阿魏酸酯酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种阿魏酸酯酶及其应用。
【背景技术】
[0002] 阿魏酸酯酶（E. C. 3. I. 1. 73, Ferulicacid esterases, FAE)又称肉桂酸酯酶。它 是一种羧酸酯酶，指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键，将阿 魏酸游离出来的酶。阿魏酸在植物细胞壁结构中起着重要的作用，它可以在植物细胞壁的 木质素与木质素之间、木质素与半纤维素之间、半纤维素与半纤维素之间形成交接，从而 构成一个骨架结构，使得整个细胞壁变得坚硬。在生物质材料中阿魏酸主要以酯键的形式 连接在阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖残基上，构成了木质素和半纤维素的链接，形成了生物质 材料的抗降解屏障。为了提高纤维素酶酶解生物质的效率，需要额外补充添加阿魏酸酯酶。 阿魏酸酯酶处理植物性原料在食品、饲料和造纸工业中有着光明的前景。在食品工业中可 利用阿魏酸酯酶打断阿魏酸与细胞壁材料如麸皮、秸杆中多糖的交联，高效降解多糖并获 得反式阿魏酸，它和阿拉伯木聚糖酶联合作用的水解产物低聚糖（主要是低聚木糖）、阿 魏酸都是重要的功能性食品基料，戊糖可用于酒精发酵、生产木糖醇等。在饲料工业中， 利用阿魏酸酯酶处理植物性的原材料，可以将阿魏酸从植物细胞壁的结构中游离出来，从 而破坏细胞壁的骨架结构，使得木质素、半纤维素及纤维素之间的连接被部分打破，结构 变得比处理前疏松，变得疏松的原料更容易被牲畜消化吸收利用，可以提高饲料的利用效 率。
[0003] 阿魏酸是天然抗氧化剂，也是近年来国际认知的防癌物质。其具有很好的抗氧化 活性，对过氧化氢、超氧自由基、羟自由基、过氧化亚硝基都有强烈的清除作用，且能调节 生理机能，抑制产生自由基的酶，增加清除自由基酶的活性。同时，阿魏酸可以作为合成 天然香兰素的前体，以阿魏酸为原料，利用微生物的方法生产的香兰素与合成的香兰素相 比，具有毒性低，安全性高的特点，可以用作食品和化妆品行业的香料。阿魏酸广泛存 在于食品原料中，目前已经使用阿魏酸酯酶或与其他酶协同作用从各种农作物的副产品 中如麦麸、玉米麸皮、啤酒糟、谷物纤维、甜菜渣、燕麦壳和苹果渣等作为原材料来提取阿魏 酸。
[0004] 国外在阿魏酸酯酶的研究上已取得了一些卓有成效的工作。首先筛选了一批产阿 魏酸酯酶的微生物；其次对部分微生物产阿魏酸酯酶进行了纯化，并对其酶学性质进行了 研究，如酶的结构、最适温度、最适PH值及影响酶稳定性的其他因素；第3探讨了阿魏酸酯 酶与一些多糖降解酶的协同作用；第4探讨了微生物产酶的影响因素和酶的工业化分离方 法。现在阿魏酸酯酶的酶活力，酶学特性仍然限制了它的应用。迫切需要找到高酶活力的， 与纤维素酶协同作用强烈的新型阿魏酸酯酶。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是提供一种阿魏酸酯酶，其为由桧状青霉表达获得；
[0006] 本发明的目的之二是提供应用阿魏酸酯酶进行木质纤维素降解的方法。
[0007] 本发明公开了一种阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
[0008] 优选的是，其中，用于编码所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列的基因序列为（a)或（b) 所示：
[0009] (a) SEQ ID No. 2所示的多核苷酸序列；
[0010] (b)与（a)中多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。
[0011] -种阿魏酸酯酶在木质纤维素降解中的应用。
[0012] -种应用阿魏酸酯酶进行木质纤维素降解的方法，其特征在于，将所述阿魏酸酯 酶与纤维素酶混合后添加入水热预处理后的木质纤维素溶液中进行木质素降解，其中，所 述阿魏酸酯酶的添加量为20 μ g-120 μ g/g底物，所述的纤维素酶的添加量为10FPU/g底 物。
[0013] 优选的是，其中，将所述阿魏酸酯酶与纤维素酶混合后加入水热预处理后的木质 纤维素溶液中，在50°c下保温进行木质素降解处理48h。
[0014] 优选的是，其中，所述阿魏酸酯酶的添加量为66. 3 μ g/g底物。
[0015] 本发明的有益效果是：
[0016] 本发明提供的阿魏酸酯酶的序列较新，与常见的黄曲霉、米曲霉的阿魏酸酯酶的 氨基酸序列相似度只有60% ;
[0017] 本发明提供的阿魏酸酯酶的新颖的酶学性质：最适pH为3.0,偏酸性。最适温度 为70°C，耐高温；
[0018] 本发明提供的阿魏酸酯酶与商业纤维素酶复配后，对不同预处理的木质纤维素材 料都有促进水解的作用，且在相同的水解条件下，相同时间内水解效率明显高于现有其他 种类的阿魏酸酯酶。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明所述阿魏酸酯酶的进化树；
[0020] 图2为本发明中阿魏酸酯酶基因扩增片段；
[0021] 图3为本发明中阿魏酸酯酶_pET28a PCR验证的结果；
[0022] 图4为本发明中阿魏酸酯酶_pET28a双酶切验证的结果；
[0023] 图5为本发明中阿魏酸酯酶在大肠杆菌中诱导表达情况；
[0024] 图6为本发明中异源表达的阿魏酸酯酶的分离纯化结果；
[0025] 图7为本发明中阿魏酸酯酶与纤维素酶协同作用结果，其中，底物分别为水解水 热预处理的玉米秸杆，汽爆玉米秸杆和木薯酒糟；
[0026] 图8为本发明中阿魏酸酯酶与纤维素酶协同作用结果，其中，底物为水解水热预 处理的玉米秸杆；
[0027] 图9为本发明中阿魏酸酯酶与纤维素酶协同作用结果，其中，底物为水解水热预 处理的玉米秸杆。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文 字能够据以实施。
[0029] 应当理解，本文所使用的诸如"具有"、"包含"以及"包括"术语并不配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。
[0030] 本发明提供了一种阿魏酸酯酶，其特征在于，所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。
[0031] -个优选方案中，用于编码所述阿魏酸酯酶的氨基酸序列的基因序列为（a)或 (b)所示：
[0032] (a) SEQ ID No. 2所示的多核苷酸序列；
[0033] (b)与（a)中多核苷酸序列根据碱基互补配对原则互补的多核苷酸序列。
[0034] -种阿魏酸酯酶在木质纤维素降解中的应用。
[0035] -种应用阿魏酸酯酶进行木质纤维素降解的方法，其特征在于，将所述阿魏酸酯 酶与纤维素酶混合后添加入水热预处理后的木质纤维素溶液中进行木质素降解，其中，所 述阿魏酸酯酶的添加量为20 μ g-120 μ g/g底物，所述的纤维素酶的添加量为10FPU/g底 物。
[0036] -个优选方案中，将所述阿魏酸酯酶与纤维素酶混合后加入水热预处理后的木质 纤维素溶液中，在50°C下保温进行木质素降解处理48h。
[0037] -个优选方案中，所述阿魏酸酯酶的添加量为66. 3 μ g/g底物。
[0038] 一、阿魏酸酯酶种类鉴定：
[0039] 如图1所示，可以看到桧状青霉的阿魏酸酯酶序列与黄曲霉，米曲霉的阿魏酸酯 酶相似度只有60%，该蛋白序列较新。
[0040] 二、阿魏酸酯酶的表达和分离纯化：
[0041] 包括以下几个部分：阿魏酸酯酶基因的扩增，大肠杆菌系统质粒的构建，大肠杆菌 中表达和阿魏酸酯酶蛋白的分离纯化，具体为：
[0042] 1、阿魏酸酯酶基因的扩增：
[0043] 我们首先培养桧状青霉9-3菌株，采用天根植物总RNA提取试剂盒提取基因组 RNA 后，米用 Thermo fermentas 试剂盒 RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit K1621-1622进行逆转录后得到cDNA。根据FAE2基因序列设计带有NheI酶切位点的上游 引物和带有XhoI酶切位点的下游引物（上游引物序列为：FAE-S2,其多核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示的多核苷酸序列，下游引物为：FAE-X2,其多核苷酸序列为SEQ ID No. 4所示 的多核苷酸序列，进行PCR扩增得到FAE2基因全长（1539bp)，如图2所示。
[0044] 2、大肠杆菌系统质粒的构建：
[0045] 得到FAE2片段后我们根据事先设计好的酶切位点NheI和XhoI酶切FAE2片段回 收获得两端NheI和XhoI的粘性末端，同时采用NheI和XhoI双酶切pET28a，胶回收获得载 体片段，T4DNA Iigas酶连获得重组载体FAE2-pET28a。获得重组载体后分别进行菌落PCR 和酶切验证，验证结果如图3所示。
[0046] 由于FAE2基因和载体pET28a上都存在一个SmaI酶切位点，酶切之后产生4600bp 和2200bp的片段，因而我们采用SmaI酶切，结果如图4所示。
[0047] 采用T7通用引物测序我们扩增的DNA片段序列，DNAMN软件进行与阿魏酸酯 酶序列比对，发现相似度为100%，证明我们构建的质粒是正确的。得到正确的重组载体 FAE2-pET28a后，我们将其转化进大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0048] 3、大肠杆菌