一种利用转录因子Crz1p调控光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用转录因子Crzlp调控光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法，属于 生物工程领域。
【背景技术】
[0002] 光滑球拟酵母（Candida glabrata)是工业生产丙酮酸的唯一微生物。除此之外， C.glabrata还可用于工业生产富马酸、苹果酸、α-酮戊二酸等有机酸。有机酸发酵过程 中，随着产物的积累，培养基PH迅速降低，导致菌体的生长和产物的积累减缓甚至停止。近 年来国内外主要通过外源添加辅助底物、诱变育种、基因工程和适应性进化等策略提高菌 体的酸耐受性和有机酸产量。对C. glabrata进行耐酸机制的研究可从根本上解决这一问 题，但此机制尚不清楚。因此，进行光滑球拟酵母酸胁迫耐受机制的研究很有必要，这对提 高有机酸产量具有指导意义。
[0003] 目前对光滑球拟酵母酸胁迫的研究尚未广泛开展，蛋白质组学分析发现相对于高 pH来说，光滑球拟酵母对低pH环境有更强的耐受性。对GPI锚定天冬氨酰蛋白酶的研究发 现光滑球拟酵母可通过CgYpsl调节质子栗CgPmal的活性以适应酸胁迫环境。此外，研究 者们对光滑球拟酵母转录因子进行的功能鉴定发现，Msn2p和Msn4p是抵御多种环境压力 必不可少的转录因子，Yaplp、Skn7p和Slm7p通过抵御氧胁迫参与酸胁迫应答反应。
[0004] 对光滑球拟酵母酸胁迫的耐受机制研究处于初步阶段，仍没有形成系统的转录调 控网络，因此，从转录因子着手进行相关研究具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 为了克服上述问题，本发明鉴定了 一种调控光滑球拟酵母酸胁迫的转录因子 Crzlp的功能，发现光滑球拟酵母缺失CgCRZl基因后，与野生型菌株相比，不能正常表达转 录因子CgCrzlp，生长能力降低，且在酸胁迫条件下的细胞膜性能改变，胞内微环境发生变 化，菌株的酸胁迫耐受性降低。
[0006] 本发明提供一种改变光滑球拟酵母酸胁迫抗性的方法，是缺失突变CgCRZl基因 以降低菌株酸胁迫抗性，或者过表达CgCRZl基因以提高菌株的酸胁迫抗性。
[0007] 所述CgCRZl基因的核苷酸序列是NCBI上gene ID:2891693的核苷酸序列。
[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述光滑球拟酵母是Candida glabrata ATCC 55。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述缺失突变具体是：将标记基因 HIS3同基因 CgCRZl左臂和右臂连接起来，构建敲除框，将测序正确敲除框电击转化到光滑球拟酵母感 受态细胞中，通过同源臂重组将基因 CgCRZl替换成标记基因 HIS3,利用重组后的菌株含有 基因 CgHIS3而能合成组氨酸这一特征筛选缺失CgCRZl基因的突变菌株，经基因组PCR和 测序验证正确的突变菌株即为缺失突变CgCRZl基因的菌株Cgcrzl Δ。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，所述过表达是将扩增CgCRZl基因序列并克隆到质 粒pY26上，由强启动子GPDl启动转录翻译，重组质粒pY26-CgCRZl电击转化到光滑球拟酵 母。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述过表达是将CgCRZl基因克隆到质粒pY26并在 基因缺失突变菌株Cgcrzl △中过表达，利用质粒ρΥ26上的尿嘧啶基因 URA3作为标记筛选 基因回补菌株，验证正确的菌株命名为Cgcrzl Δ/CgCRZl。
[0012] 本发明还提供一种酸胁迫抗性降低的光滑球拟酵母，所述光滑球拟酵母缺失了 CgCRZl基因；所述CgCRZl基因的核苷酸序列是NCBI上gene ID:2891693的核苷酸序列。
[0013] 本发明还提供一种酸胁迫抗性提高的光滑球拟酵母，所述光滑球拟酵母过表达 CgCRZl基因；所述CgCRZl基因的核苷酸序列是NCBI上gene ID:2891693的核苷酸序列。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述过表达具体是：扩增CgCRZl基因序列，通过T4 连接酶将CgCRZl基因经酶切位点BamHI和StuI克隆到高拷贝质粒pY26上，由强启动子 GPDl启动转录翻译，重组质粒pY26-CgCRZl电击转化到光滑球拟酵母基因缺失突变菌株 Cgcrzl Δ中，利用质粒PY26上的尿嘧啶基因 URA3作为标记筛选基因回补菌株，将经过质粒 PCR和质粒酶切验证正确的菌株命名为Cgcrzl Δ/CgCRZl，编号保存。
[0015] 本发明还要求保护所述光滑球拟酵母在生产有机酸方面的应用，以及在食品、化 工、制备药物方面的应用。
[0016] 本发明还提供一种改变光滑球拟酵母细胞膜组成的方法，所述方法是过表达 CgCRZl 基因。
[0017] 本发明的有益效果：
[0018] 本发明鉴定了光滑球拟酵母中转录因子CgCrzlp的功能，通过缺失突变CgCRZl基 因降低了菌株酸胁迫抗性，或者过表达CgCRZl基因提高了菌株的酸胁迫抗性。
【附图说明】
[0019] 图1基因缺失菌株的构建及验证，A敲除框的构建，B基因缺失菌株的验证；
[0020] 图2光滑球拟酵母生长的测定，A不同pH下的平板生长实验，B不同pH下生长曲 线测定；
[0021] 图3细胞膜性能测定结果，A脂肪酸含量测定，B留醇成份及含量测定，C细胞膜通 透性测定；
[0022] 图4过表达菌株的构建及验证，A表达基因的扩增，B基因过表达菌株的验证；
[0023] 图5光滑球拟酵母生长的测定，A不同pH下生长曲线测定；B在pH = 2. 3酸胁迫 下，生长后期胞外PH值测定。
【具体实施方式】
[0024] 以下是光滑球拟酵母（Candida glabrata)菌株构建及验证、生长性能分析及细胞 膜性能测定的实施例。
[0025] 实施例1 :缺失突变菌的构建
[0026] 以C. glabrataATCC 2001 (wt)基因组为模板，分别以P1/P2 (序列分别如SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2 所示）、P3/P4(序列分别如 SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4 所示）、P5/P6(序 列分别如SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6所示）为引物，扩增出待敲除基因的左臂（L)、组氨酸 基因（M)和右臂（R)，经融合PCR构建敲除框CgCRZl-LMR(图1)。出发菌株C. glabrataATCC 55因缺失组氨酸基因不能在MM筛选培养基上生长，而突变菌株经同源重组后，因标记基因 组氨酸表达而在MM培养基上生长。对转化子进行PCR验证，如图1所示，提取转化子的基 因组，发现以P7/P8(序列分别如SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8所示）为引物时，野生型菌株 wt产生3. Okb左右基因片段，而转化子获得I. 7kb左右的基因 CgHIS及基因 CgCRZl的左右 臂。将验证正确的突变菌株命名为Cgcrzl Δ。
[0027] PI：CGGGATCCCGATTAGTAGCGATAACGAGTTGGAC
[0028] P2 ：ACCCTCTTAACAAACGCCATTGCTGAATATTGCAAAATCTTGT
[0029] P3 ： TACAAGATTTTGCAATATTCAGCAATGGCGTTTGTTAAGAGGGTT
[0030] P4 ：ATACTGGAGGTTTGTGTTAATCTATGCTAGGACACCCTTAGTGG
[0031] P5 ：CCACTAAGGGTGTCCTAGCATAGATTAACACAAACCTCCAGTATT
[0032] P6 ：GGAATTCCGCAACCCCTTATTTCCTTAGAT
[0033] P7 ：TGGCACATATGCCTCGATGTA
[0034] P8 ：TTGTCTTAAATGCGTTGGC
[0035] 实施例2 :缺失突变菌的生长性能测定
[0036] 通过平板生长实验和细胞生长测定对CgCRZl进行功能鉴定：
[0037] 1)平板生长实验：
[0038] 将待测菌株的单菌落接种于 20mL 的 YNB (0· 67% Yeast Nitrogen Base without Amino Acids，2%Glucose，pH 5. 7)液体培养基中，30°C摇床培养12h至对数生长期，测定 菌体浓度并将菌悬液调节至〇D_= 1. 0,以此为初始浓度，进行5次10倍梯度稀释，依次将 4 μ L菌液点种在待测固体培养基上，30°C培养2天，观察菌体的生长情况并拍照。
[0039] 2)细胞生长测定：
[0040] 将对数期的待测菌株接种于 20mL 的 YNB (0· 67% Yeast Nitrogen Base without Amino Acids，2%Glucose，pH 5. 7)液体培养基中，30°C摇床培养12h至对数生长期，接种 至不同pH YNB培养基中，初始0D6。。= 0. 1，30°C摇床培养，每隔一定的时间取菌液，稀释适 当倍数，600nm测定OD值。
[0041] 平板生长实验和生长曲线分析不同pH对菌株wt、Cgcrzl Δ生长的影响，如图3A、 3B。缺失菌株CgcrzlA在不同pH培养基中的生长，发现突变菌株CgcrzlA在PH8.0时生 长不受影响，当PH2. 6时生长开始受到抑制，在pH2. 3时则生长缓慢，以上结果表明，基因 CgCRZl的缺失降低了 C. glabrata的生长能力和对酸性环境的耐受能力。
[0042] 实施例3 :缺失突变菌的细胞膜性能测定
[0043] 通过测定细胞膜脂肪酸、细胞膜通透性，对光滑球拟酵母细胞膜性能进行评价。
[0044] (1)细胞膜脂肪酸测定
[0045] 细胞培养：收集YNB-5. 7和YNB-2. 3处理12h的酵母细胞，用PBS缓冲液洗涤三 遍，然后冷冻干燥后备用。脂质提取及处理：称取冷冻干燥后的菌体30mg，置于试管中，加 入Iml溶液I，100°C进行水浴30min。进行冰浴来迅速冷却，之后加入2mL溶液II，混匀后 在80°C水浴中处理5min。迅速冷却，并加入I. 25mL溶液III。摇匀震荡5mi