制备方法。 发明内容本发明提供的技术方案是 一种双孔酶固定化反应器，以所制备的双孔硅胶整体柱为载 体，通过对该载体材料进行包覆、硅胶表面进行氨基化改性、交联、固定辣根过氧化氢酶， 制得双孔酶固定化反应器。所制得的酶固定化反应器外覆一层工程塑料，整体硅胶载体有相 互交联的骨架和贯通的大孔。硅胶骨架中有中孔。大孔骨架为0.3-15 nm，大孔孔径0.5-10 miti， 中孔孔径2-50 nm。辣根过氧化氢酶固定化于双孔硅胶整体材料内部。本发明还提供了上述硅胶整体材料的制备方法以烷氧基硅垸为硅源，以聚乙二醇为大 孔模板剂，以十六烷基三甲基溴化铵或氨水或柠檬酸为中孔模板剂，采用改进的溶胶一凝胶 方法，通过脱模、洗涤、干燥、焙烧制得硅胶整体载体。将硅胶整体载体置于热收縮管内， 加热后将硅胶整体材料紧密包覆。将包覆好的硅胶整体材料用含3-氨基丙基三乙氧基硅烷的 试剂冲洗，在硅胶表面键合上氨基。以戊二醛冲洗氨基化的硅胶载体后，以含辣根过氧化氢 酶的水溶液进行冲洗，即得所制的双孔酶固定化反应器。上述烷氧基硅烷为四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷。上述热縮管材料为聚四氟乙烯或具热縮性的其他含氟塑料。本发明的双孔酶固定化反应器具有独特的双孔结构，具有流体通透性高、酶负载量大的 特点。固定化酶不易失活，可多次使用。双孔、整体材料的应用还可以克服传统粉体材料装 填平行性差的缺点，并且更易于回收利用，双孔孔径的调控，可使催化反应同时具有很好的 选择性。
具体实施方式
为更好理解本发明的内容，下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但所举之例并不 限制本发明的保护范围。实施例l:于烧杯内，加入pH为5.0的乙酸水溶液50mL，再加入4.9g聚乙二醇，搅拌，加 入24mL四甲氧基硅烷，在0'C时搅拌10min，加入0.1g十六烷基三甲基溴化铵，继续在(TC时 搅拌30min。将所得混合物倒入数支聚四氟乙烯试管中，于40 t:水浴，达凝胶点后，陈化24h， 得湿硅胶柱。将脱模、漂洗后的硅胶柱，置于恒温箱内，70'C干燥12h,严格控制胶体失水 速度，之后于箱式电阻炉内焙烧，以l 'Cmin"的速率升温至550 。C，恒温4 h，制得双孔硅胶整体柱。将制得的双孔整体柱，置于聚四氟乙烯热縮管内，于180。C反应4 h，完成对双孔整 体柱的包覆。将包覆好的硅胶柱用体积百分比为25%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液 冲洗，以0.1mL/min的流速在8(TC下冲洗10 h,然后将两端密封，在室温下放置12 h，之后 进行真空干燥，然后分别用甲苯、乙醚冲洗，随后真空干燥IO h，至恒重，得氨基化的硅胶 柱。在4'C时，将氨基化的硅胶柱用浓度为1%的戊二醛磷酸盐缓冲溶液冲洗12 h，流速为 0.1mL/min。然后以浓度为lmg/mL的辣根过氧化氢酶的磷酸盐缓冲溶液在4"C时，以0.1mL/min 流速冲洗12h,即得所制备的双孔酶固定化反应器。实施例2:于烧杯内，加入pH为5.0的乙酸水溶液50mL，再加入4.0g聚乙二醇，搅拌， 加入30 mL四甲氧基硅烷，在Or时搅拌10 min。将所得混合物倒入数支聚四氟乙烯试管中， 于40 'C水浴，达凝胶点后，陈化24 h，得湿硅胶柱。将脱模、漂洗后的硅胶柱，浸于0.01 mol/L 的氨水中，120'C水热处理6h，然后置于恒温箱内，7(TC干燥12h，严格控制胶体失水速度， 之后于箱式电阻炉内焙烧，以1 °C min—1的速率升温至550 'C，恒温4h,制得双孔硅胶整体 柱。将制得的双孔整体柱，置于聚四氟乙烯热縮管内，于160'C反应6h，完成对双孔整体柱 的包覆。将包覆好的硅胶柱用体积百分比为20%的3-氨基丙基三乙氧基硅垸的甲苯溶液冲洗， 以0.2 mL/min的流速在80。C下冲洗10 h,然后将两端密封，在室温下放置12 h，之后进行 真空干燥，然后分别用甲苯、乙醚冲洗，随后真空干燥10h，至恒重，得氨基化的硅胶柱。 在4t:时，将氨基化的硅胶柱用浓度为2.5%的戊二醛磷酸盐缓冲溶液冲洗12 h，流速为 0.1mL/min。然后以浓度为5mg/mL的辣根过氧化氢酶的磷酸盐缓冲溶液在4'C时，以 O.lmL/min流速冲洗12 h，即得所制备的双孔酶固定化反应器。实施例3:于烧杯内，加入pH为5.0的乙酸水溶液50mL，再加入5.2g聚乙二醇，搅拌， 加入36mL四乙氧基硅烷，在0。C时搅拌10min，加入0.29g柠檬酸，继续在0"时搅拌30 min，以氨水调溶液的pH为5.0。将所得混合物倒入数支聚四氟乙烯试管中，于40。C水浴， 达凝胶点后，陈化24h，得湿硅胶柱。将脱模、漂洗后的硅胶柱，置于恒温箱内，7(TC干燥 12 h，严格控制胶体失水速度，之后于箱式电阻炉内焙烧，以1 °C min.1的速率升温至550 °C， 恒温4h,制得双孔硅胶整体柱。将制得的双孔整体柱，置于聚四氟乙烯热縮管内，于18(TC 反应4 h，完成对双孔整体柱的包覆。将包覆好的硅胶柱用体积比为15%的3-氨基丙基三乙 氧基硅烷的甲苯溶液冲洗，以O.l mL/min流速在7(TC下冲洗12 h，然后将两端密封，在室 温下放置12h，之后进行真空干燥，然后分别用甲苯、乙醚冲洗，随后真空干燥10h，至恒 重，得氨基化的硅胶柱。在4'C时，将氨基化的硅胶柱用浓度为5 %的戊二醛磷酸盐缓冲溶液 冲洗12h，流速为0.1mL/min。然后以10 mg/mL的辣根过氧化氢酶的磷酸盐缓冲溶液在4'C 时，以0.1mL/min流速冲洗10h，即得所制备的双孔酶固定化反应器。实施例4:于烧杯内，加入pH为5.0的乙酸水溶液50mL，再加入6.0g聚乙二醇，搅拌， 加入"mL四甲氧基硅烷，在0。C时搅拌10min。将所得混合物倒入数支聚四氟乙烯试管中, 于40 'C水浴，达凝胶点后，陈化24 h，得湿硅胶柱。将脱模、漂洗后的硅胶柱，浸于0.1 mol/L 的氨水中，120。C水热处理6h，然后置于恒温箱内，8(TC干燥10h，严格控制胶体失水速度， 之后于箱式电阻炉内焙烧，以1 °C min"的速率升温至550 'C，恒温4 h,制得双孔硅胶整体 柱。将制得的双孔整体柱，置于聚四氟乙烯热縮管内，于200'C反应2h，完成对双孔整体柱 的包覆。将包覆好的硅胶柱用体积百分比为25%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液冲洗， 以0.1 mL/min流速在6(TC下冲洗12 h,然后将两端密封，在室温下放置12 h，之后进行真 空干燥，然后分别用甲苯、乙醚冲洗，随后真空干燥10h，至恒重，得氨基化的硅胶柱。在 4匸时，将氨基化的硅胶柱用浓度为5.0%的戊二醛磷酸盐缓冲溶液冲洗12 h，流速为 0.1mL/min。然后以浓度为5 mg/mL的辣根过氧化氢酶的磷酸盐缓冲溶液在4'C时，以0.1 mL/min流速冲洗12h，即得所制备的双孔酶固定化反应器。
权利要求
1. 一种双孔酶固定化反应器的制备方法，其特征在于，以双孔硅胶整体柱为载体，以具有热缩性的工程塑料包覆整体载体。通过对硅胶表面的氨基化改性、交联处理、辣根过氧化氢酶固定，制得双孔酶固定化反应器。
2、 如权利要求1所述的一种双孔酶固定化反应器的制备方法，其特征在于，双孔硅胶整体柱 载体，有相互交联的骨架和贯通的大孔。硅胶骨架具有中孔。大孔骨架为0.3-15 pm，大 孔孔径0.5-10 pm，中孔孔径2-50 nm。
3、 如权利要求1所述的一种双孔酶固定化反应器的制备方法，其特征在于，包覆双孔硅胶整 体柱载体的材料为具有热收縮性能的聚四氟乙烯管或具热縮性的其他含氟塑料。
4、 如权利要求l所述的一种双孔酶固定化反应器的制备方法，其特征在于，用3-氨基丙基三 乙氧基硅烷的甲苯溶液，冲洗硅胶载体，对硅胶载体表面进行氨基化改性，流速为0.1-1.0 mL/min。反应的温度为50-100°C。
5、 如权利要求1所述的一种双孔酶固定化反应器的制备方法，其特征在于，以戊二醛为交联剂对氨基化后的硅胶载体进行处理。
6、 如权利要求1所述的一种双孔酶固定化反应器的制备方法，其特征在于，以辣根过氧化氢 酶的磷酸盐缓冲溶液对硅胶载体进行冲洗，实现辣根过氧化氢酶在双孔硅胶载体上的固定 化。流速为0.1-1.0 mL/min。反应的温度为50-100°C 。
全文摘要
本发明提供了一种双孔酶固定化反应器的制备方法。以烷氧基硅烷为硅源，以聚乙二醇为大孔模板剂，以十六烷基三甲基溴化铵或氨水或柠檬酸为中孔模板剂，采用改进的溶胶—凝胶方法，通过脱模、洗涤、干燥、焙烧制得双孔硅胶整体载体。将硅胶整体载体置于热收缩管内，加热后将硅胶整体材料紧密包覆。将包覆好的硅胶整体载体用含3-氨基丙基三乙氧基硅烷的试剂冲洗，在硅胶表面键合上氨基。以戊二醛溶液冲洗氨基化的硅胶后，以含辣根过氧化氢酶的水溶液进行冲洗，即得所制的双孔酶固定化反应器。本发明的产品可用于处理含有持久性有机污染物的废水，具有成本低、效率高、反应安全、可重复利用的优点。
文档编号C12N11/00GK101260395SQ20071005686
公开日2008年9月10日 申请日期2007年3月6日 优先权日2007年3月6日
发明者孙红文, 王淑荣, 马小东 申请人:南开大学