直投式凝乳酶制剂及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种直投式凝乳酶制剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002]凝乳酶是乳酪生产中的关键酶，传统上利用牛犊第四胃(皱胃)提取制作，随着乳酪产业不断扩大，单纯靠宰杀幼畜的方法来生产凝乳酶已经不能满足现代工业对凝乳酶的需求。研究者已经开始从其他动物、植物和微生物中寻求凝乳酶来源。微生物来源广泛及其生长特性使得微生物凝乳酶具有广阔的发展前景。目前关于微生物凝乳酶主要是利用真菌生产凝乳酶，而关于细菌生产的凝乳酶的研究较少。但细菌液体发酵生产凝乳酶具有生长周期短、生产成本低、易于控制生长条件等诸多优点，近几年得到研究者更多的关注。
【发明内容】
[0003]基于此，本发明的目的之一在于提供一种直投式凝乳酶制剂的制备方法。
[0004]实现上述发明目的的具体技术方案如下:
[0005]—种直投式凝乳酶制剂的制备方法，所述直投式凝乳酶制剂由保藏编号为CCTCCΜ 2015633的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)发酵培养制备得到，包括以下步骤:
[0006](1)格氏乳球菌的活化:将格氏乳球菌(Lactococcus garviea)在琼脂-营养肉汤斜面培养基上活化；
[0007](2)格氏乳球菌种子液的制备:将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接种于培养基中进行培养，得格氏乳球菌(Lactococcus garviea)种子液；
[0008](3)格氏乳球菌的发酵培养:将格氏乳球菌(Lactococcus garviea)种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养；
[0009](4)直投式凝乳酶制剂的制备:在步骤(3)的发酵培养基中加入糖类保护剂，冷冻干燥，即得直投式凝乳酶制剂。
[0010]在其中一些实施例中，步骤(3)所述的发酵培养基的成分为:5?30wt%的脱脂乳，0?5*1:%的葡萄糖、乳糖、果糖或鹿糖，0?5*1:%的酵母粉、蛋白胨、氯化钱或硫酸钱，余为蒸饱水。
[0011]在其中一些实施例中，步骤(3)所述的发酵培养基的成分为:10wt%的脱脂乳，lwt %的葡萄糖，2wt %的蛋白胨，余量为蒸馏水。
[0012]在其中一些实施例中，步骤(1)所述琼脂-营养肉汤斜面培养基中琼脂的含量为2wt%，活化时间为20h?50h，温度为25°C?48 °C。
[0013]在其中一些实施例中，步骤(2)所述培养基为M17培养基，培养温度为28 °C?48°C，培养时间为10h?50h，转速为lOOrpm?280rpm。
[0014]在其中一些实施例中，步骤(3)将格氏乳球菌(Lactococcus garviea)种子液按体积比为1%?10%的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为28V ?48°C，时间为 24h ?156h，转速为 lOOrpm ?280rpm。
[0015]在其中一些实施例中，步骤(3)将格氏乳球菌(Lactococcus garviea)种子液按体积比为1 %的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为28°C，时间为144h，转速为240rpm。
[0016]在其中一些实施例中，步骤(4)所述加入糖类保护剂为加入0.5?5被％的海藻糖和/或0.5?5wt%的乳糖，冷冻干燥的时间为20h?28h。
[0017]本发明的另一目的在于提供一种直投式凝乳酶制剂。
[0018]具体技术方案如下:
[0019]—种直投式凝乳酶制剂，由上述制备方法制备而得。
[0020]本发明的另一目的在于提供上述直投式凝乳酶制剂的应用。
[0021]具体技术方案如下:
[0022]上述直投式凝乳酶制剂在制备发酵乳制品中的应用。
[0023]本发明的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)已于2015年10月22号保藏于武汉大学保藏中心中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址:武汉市武昌珞珈山)，保存期为三十年，保藏编号CCTCC Μ 2015633。
[0024]本发明筛选得到一种格氏乳球菌(Lactococcus garviea)，其保藏编号为CCTCC Μ2015633，进而利用该格氏乳球菌(Lactococcus garviea)进行发酵培养制备直投式凝乳酶制剂。本发明的直投式凝乳酶制剂的制备方法制备得到的凝乳酶制剂活性高(1230SU/mg以上)、热稳定性与酸碱稳定性均很好，制备过程简单、成本低。本发明的直投式凝乳酶制剂可用于制备发酵乳制品。
【附图说明】
[0025]图1为实施例1的直投式凝乳酶制剂的热稳定性研究图。
[0026]图2为实施例1的直投式凝乳酶制剂的酸碱稳定性研究图。
【具体实施方式】
[0027]以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。
[0028]以下实施例中，未注明具体条件的实验方法，按本领域内常规方法和条件进行。格式乳球菌(Lactococcus garviea)保藏在武汉大学保藏中心中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2015年10月22日，保藏编号CCTCC M2015633。
[0029]实施例1
[0030]本实施例的一种直投式凝乳酶制剂的制备方法，包括以下步骤:
[0031](1)格氏乳球菌的活化:将格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接种于2*1:%的琼脂-营养肉汤中进行活化，活化温度为28°C，时间为48h ;
[0032](2)格氏乳球菌种子液的制备:将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接种于M17培养基中培养12h，培养温度为28 °C，转速为lOOrpm，得到格氏乳球菌(Lactococcus garviea)种子液；
[0033](3)格氏乳球菌的发酵培养:将格氏乳球菌(Lactococcus garviea)种子液按体积比为1 %的接种量接种于发酵培养基中发酵培养144h，培养温度为28°C，转速为lOOrpm ;所述发酵培养基的成分为:10wt%的脱脂乳，lwt%的葡萄糖，2wt%蛋白胨，余量为蒸馏水；
[0034](4)直投式凝乳酶制剂的制备:在步骤(3)的发酵培养基中加入2wt%的海藻糖和
0.lwt%的乳糖，冷冻干燥24h，即得所述直投式凝乳酶制剂，其凝乳酶活性为1560SU/g。
[0035]凝乳酶活性测定方法:将直投式凝乳酶制剂用蒸馏水配制成10mg/mL的酶液。用
0.0lmol/L氯化钙溶液配制12被％的脱脂奶粉溶液，室温放置40min后使用，当天配制。取5mL 12wt%的脱脂奶粉溶液在35°C水浴锅中保温lOmin，加0.05mL酶液，立即摇匀，开始计时，把试管倾斜45°，旋转试管，观察壁上出现絮状沉淀时为凝乳终点，记录凝乳时间。40min凝固lm L脱脂乳的酶量定义为一个索氏单位(Soxhlet unit，SU)。按下式计算凝乳酶活力:MCE = 2400*V1*N/(T*V2)，式中:MCE为凝乳酶活力/(SU/mL) ;V1为脱脂奶粉溶液体积/mL ;t为凝乳时间/s ;V2为加酶体积/mL ;n为稀释倍数。
[0036]实施例2
[0037](1)格氏乳球菌的活化:将格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接种于2*1:%的琼脂-营养肉汤中进行活化，活化温度为45°C，时间为48h ;
[0038](2)格氏乳球菌种子液的制备:将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接种于M17培养基中培养48h，培养温度为45 °C，转速为240rpm，得到格氏乳球菌(Lactococcus garviea)种子液；
[0039](3)格氏乳球菌的发酵培养:将格氏乳球菌(Lactococcus garviea)种子液按体积比为10%的接种量接种于发酵培养基中发酵培养24h，培养温度为45°C，转速为240rpm ;所述发酵培养基的成分为:10wt%的脱脂乳，lwt%的葡萄糖，2wt%蛋白胨，余量为蒸馏水；
[0040](4)直投式凝乳酶制剂的制备:在步骤⑶的发酵培养基中加入2被％的海藻糖和0.lwt%的乳糖，冷冻干燥24h，即得所述直投式凝乳酶制剂，其凝乳酶活性为1540SU/g，(测定方法同实施例1)。
[0041]实施例3
[0042](1)格氏乳球菌的活化:将格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接种于2*1:%的琼脂-营养肉汤中进行活化，活化温度为28°C，时间为24h ;
[0043](2)格氏乳球菌种子液的制备:将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)接种于M17培养基中培养12h，培养温度为28 °C，转速为240rpm，得到格氏乳球菌(Lactococcus garviea)种子液；
[0044](3)格氏乳球菌的发酵培养:将格氏乳球菌(Lactococcus