专利名称：病毒载体和基因治疗应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的病毒载体，它们的制备和基因治疗用途。还涉及含有所述病毒载体的药物组合物。更具体地，本发明涉及来自动物的重组腺病毒作为基因治疗载体的应用。
基因治疗在于通过向病体细胞或器官中引入一种遗传信息以纠正缺陷或异常(突变、异常表达等)。该遗传信息或在体外引入从器官中取出的细胞中，然后修饰后的细胞再返回机体中，或在体内直接引入适当组织中。在后一情形下，存在不同技术，其中各种转染技术涉及DNA与DEAE—葡聚糖的复合物(Pagano等，J.Virol.1(1967)891)、DNA与核蛋白的复合物(Kaneda等，Science243(1989)375)、DNA与脂质的复合物(Felgner等，PNAS 84(1987)7413)、脂质体的使用(Fraley等，J.Biol.Chem.255(1980)10431)等。最近，使用病毒作为转移基因的载体已显示是这些物理转染技术的有利替代技术。关于这一点，已经试验了不同病毒感染某些细胞群的能力。特别是逆转录病毒(RSV、HMS、MMS等)、HSV病毒、腺伴随病毒和腺病毒。
在这些病毒中，腺病毒具有用于基因治疗的某些令人感兴趣的特征。特别是，它具有足够大的宿主谱，能够感染休止细胞，不整合在所感染细胞的基因组中。由于这些原因，腺病毒已用于体内基因转移。实际上已制备了带有不同基因(β—gal，OTC，α—1AT，细胞因子等)的来自腺病毒的不同载体。现有技术中描述的用于人体基因治疗的所有腺病毒载体，迄今为止都是从人源的腺病毒开始制备的。因为这对这种应用似乎是最适合的。为了限制其在体内增殖并形成感染颗粒的可能性，所用腺病毒一般以某种方式修饰使其在所染细胞中无法复制。因此现有技术中描述的构建系为缺失E1(E1a和/或E1b)区及有时缺失E3区的的腺病毒，在此基础上插入所感兴趣的序列(Levrero等，Gene 101(1991)195；Gosh—Choudhury等，Gene 50(1986)161)。然而除这一阶段需要修饰外，现有技术中描述的载体还存在其它限制其基因治疗应用的缺陷，特别是与野生型腺病毒重组的危险。
本发明涉及来自动物的重组腺病毒在人体基因治疗中的应用。本发明基于证实来自动物的腺病毒能够高效地感染人细胞。本发明还基于证实来自动物的腺病毒在已测试的人细胞中不能增殖。本发明最后基于来自动物的腺病毒决不会被来自人的腺病毒反式互补这一令人惊异的发现，这完全消除了在人腺病毒存在下在体内重组并增殖，从而导致感染性颗粒形成的危险。这样，本发明的载体就特别有利，因为使用病毒作为基因治疗载体的固有危险如病原性、传播、复制、重组等，都被大大减小，甚至消除。
本发明因此提供特别适于目标DNA序列在人体中转移和/或表达的病毒载体。
本发明的第一个目的涉及含有外源DNA序列的来自动物的重组腺病毒在制备用于治疗和/或外科处理人体的药物组合物中的用途。
在本发明范围内可用的动物腺病毒可以是除人腺病毒外的各种来源之腺病毒。人腺病毒是指自然感染至人体的腺病毒，一般用HAd或Ad表示。
具体讲，本发明范围内可用的动物来源腺病毒可来自狗、牛、鼠(如Mav1，Beard等，Virology75(1990)81)、羊、猪、禽类或猴(例如SAV)。
更具体讲，禽类腺病毒中可列举出可在ATCC得到的血清型1—10，例如毒株Phelps(ATCC VR—432)、Fontes(ATCC VR—280)、P7—A(ATCC VR—827)、IBH—2A(ATCC VR—828)、J2—A(ATCC VR—829)、T8—A(ATCC VR—830)、K—11(ATCCVR—921)或编号为ATCC VR—831至835的毒株。在牛腺病毒中，可使用不同的已知血清型，特别是可在ATCC以编号ATCCVR—313、314、639—642、768和769得到的那些(1—8型)。还可举出鼠腺病毒FL(ATCC VR—550)和E20308(ATCC VR—528)，5型(ATCC VR—1343)或6型(ATCC VR—1340)羊腺病毒；猪腺病毒(5359)，或猴腺病毒，特别是如ATCC编号为VR—591—594、941—943、195—203等的腺病毒。
在本发明范围内优选使用来自狗的腺病毒，特别是所有CAV2腺病毒株〔例如Manhattan株或A26/61(ATCC VR—800)〕。狗腺病毒已作为许多结构研究的对象。例如，现有技术中已描述了腺病毒CAV1和CAV2的完全限制图谱(Spibey等，J.GenVriol.70(1989)165)，已对E1a、E3基因以及ITR序列进行了克隆和测序(特别见Spibey等，Virus Res.14(1989)241；Linne，Virus Res.23(1992)119，WO 91/11525)。另外，狗腺病毒已被用于制备免疫狗抗狂犬病、细小病毒等的疫苗(WO 91/11525)。但迄今为止，这些现有技术中从未提出使用这些腺病毒进行人体中基因治疗的可能性。而且从未测试过这种应用的益处。
本发明范围内使用的腺病毒应优选缺陷型，即在被给予的生物体中不能自主增殖。如上文所述，申请人已证明这些源自动物的腺病毒能够感染人细胞，但不能在其中增殖。在此意义上讲，它们在人体中是天然缺陷的，并且与使用人腺病毒不同，不需要为此进行遗传改造。虽然如此，这些腺病毒的缺陷特征还可以通过基因组的遗传改造而扩大，特别是所述病毒在细胞中复制所需序列的改造。这些区域或被消除(全部或部分)，或使得非功能化，或通过插入别的序列，特别是外源DNA序列来改造。
根据腺病毒的来源，复制所需序列可有些不同。然而它们一般位于靠近基因组末端的位置。例如对于CAV—2，已鉴定、克隆并测序了E1a区(Spibey等，Virus Res.14(1989)241)。它位于腺病毒基因组左端的2kb片段上。
另外，还可以在这些腺病毒上进行别的遗传改造，特别是为了避免产生在人体中不利的病毒蛋白，为了能够插入大片段外源DNA序列，和/或为了插入由另一动物或人腺病毒基因组决定的区域(例如E3基因)。
在本发明的意义上，“外源DNA序列”指引入病毒并希望其在人体中转移和/或表达的所有DNA序列。
具体讲，外源DNA序列可包括一种或多种治疗基因和/或编码治疗多肽的一种或多种基因。
在一个具体实施方案中，本发明更具体涉及来自动物的腺病毒用于制备旨在转移治疗基因至人体的药物组合物。可被如此转移的治疗基因是在靶细胞中转录及有时翻译后产生具有治疗效果的产物的所有基因。
这特别涉及具有治疗效果的蛋白产物的编码基因。这样编码的蛋白产物可为蛋白质、肽、氨基酸等。该蛋白产物可与靶细胞同源(即在不产生任何疾病的情况下在靶细胞中正常表达的产物)。在此情况下，某一蛋白的表达例如可以减缓由某一变化引起的在细胞中表达不足或表达的蛋白无活性或活性弱，也可以使所述蛋白过量表达。治疗基因还可以编码某一细胞蛋白的稳定性提高、活性改进等的突变体。这种蛋白产物也可以是对靶细胞异源的。此时，所表达的蛋白例如可补充或提供在细胞中不足的某一活性，以此来防治某种疾病。
本发明意义上的治疗产物中，特别可列举酶、血衍生物、激素、淋巴因子白细胞介素、干扰素等(FR9203120)，生长因子、神经递质或它们的前体或合成酶，营养因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5等；原脂蛋白ApoAI、ApoAIV、ApoE等(FR9305125)、营养不良蛋白或小营养不良蛋白(FR9111947)，肿瘤的基因抑制剂P53、Rb、Rap1A、DCC、k—rev等(FR9304745)，凝集相关因子VII、VIII、IX因子等的编码基因。
治疗基因还可以是反义基因或序列，其在靶细胞中的表达可以控制细胞基因表达或细胞mRNA的转录。例如按照专利EP140308中描述的技术，这样的序列可在靶细胞中转录成细胞mRNA的互补RNA，并因此阻断它们翻译成蛋白质。
如上所述，外源DNA序列还可以包括一种或多种编码能够在人体中产生免疫反应的抗原性肽的基因。在此具体实施方案中，本发明可制成使人体对特别是微生物或病毒有免疫性的疫苗。这特别涉及对EB病毒、乙型肝炎毒(EP185573)、伪狂犬病毒、或对肿瘤特异(EP259212)的特异性抗原性肽。
一般，外源DNA序列还包括使得治疗基因和/或编码抗原性肽的基因在所染细胞中表达的序列。这涉及那些在所染细胞中易于发挥作用的天然负责目标基因表达的序列。还涉及不同来源的序列(负责其它蛋白质的表达，或合成的等同物)。特别是涉及真核细胞或病毒基因的启动序列，例如涉及来自欲感染细胞基因组的启动序列。同样涉及来自包括所用腺病毒在内的病毒基因组的启动序列。关于这一点，例如可举出E1A、MLP、CMV、RSV等基因的启动子。另外，这些表达序列可通过加入活化序列、调节序列等来修饰。另外，当所插入基因不合表达序列时，可在缺陷性病毒基因组中在该序列的下游插入这样的序列。
另外，外源DNA序列，具体在治疗基因的上游还含有引导合成的治疗产物至靶细胞的分泌道中的信号序列。这种信号序列可为治疗产物的天然信号序列，但还涉及所有其它有功能的信号序列，或人工信号序列。
本发明的缺陷腺病毒可用本领域技术人员已知的所有技术来制备。特别是可按专利申请WO 91/11525中描述的方法来制备。经典的制备技术是基于动物腺病毒与带有想插入的外源DNA序列等的质粒间的同源重组。在所述腺病毒和质粒共转染到一种适当细胞系中后发生这种同源重组。所用细胞系应优选能被所述腺病毒和质粒转化的，在使用源自动物的改造的腺病毒时，需要时该细胞系可含有能够补充腺病毒基因组缺陷部分的序列，该序列优选是整合形式以避免重组的危险。对于细胞系，例如可举出猎兔狗的肾细胞系GHK(Flow实验室)或MDCK细胞系。在文献也描述了细胞的培养条件及制备病毒或病毒DNA的条件(特别见Macatney等，Science 44(1988)9；Fowlkes等，J.Mol.Biol.132(1979)163)。
然后回收增殖后的载体并按标准分子生物学技术纯化。
本发明的另一目的在于含有外源DNA序列的源自动物的重组腺病毒，其中外源DNA序列包括至少一种如上所定义的治疗基因。
本发明还涉及含有一种如前所述的源自动物的重组腺病毒的所有药物组合物。可配制本发明的药物组合物，以通过局部、口服、非胃肠道、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼内、经皮等途径给药。
优选地，在本发明药物组合物中含有针剂配方的药用载体。特别是消毒、等渗的盐水溶液(磷酸一钠、磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或这些盐的混合物)，或干组合物，特别是冻干品，它通过加入无菌水或生理血清能形成注射溶液。
注射所用病毒的剂量可与不同参数相适应，特别是所用给药方法、有关的疾病、要表达的基因、还有要求的治疗时间。一般地，本发明的重组腺病毒被配制成剂量为104—1014pfu/ml，优选106—1010pfu/ml，并以此形式给药。pfu(空斑形成单位)相当于病毒溶液的感染能力，通过感染适当的细胞培养物，一般5天后测量被感染细胞的空斑数目。病毒溶液滴度pfu的测定技术在文献中有充分的说明。
根据所插入的外源DNA序列，本发明的腺病毒可用于治疗或预防许多疾病，包括遗传病(营养障碍、囊性纤维变性等)、神经退化性(neurogegenerative)疾病(早老性痴呆、帕金森氏病、ALS等)、癌症、凝集失调或脂蛋白障碍引起的疾病、由病毒感染引起的疾病(肝炎、AIDS等)等。
借助以下实施例将更完全地描述本发明，这些实施例是示范性的而不是限制性的。
图1腺病毒CAV2 Manhattan株的限制性酶切图谱(根据前述Spibey等的文章)。
图2质粒p1，p2(图2a)和p3(图2b)的描绘。
图3含有外源DNA序列的重组狗腺病毒的构建策略。
分子生物学的一般技术用于分子生物学中的常规方法如质粒DNA的制备性提取、质粒DNA的氯化铯梯度离心、琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、电洗脱纯化DNA片段、苯酚或苯酚—氯仿提取蛋白质、在含盐介质中用乙醇或异丙醇沉淀DNA、在大肠杆菌中的转化等都是本领域技术人员所熟知的，并在文献中有充分的描述〔Maniatis T.等，“Molecular Cloning，a Laboratory Manual”，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1982；AusubelF.M.等(eds)，“Current Protocols in Molecular Biology”，JohnWiley&Sons，New York，1987〕。
pBR322，p UC型质粒和M13系噬菌体是从市场上购得的(Bethesda Research Laborataries)。
关于连结，先将DNA片段用琼脂糖或丙烯酰胺电泳按其大小分离，用苯酚或苯酚/氯仿混合物提取，用乙醇沉淀，然后按照供应商的推荐方法在噬菌体T4的DNA连结酶(Biolabs)存在下孵育。
按照供应商的说明，用大肠杆菌的DNA聚合酶I的Klenow片段(Biolabs)对凸起的5’末端补平。按照制造商的推荐方法，在噬菌体T4的DNA聚合酶(Biolabs)存在下对凸起的3’末端进行破坏。凸起的5’末端经核酸酶S1仔细处理进行破坏。
利用合成的寡聚脱氧核苷酸的体外定向突变是用Amersham提供的试剂盒按Taylor等开发的方法〔Nucleic Acids Res.13(1985)8749—8764〕来进行的。
和所谓的PCR技术对DNA片段的酶法扩增〔PolymeraseCatalyzed Chain Reaction，Saiki R.K.等，Science 230(1985)1350—1354；Mullis K.B和Faloona F.A，Meth.Enzym.155(1987)335—350〕可用“DNA thermal cycler”(Perkin ElmerCetus)按制造商的说明进行。
用Amersham销售的检测盒根据Sanger等研制的方法验证核苷酸序列。实施例E1.用来自狗的腺病毒感染人细胞该实施例证明来自动物(狗)的腺病毒感染人细胞的能力。
E1.1所用的细胞系在该实施例中，使用了下列细胞系—人胚胎肾细胞系293(Graham等，J.Gen.Virol.36(1977)59)。该细胞系特别含有整合在其基因组中的人腺病毒Ad5基因组的左侧部分(12％)。
—人KB细胞系来自人表皮癌，该细胞系及其培养条件可在ATCC得到(CCL17)。
—人Hela细胞系来自人上皮癌，该细胞系以及其培养条件可在ATCC得到(CCL2)。
—狗MDCK细胞系MDCK细胞的培养条件特别由Macatney等作了描述，Science 44(1988)9。
E1.2.感染用CAV2病毒(Manhattan株)感染了以上提到的细胞系的细胞。为此，约107/发酵单位(boite)细胞在10pfu/细胞的病毒存在下37℃孵育1小时。然后加入5ml培养基，在37℃继续培养约48小时。此时，分析了被感染的细胞中附加体形式的DNA所得结果显示所有这些细胞系在其细胞核中都存在CAV2的DNA，这证明了它们被狗腺病的可感染性。
E2.狗腺病毒在人细胞中无法增殖该实施例证明狗腺病毒尽管能够感染人细胞，但不能在此细胞中增殖。
按照实施例1感染细胞后，按下述实验方法测定了随着时间的延长CAV2 DNA的量按Hirt等描述的技术(J.Virol.45(1983)91)回收细胞中附加体形式的DNA，通过与一系列标准品比较测定DNA的量。所得结果显示病毒DNA的量在KB和293细胞中不增加，证明CAV2在这些细胞中完全不复制。在MDCK和Hela细胞中，观察到CAV2病毒DNA的量有轻微增加。但病毒颗粒形成的测定中显示CAV2在293、KB和Hela人细胞中都不发生增殖，而仅发生在MDCK细胞系中。通过收集感染细胞、凝固融化释放可能存在的病毒、按以上描述的条件用所得上清液感染MDCK细胞，来测定病毒的增殖。培养48小时后，这样感染后的MDCK细胞中不存在病毒DNA，说明在人细胞中不发生任何病毒增殖。
这些结果清楚地表明狗腺病毒在人细胞中不能增殖。
E3.证明狗腺病毒不会被人腺病毒反式互补本实施例表明狗腺病毒不在人细胞中增殖，不被人腺病毒的存在反式互补。
用腺病毒CAV2和人腺病毒Ad5共感染人细胞系293、KB和Hela以及狗细胞系MDCK。按实施例E1中的方法证实细胞中(狗或人)病毒DNA的存在，并如同测定增殖那样测定了随着时间的延长DNA的量。所得结果表明CAV2的DNA量在KB和293细胞中不随着时间延长而增加，这说明人腺病毒Ad5的存在并不会通过反式互补而诱导CAV2在这些细胞中复制。用来自KB、293和Hela细胞的可能病毒感染的MDCK细胞中不存在病毒DNA，同样说明即使在人腺病毒存在下，腺病毒CAV2在人细胞系中也不增殖。
E4.CAV2的基因组DNA文库的构建从腺病毒CAV2的基因组限制性片段构建了一个质粒文库。用SmaI和PstI酶消化CAV2并将SmaIA，B，C，D，E，F，I和J片段及PstIA，B，C，D，E，F，G，H片段(图1)克隆在载体pGem3Zf+(Promega)中得到该文库。带有SmaI C片段的此质粒与带有新霉素抗性基因的质粒pUC4KIXX(Pharmacia)共转染到MDCK细胞中，以建立组成性地表达CAV2的E1A和E1B基因的MDCK细胞系。该细胞系使得可以构建这些区域缺失的重组病毒(参见E5.2)。
E5.构建带有Ad2 MLP启动子控制下的白介素—2基因的重组狗腺病毒设计了两种策略来构建带有人Ad2 MLP启动子控制下的白介素—2基因的重组狗腺病毒。
E5.1第一种策略是在E4区和整个CAV2基因组右侧的ITR之间、在SmaI限制位点插入目标外源DNA序列(MLP启动子—白介素—2基因)。这种重组体的构建或用连接方法进行，或通过带有目标外源DNA序列的质粒和CAV2基因组之间体内重组来进行。用于获得带有MLP启动子控制下的白介素—2基因的重组腺病毒的质粒按以下方法构建(图2)—通过将特别带有右侧ITR、一个SmaI位点和E4基因的CAV SalIB片段(图1)克隆到质粒pGem 3Zf+(Promega)中，获得第一个称为p1的质粒，在p1上有一个单一的SmaI位点；—将外源DNA序列(MLP启动子—白介素—2基因)从p1质粒的SmaI位点引入p1中，从而产生质粒p2；及—然后将基因组文库的PstID片段中含有的带有部分E3基因的PstI—SalI片段克隆到p2中的相应位点，产生质粒p3(图2)。
这样得到的质粒用于按如下两种方法(见图3)制备重组腺病毒a)用SalI消化的质粒p2与CAV2的SalIA片段体外连接，连接产物转染到MDCK细胞中(图3a)，b)共转染到MDCK细胞中后，p3质粒与CAV2的SalI片段之间重组。然后按本领域技术人员已知的技术分离并扩增所得重组腺病毒。
这些操作能够构建带有白介素—2的重组狗腺病毒，该腺病毒可用于将此治疗基因转移到人体中(图3)。
E5.2设计的第二种策略是基于组成性表达CAV2 E1A和E1B基因的MDCK细胞系(参见实例E4)的使用。此细胞系使得能实现缺失这些区域的狗腺病毒的反式互补，以及构建其中用外源DNA取代E1区的重组病毒。为此，构建了含有CAV2基因组左末端(ITR序列和包衣序列)和外源DNA序列的质粒。在缺失其自身左末端的CAV2腺病毒基因组的存在下，将此质粒共转染到如上所述的MDCK细胞中。为了将其用于人体，将产生的重组狗腺病毒回收、需要时扩增并保存。
权利要求
1.含有外源DNA序列、源自动物的重组腺病毒在制备用于治疗和/或外科处理人体的药物组合物中的用途。
2.权利要求1的用途，用于制备转移治疗基因至人体中的药物组合物。
3.权利要求1的用途，用于制备疫苗。
4.权利要求2的用途，其特征在于治疗基因是编码治疗蛋白产物的基因。
5.权利要求2的用途，其特征在于治疗基因是反义基因或序列。
6.权利要求1—5之一的用途，其特征在于腺病毒选自狗、牛、鼠、羊、猪、禽类和猴的腺病毒。
7.权利要求6的用途，其特征在于腺病毒为狗腺病毒，优选选自CAV—2腺病毒株。
8.权利要求1—7之一的用途，其特征在于腺病毒基因组没有复制所需序列。
9.权利要求8的用途，其特征在于腺病毒基因组没有E1A和E1B区。
10.含有至少一种插入的治疗基因的动物来源重组腺病毒。
11.权利要求10的腺病毒，其特征在于治疗基因如权利要求4和5中所定义。
12.权利要求10的腺病毒，其特征在于它还含有使得插入的治疗基因表达的启动序列。
13.权利要求10—12之一的腺病毒，其特征在于它还含有诱导治疗基因表达产物分泌的信号序列。
14.权利要求10—13之一的腺病毒，其特征在于腺病毒选自狗、牛、鼠、羊、猪、禽类和猴的腺病毒。
15.权利要求14的腺病毒，其特征在于腺病毒为狗腺病毒，优选选自腺病毒CAV—2株。
16.权利要求10—15之一的腺病毒，其特征在于其基因组至少缺少复制所需序列。
17.权利要求16的腺病毒，其特征在于它含有另一动物腺病毒或人腺病毒的区域。
18.含有一种或多种按照权利要求10—17之一的腺病毒的药物组合物。
全文摘要
本发明在于含有外源DNA序列的动物来源重组腺病毒在制备用于治疗和/或外科处理人体的药物组合物中的用途。
文档编号A61K35/76GK1124040SQ94192150
公开日1996年6月5日 申请日期1994年5月6日 优先权日1993年5月18日
发明者H·哈达德, B·科隆欧思基, M·伯里考迪特, E·威格尼 申请人:罗纳-布朗克罗莱尔股份有限公司