一种低分子量纤溶酶及其制备方法和应用
【专利说明】一种低分子量纤溶酶及其制备方法和应用
[0001] (一）技术领域 本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种低分子量纤溶酶及其制备方法和应用。
[0002] (二）【背景技术】 血栓类疾病是当今致死率、致残率最高的疾病之一，其比率远高于癌症，且随着我国老 龄化的趋势将日益严重。据统计，全世界25%的死亡是由心脑血管类血栓疾病造成的，占因 病死亡人数的40. 7%，存活的患者中75%致残，有约40%为重度残疾。随着我国老龄化问题的 加剧及生活习惯的改变，血栓类疾病对我国人民的健康及生活水平的影响也日益突出。目 前，新型溶栓药物的开发和血栓类疾病的预防与临床治疗已成为医药学界的研究热点。研 究发现，来源于枯草芽孢杆菌的具有溶栓活性蛋白酶（纳豆激酶）及其同工酶在保健食品、 溶栓及抗老年痴呆等药物开发领域有着广阔的应用前景。纳豆激酶有275个氨基酸残基组 成，其等电点为8. 7。与枯草杆菌蛋白酶E (subtilisin E)有99. 5%的序列同源性，与枯 草杆菌蛋白酶BPN (subtilisin BPN)有86%的序列同源性。研究发现，纳豆激酶可以作 为口服溶栓生物制品的活性成分，被肠道吸收而水解体内的血栓块，进一步研究发现其还 可以作用于其它参与血液溶解与凝固的关键因子，从而通过不同的途径来改善血液循环系 统。
[0003] 本发明首次从海洋微生物发酵液中提取了一组低分子量具有纤溶活性的蛋白水 解酶，并提供了一种可以规模化制备高活性纤溶酶的方法。低分子量高活性的纤溶酶在溶 栓相关生物制品领域具有更加广阔的应用前景。本发明为低分子量枯草芽孢杆菌蛋白酶的 应用开发奠定基础。
[0004] (三）
【发明内容】
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种分子量小、活性强、不被胰蛋白酶降解的 低分子量纤溶酶及其制备方法和应用。
[0005] 本发明是通过如下技术方案实现的： 一种低分子量纤溶酶，其特征在于：是一组序列如下所示的氨基酸序列组成的蛋白质 或多肽；组分 I 的序列为 AQSVPYGISQIKAPALHSQGYTGSNVKVAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASFVPSET NPYQDGSSHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGSGQYSWIINGIEWAISNNMGVINMSLGGPSGS TALKTWDKAVSSGIWAAAAGNEGSSGSSSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQR，组分 II 的序列为 GYTGSNVK VAVIDSGIDSSHPDLNVRGGASFVPSETNPYQDGSSHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSASLYAVKVLDSTGS GQYSWIINGIEWAISNNMGVmMSLGGPSGSTALKTVVDKAVSSGIVVAAAAGNEGSSGSSSTVGYPAKYPSTI AVGAVNSSNQR，组分III的序列为 AAGNEGSSGSSSTVGYPAKYPSTIAVGAVNSSNQRASFSSAGSELDVMAPG VSIQSTLPGGTYGAYNGT，组分IV的序列为 SMATPHVAGAAALILSKHPTWTNAQVRDRLESTATYLGNSFYYG KGLINVQAAAQ，组分 V 的序列为 ATPHVAGAAALILSKHPTWTNAQVRDRLESTATYLGNSFYYGKGLINVQAA AQ0
[0006] 所述蛋白质或多肽的分子量小于20kDa。
[0007] 本发明利用质谱分析技术确认了五个主要片段的氨基酸序列组成，活性研究表明 它们具有的体内外溶栓活性，提示其降解后的片段依旧保持了溶栓必须的空间结构；该降 解产物组分具有分子量低，活性高的特点，提示该活性组分在调节血液循环及溶栓生物制 品的应用中具有广阔的开发价值。
[0008] 本发明所述的低分子量纤溶酶的制备方法，以枯草芽孢杆菌为菌种，包括如下步 骤： (1) 利用LB液体培养基将菌种过夜活化，按重量分数1%的接种量将过夜活化的菌种接 种到液体发酵培养基中发酵，发酵液离心后收集上清液； (2) 在搅拌条件下，往上清液中缓慢加入硫酸铵至饱和度，4°C条件下静置过夜，离心收 集蛋白沉淀，即获得粗酶； (3) 将粗酶用截留分子量是3500Da的透析袋透析到pH5. 6的磷酸盐缓冲液中，将透析 后的粗酶液经阳离子交换层析，收集活性峰，经冷冻干燥得到产品。
[0009] 本发明的优选技术方案为： 步骤（1)中，所述液体发酵温度为37°C，发酵时间为2-3天，摇床转速为180rpm，液体 培养基含有麦芽糖、蛋白胨和无机盐。
[0010] 步骤（1)中，所述发酵液在4°c下，4, 000 X g离心30min后，除去菌体沉淀，收集上 清液。
[0011] 步骤（2)中，以4, OOOXg离心30min，收集蛋白沉淀。
[0012] 步骤（3)中，使用CM-Sepharose FF或SP-Sepharose FF进行阳离子交换层析，用 lmol/L氯化钠溶液洗脱，收集活性峰，得到产品。
[0013] 本发明所述的低分子量纤溶酶的应用，其特征在于：用于制备溶栓药物、保健食品 生物制剂。利用纤维蛋白平板法检测，发现该低分子活性组分具有很强的溶栓活性，优于同 剂量的临床药物尿激酶；在体内的溶栓实验中，也表现出优于同剂量的临床药物尿激酶。
[0014] 所述溶栓药物、保健食品生物制剂的有效剂型为注射剂或口服剂。
[0015] 本发明产品分子量小，活性强，不被胰蛋白酶降解，制备简单，生产成本低，在其保 健食品、溶栓药物开发等领域具有广阔开发前景。
[0016] (四）【附图说明】 下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0017] 图1为本发明纯化后低分子量纤溶酶的Tricine-SDS-PAGE电泳图； 图2为本发明温度对纤溶酶活性的影响示意图； 图3为本发明pH值对纤溶酶活性的影响示意图。
[0018] (五）【具体实施方式】 下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容。应当指出，这些实施例仅用来对本 发明的内容进行具体描述，但本发明的技术方案并不局限于此。
[0019] 实施例1 :低分子量纤溶酶的制备 低分子量纤溶酶是海洋来源的枯草芽孢杆菌经发酵培养分泌到培养液中，经硫酸铵盐 析进行初步提取，阳离子交换树脂进行纯化得到的。具体过程如下： (1)发酵培养 菌种活化：利用LB液体培养基（1. 0%胰蛋白胨（w/v)，1. 0%的氯化钠（w/v)，0. 5%酵母 粉（w/v)，用去离子水配置，121°C高温灭菌20min。）将菌种过夜活化。
[0020] 发酵培养：将过夜活化菌种，按照1 :1〇〇的比例接种到发酵培养基中（2%蛋白胨， 1% 麦芽糖，〇· 〇5%MgS04,0 . 02%CaCl2,0. 4% KH2PO4, IMHCl 调 ρΗ=7· 0，121 °C 高压湿热灭菌 30min)。37°C、180rpm，培养2-3天，离心收集发酵液，离心条件为4, OOOXg，离心30min， 制得发酵上清液。
[0021] ( 2)低分子量纤溶酶的纯化 发酵上清液在低速搅拌的条件下，缓慢加入硫酸铵至60%饱和度。4 °C静置过夜，以 4,000Xg离心30min，收集蛋白沉淀。盐析后的蛋白沉淀透析到pH5. 6、20mM的醋酸钠缓 冲液中（离子交换层析的上样缓冲液)，4°C，透析过夜。透析后的样品上样到已平衡好的离 子交换层析介质上（CM-sepharose弱阳离子交换介质)。上样后用2倍柱体积的平衡缓冲液 冲洗未结合的杂蛋白。之后进行盐离子浓度梯度洗脱。洗脱条件：A液为平衡缓冲液，B液 为在A液中加500mM NaCl。线性梯度洗脱（B液从0到100%)，洗脱体积为5倍柱体积，透 析除盐后进行冷冻干燥。纯化得到的活性组分Tricine-SDS-PAGE电泳结果见图1，电泳图 谱中1-4分别代表收集的目标峰的不同位置。结果显示：5个组分的分子量均在20kDa以 下，按分子量从大到小依次命名为1、2、3、4、5。
[0022] 实施例2 :低分子量活性组分的确认 为深入研究该活性组分，首先利用肽指纹图谱对五个低分子量组分片段进行了肽指纹 图谱鉴定。具体过程如下： 将低分子活性组分经过Tricine-SDS PAGE切胶回收。利用胶内酶解及Ziptip脱盐将 条带切碎后转入EP管中，加入5yL 2.5-10ng/yL测序级Trypsin (Promega)溶液，37°C 反应过夜，吸出酶解液，转移至新EP管中，用Ziptip (millipore)进行脱盐。冻干后的酶 解样品，取2 μ L、20%乙腈复溶。取1 μ L溶解样品，直接点于样品靶上，让溶剂自然干燥后， 再取0. 5 μ L过饱和CHCA基质溶液(溶剂为50%ACN0. 1% TFA)点至对应靶位上并自然干燥。 样品靶经氮气吹净后放入仪器进靶槽并用串联飞行时间质谱仪（5800 MALDI-T0F/T0F，AB SCIEX)进行测试分析。如前所述，不同枯草芽孢杆菌来源的蛋白酶的序列保守性比较高。 经鉴定，本实验室所保存的菌种也是一株枯草芽孢杆菌，所以本研究以溶栓活性高的纳豆 激酶作为搜索模板进行覆盖度测定。
[0023] 在此基础上，对该样品的四个主要蛋白组分进行了 N-末端分析（Edman法)。低分 子量纤溶酶样品经Tricine-SDS PAGE，转PVDF膜之后经过丽春红染色。切胶进行蛋白质 N-末端检测分析。经过N-末端测试后，各个组分的鉴定结果下表所示。
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