CR5的细胞中。编辑CCR5基因能够实现CCR5基因表达的上 调、下调、或者丧失，优选下调和丧失。所述细胞可以来源于灵长类动物，优选来源于人。该 方法可以在体内或体外实施。
[0036] 在第六方面中，本发明提供了第四方面所述的CRISPR_Cas9系统在制备用于预防 和/或治疗HIV感染的药物中的应用。
[0037] 需要说明的是，本发明提供的各个sgRNA可以联合使用，可以是任意两种或多种 sgRNA的联合使用，通过联合使用，CRISPR-Cas9系统可以靶向多个位点，从而能够更有效 地敲除CCR5基因。
[0038] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术 手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0039] 在以下实施例中，涉及的寡核苷酸序列委托金斯瑞生物科技有限公司合成得到。
[0040] 实施例1
[0041] 本实施例用来说明本发明的sgRNA的设计。
[0042] 根据5'-识别序列-招募Cas9蛋白的序列-3'和下表1所示的碱基序列构建120 个 sgRNA。
[0043] 表 1
[0044]
[0045] 实施例2
[0046] 本实施例用来说明本发明的CRISPR_Cas9系统的构建。
[0047] (1)在SgRNA对应的DNA序列（如实施例1所示）的5'末端加上CACC得到正向 寡核苷酸（Forward oligo)，根据此sgRNA，获得其互补链，并且在其5'末端加上AAAC得到 反向寡核苷酸（Reverse oligo)。分别合成。如果SgRNA识别序列对应的DNA序列5'末端 第一个碱基不为G，则需要在CACC之后加入一个G，相应的在反向寡核苷酸的3'末端加入 一个匹配的C。将上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸成对变性、退火，退火后形成可以连入 U6真核表达载体中的双链SgRNA寡聚核苷酸，变性、退火的体系为：
[0048] !μ! Forward oligo ( 100μΜ ) 1 μ] Reverse oligo ( 100μΜ ) ΙμL 1〇χΤ4 Ligation BuiVcr (NEB) (SlSiUl DNasc/RNasc-P>cc Water 0,5μ1 Τ4ΡΝΚ. (NEB M0201S)
[0049] PCR的条件为：37°C 30min ;95°C 5min ;然后以5°C /min的速率缓慢降温至25°C ; 置于4°C下保存待用。
[0050] (2)对质粒进行BsmBI酶切和去磷酸化，反应体系如下：
[0051] 5pg 质粒（参见随附的重组质粒的序列设计） 3μΙ FastDIgcst BsmBl ( Fcnncnlas ) 3μ1 FaslAP ( Fcrrncntas ) 6μΙ IO^FaslDigcst BuiTcr 0.6μ1 IOOmMDTT (新鲜配制的) 添加 ddH_:0 个.60μ1
[0052] 37 °C孵育1小时，产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒（TIANGEN， DP080822)切胶回收酶切产物。
[0053] (3)退火后的双链SgRNA寡聚核苷酸具有BsmBI的粘性末端，将其与被BsmBI酶切 过的质粒进行连接反应，连接反应的体系为：
[0054] ΧμL 酶切后的质粒（50ng) ΙμL 按1:200稀释的退火后的双链sgRNA寡聚核苷酸 5μ1 2xQuick Ligasc BuiTcr (NEB) jJII 人 DNasc/RNase-Free Water 卞.10μ1. ΙμΙ Quick Ligasc (NEB M2200S )
[0055] 16 °C孵育1小时。
[0056] (4)将上述连接产物转化到Stbl3感受态细胞（购自博迈德生物技术有限公司） 中，涂Amp+(100 μ g/ml)，挑取单克隆。
[0057] (5)通过PCR鉴定获得阳性克隆，使用的引物如下：
[0058] Fl ：TCATATGCTTACCGTAACTTGAAAG(SEQ ID NO:35)
[0059] Rl ：CCAATTCCCACTCCTTTCAAG(SEQ ID NO:36)
[0060] 反应体系为：缓冲液，2. 5ul ;dNTP，2. 5ul ;ExTaq(TaKaRa)，0. 15ul ;稀释菌液， Iul ;引物 F1/R1，0. 3ul ;ddH20，18. 25ul。
[0061] PCR 的条件为：37°C 30min ;94°C 5min ; (94°C 30s ;68°C 30s ;72°C 45s)22 个循环； 72°C 8min ;置于4°C下保存待用。
[0062] 测序验证质粒序列的正确性。
[0063] (6)37°C摇床过夜培养阳性克隆，并用质粒小提试剂盒（TIANGE，DP106-02)抽提 质粒，获得表达sgRNA的重组质粒U6-hCCR5sgRNA-EFla-Ne〇-WPRE (见图1，其中一种的序列 如SEQ ID NO: 37所示，将SEQ ID NO: 37的第2857-2973位替换不同的sgRNA编码序列可 以获得表达实施例1中各个sgRNA的重组质粒）、表达StCas9的重组质粒U6-EFla-NLS-st Cas9-2A-Puro-WPRE(见图2，其中一种的序列如SEQIDN0:38所示，将SEQIDN0:38的第 3815-8107位替换不同的Cas9编码序列可以获得表达不同Cas9的重组质粒）以及共同表 达 StCas9 和 sgRNA 的重组质粒 U6-hCCR5sgRNA-EFla-NLS-StCas9-NLS-2A-Pur〇-WPRE (见 图3,其中一种的序列如SEQ ID NO: 39所示，将SEQ ID NO: 39的第2857-2973位替换不同 的sgRNA编码序列且第4172-8464位替换不同的Cas9编码序列可以获得表达实施例1中 的各个sgRNA和不同Cas9的重组质粒）。
[0064] 实施例3
[0065] 本实施例用来说明使用本发明的CRISPR_Cas9系统编辑CCR5基因的方法。
[0066](一）细胞培养和转染
[0067] (1)将HEK293T细胞（CBR-130005,购自上海赛齐生物工程有限公司）在DMEM高 糖培养基（含有10%的？1^、青霉素化611；[0;[11;[11，1001]/1111)和链霉素（81:代。1:〇1115^;[11， 100μg/ml))中进行培养；
[0068] (2)转染前分至六孔板中，细胞密度达70 %时进行转染；
[0069] (3)按照 Lipofectamine 3000 (Invitrogen，11668-019)用量比例，使用 3 μ g 的 U 6-hCCR5sgRNA-EFla-NLS-StCas9-NLS-2A-Pur〇-WPRE、或者 L 5 μ g 的 U6-hCCR5sgRNA-EFla -Neo-WPRE 和 L 5 μ g 的 U6-EFla-NLS-StCas9-NLS-2A-Pur〇-WPRE 组合转染每孔细胞，8h 后 换液，相应的，加入噪呤霉素（Puromycin)和G418(Geneticin)进行药筛，48h后收取细胞。
[0070] (二）TA克隆测序检测：
[0071] ⑴将收集的细胞在裂解液（10 μΜ Tris-HCl，0. 4M NaCl，2 μΜ EDTA，1% SDS)中， 用100 μ g/ml蛋白酶K裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到100 μ 1去离子水中；
[0072] (2)使用引物F2/R2进行PCR扩增，使用试剂盒（TIANGEN，DP080822)纯化PCR回 收产物，其中，F2 :TCAATGTGAAGCAAATCGCAGCC(SEQ ID N0:40)，R2 :GATGGTGAAGATAAGCCTCA CAG(SEQ ID NO:41)；
[0073] (3)将获得的PCR回收产物用rTaq进行加 A反应，体系为：
[0074] 80()ng PCR回收产物 5μ1 IOxBuiTcr ( ^ Mg2-) 3μ? Mg" 4μ1 dNTP 0.5μ! rTaq (TAKARA) 加入 CidH2O 到 50μΙ
[0075] 37°C温浴30min，取1 μ 1产物与pMD19-T载体（TAKARA，3271)连接（连接方式参 见PMD19-T载体的说明书）并转化ToplO感受态细胞（购自博迈德生物技术有限公司）。
[0076] (4)挑取单克隆进行测序，根据测序结果发现：祀基因 CCR5在sgRNA靶向的序列 处出现了缺失和插入（indel)，导致CCR5发生移码突变，基因敲除成功。其中，针对识别序 列对应的DNA序列为SEQ ID NO:22且招募Cas9蛋白的序列为SEQ ID NO:33的sgRNA处 理后的单克隆的测序结果如图4所示（其中，箭头表示Csa9切割位点，浅色部分为对HIV 天然免疫的人群中基因序列的缺失片段；随机挑选50个克隆，一共检测到9个克隆携带引 起移码或者提前终止的突变，突变率为9/50 = 18% )。
[0077] 从以上实施例可以看出，本发明的CRISPR_Cas9系统能够实现人CCR5基因的敲 除，且敲除效率也较高。
【主权项】
1. 一种CRISPR-Cas9系统识别的靶序列，其特征在于，所述靶序列如SEQIDNO: 1-30 中任意一个的第n-30位所示且η= 1-12。2. -种sgRNA，该sgRNA的序列为：5' -识别序列-招募Cas9蛋白的序列-3'，其特征 在于，所述识别序列对应的DNA序列如SEQIDNO: 1-30中任意一个的第n-30位所示且η =1-12〇3. 根据权利要求2所述的sgRNA，其中，招募Cas9蛋白的序列如SEQIDΝ0:31-34所 不。4. 根据权利要求2或3所述的sgRNA，其中，所述识别序列对应的DNA序列如SEQID NO:22所示且招募Cas9蛋白的序列如SEQIDNO:33所示。5. 编码权利要求2、3或4所述的sgRNA的DNA分子。6. -种CRISPR-Cas9系统，其特征在于，该CRISPR-Cas9系统包括： Cas9蛋白和sgRNA，和/或 携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体，所述Cas9蛋白的编码序列 和sgRNA的编码序列位于相同或不同的载体上， 其中，所述sgRNA为权利要求2、3或4所述的sgRNA且所述Cas9蛋白源自嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)〇7. 根据权利要求6所述的CRISPR-Cas9系统，其中，所述sgRNA为权利要求4所述的 sgRNA〇8. -种编辑CCR5基因的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求6或7所述的 CRISPR-Cas9系统导入表达CCR5的细胞中。9. 根据权利要求8所述的方法，其中，所述细胞来源于灵长类动物，优选来源于人。10. 权利要求6或7所述的CRISPR-Cas9系统在制备用于预防和/或治疗HIV感染的 药物中的应用。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，公开了嗜热链球菌CRISPR-Cas9系统识别的人CCR5基因的靶序列和sgRNA及其应用，靶序列如SEQ？ID？NO:1-30中任一个第n-30位所示且n＝1-12。本发明还涉及序列为5’-识别序列-招募Cas9蛋白的序列-3’的sgRNA及其编码DNA分子，识别序列对应的DNA序列与靶序列相同。本发明还涉及CRISPR-Cas9系统，包括Cas9蛋白和sgRNA和/或携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体。本发明还涉及CRISPR-Cas9系统在编辑CCR5基因和制备用于HIV感染的药物中的应用。本发明可以实现人CCR5基因的编辑，从而防治艾滋病。
【IPC分类】C12N9/22, C12N15/113, A61K31/7088, C12N15/11, A61P31/18
【公开号】CN105400779
【申请号】CN201510676703
【发明人】张竞方, 秦小平
【申请人】芜湖医诺生物技术有限公司
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年10月15日