一种羔羊第四胃有效成分提取物的制备方法及用图
【专利摘要】本发明涉及一种羔羊第四胃有效成分提取物的制备方法及用途，该方法将羔羊第四胃在低温下加入石油醚脱脂，脱脂后利用液氮冷冻，研磨粉碎，加入磷酸盐缓冲液溶解，低温自溶，利用盐酸溶液调节pH值3.3，低温下激活，再用氧化钠溶液调节pH值为5.6，过滤，离心，弃渣，上清液利用蒸馏水透析脱盐，离心去除透析形成的沉淀物（盐溶蛋白）后，上清液冷冻干燥即得提取物。经测试：本发明获得的提取物蛋白含量达到64.3%，凝乳酶活性为25182 Ru/g，胃蛋白酶活性为3796.4 u/g，蛋白水解活力为4641.1 u/g，十二烷基硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳图中凝乳酶及胃蛋白酶条带清晰。该方法得到提取物蛋白质纯度高、生物活性强，可应用于作为治疗或预防各种胃病相关的药物或保健品的制备原料。
【专利说明】
-种黒羊第四胃有效成分提取物的制备方法及用途
技术领域
[0001] 本发明设及一种黑羊第四胃有效成分提取物的制备方法及用途，作为治疗或预防 各种胃病相关的药物或保健品的制备原料。
【背景技术】
[0002] 黑羊第四胃是羊的第四个胃，学名为反当胃，是反当动物特有的一种胃部结构。反 当动物拥有瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃四个胃，前S个胃没有胃腺，第四胃有胃腺，与普通单胃 动物类似，能分泌消化液，故第四胃也称真胃。目前对于羊胃的应用主要是凝乳酶的提取， 用于干酪的生产，而人们对羊胃的概念大多数仅仅停留在食用方面。《本草蒙垄》中记载： "牛羊肚健脾胃，免饮积食伤"，说明羊胃中含有对人体有益的活性成分，而黑羊第四胃中活 性成分活性更高，值得被更好的利用。已有资料报道显示，黑羊第四胃内生物活性成分主要 含有胃蛋白酶、凝乳酶、粘蛋白酶及双歧因子等。黑羊胃提取物目前已应用于治疗胃病的药 物原料，其中凝乳酶与胃蛋白酶结合可用于分解蛋白质促进蛋白质吸收，提高凝乳作用，改 善与蛋白质溶解有关的胃功能障碍;粘蛋白可覆盖于胃黏膜表面，对胃损伤部位具有保护 作用，使胃壁细胞增值，促进黏膜修复;双歧因子可促进双奇杆菌生长，对抗幽口螺旋杆菌 等有害菌。
[0003] 新疆动植物资源丰富，畜牧业发达，羊类是其中资源最为丰富的一类畜产。W黑羊 第四胃作为生产原料，与现代生物技术相结合进行生物制药，可变废为宝，将新疆得天独厚 的生物资源转化为产业优势，因此寻找一种能快速、有效提取黑羊第四胃中活性物质的方 法具有重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于，提供一种黑羊第四胃有效成分提取物的制备方法及用途，该 方法将新鲜黑羊第四胃用预冷蒸馈水流水清洗，除去脂肪及结缔组织后剪碎，液氮冷冻，研 磨粉碎之后，在低溫下加入石油酸机械揽拌进行脱脂，加入预冷过的憐酸盐缓冲液溶解，并 在低溫下自溶，再利用盐酸溶液调节抑值，在低溫下激活，再用氧化钢溶液调节抑值，纱布 过滤，离屯、，弃渣，上清液利用蒸馈水进行透析脱盐，离屯、去除透析形成的沉淀物（盐溶蛋 白）后，上清液冷冻干燥即得提取物。通过对蛋白质含量测定、凝乳酶活性测定、胃蛋白酶活 力测定、蛋白水解活力测定及聚丙締酷胺凝胶电泳分析表明，通过本发明所述方法获得的 提取物蛋白含量达到64.3%，凝乳酶活性为25182脚/邑，胃蛋白酶活性为3796.411/邑，蛋白水 解活力为4641. lu/g，十二烷基硫酸钢-聚丙締酷胺凝胶电泳图中凝乳酶及胃蛋白酶条带清 晰。该方法得到的黑羊第四胃有效成分提取物蛋白质纯度高、生物活性强，而且提取方法简 单可行，提取全程在低溫环境下操作，更好的保留了黑羊胃提取物的活性成分，可应用于作 为治疗或预防各种胃病相关的药物或保健品的制备原料。
[0005] 本发明所述的一种黑羊第四胃有效成分提取物的制备方法，按下列步骤进行：
[0006] a、取新鲜黑羊第四胃，利用预冷的蒸馈水流水清洗，剥除脂肪及结缔组织，溫度- 24°C下冷冻保存；
[0007] b、将步骤a所得黑羊第四胃剪碎，溫度-4°C下加入石油酸机械揽拌进行脱脂2次， 脱脂后利用液氮冷冻，研磨粉碎；
[0008] C、将步骤b所得脱脂黑羊第四胃加入15倍体积预冷过的憐酸盐缓冲液O.lmoL/L， 地=5.6溶解，溫度-4 °C下自溶4她；
[0009] d、将步骤C所得提取液用ImoL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3,溫度-4°C下激活12小 时；
[0010] e、将步骤d活化后的提取液用ImoL/L的氨氧化钢溶液调节pH值为5.6,用纱布过 滤，在8000转/分下，离屯、8min，弃渣，上清液利用蒸馈水进行透析脱盐，每化换1次蒸馈水， 透析4她；
[00川 f、将步骤e透析的提取液，在8000转/分下，离屯、8min去除盐溶蛋白，上清液进行冷 冻干燥即得黑羊第四胃有效成分提取物，冷冻保存。
[0012] 所述的方法获得的黑羊第四胃有效成分提取物在制备治疗或预防各种胃病相关 的药物中的用途。
[0013] 所述的方法获得的黑羊第四胃有效成分提取物在制备治疗或预防各种胃病的保 健品中的用途。
[0014] 本发明所述的一种黑羊第四胃有效成分提取物的制备方法，采用了 W凝乳酶活 性、胃蛋白酶活性、蛋白水解活性为导向的黑羊第四胃有效成分的提取方法，提高了提取分 离过程的准确性;利用液氮粉碎原料的方法，可W更好的保存黑羊第四胃的活性成分，同时 使原料粉碎的更加完全，有利于有效成分的溶出；根据黑羊第四胃中活性成分易溶于憐酸 盐缓冲液，且憐酸盐缓冲液ph稳定不易变动的特性，W及参阅黑羊第四胃活性成分最适ph 的相关资料后，最终采用了憐酸盐缓冲溶液进行提取，透析脱盐使盐溶性蛋白质沉淀的方 法，可W有效的去除盐溶性杂蛋白，本发明所述方法与传统黑羊第四胃提取方法相比，提高 了提取物中活性成分的活性和纯度；W最大程度保留活性成分为前提，采用十二烷基硫酸 钢-聚丙締酷胺凝胶-考马斯亮蓝染色法分析，W已知指标成分作为参照，选择最佳的提取 方法。
[0015] 本发明所述的一种黑羊第四胃有效成分提取物的制备方法，将所得提取物进行常 规测定，包括蛋白质含量测定，凝乳酶活性测定，胃蛋白酶活性测定，蛋白水解活力测定，利 用十二烷基硫酸钢-PAGE确定提取物蛋白质种类。通过本发明所述方法获得的黑羊第四胃 有效成分提取物中，蛋白质含量占提取物的64.3%，凝乳酶活性为25182Ru/g，胃蛋白酶活 性为3796.4u/g，蛋白水解活力为4641. lu/g，十二烷基硫酸钢-聚丙締酷胺凝胶电泳图中凝 乳酶及胃蛋白酶条带清晰。
[0016] 本发明的制备方法得到的黑羊第四胃有效成分提取物，其蛋白质纯度高、生物活 性强，而且提取方法简单可行，提取全程在低溫环境下操作，更好的保留了黑羊胃提取物的 活性成分，可应用于作为治疗或预防各种胃病相关的药物或保健品的制备原料。
【附图说明】
[0017] 图1为本发明工艺流程图，1，2，3，4，5，6，7，8分别代表实施例1，实施例2，实施例3， 实施例4，实施例5，实施例6，实施例7，实施例8。
[0018] 图2为本发明二哇嘟甲酸法测定蛋白质浓度的标准曲线，其中方程式为：y = 197.34χ2+432.1 lx-110.2，相关系数为0.9991。
[0019] 图3为本发明蛋白质浓度测定结果对比图，其中1-4为氯化钢溶液提取，1为揽拌粉 碎提取、2为液氮粉碎提取、3为揽拌粉碎提取并去除盐溶蛋白、4为液氮粉碎提取并去除盐 溶蛋白。5-8为憐酸盐缓冲液作为提取液的黑羊第四胃有效成分提取物，5为揽拌粉碎提取、 6为液氮粉碎提取、7为揽拌粉碎提取并去除盐溶蛋白、8为液氮粉碎提取并去除盐溶蛋白。
[0020] 图4为本发明凝乳酶活性测定结果对比图，其中1-4为氯化钢溶液提取，1为揽拌粉 碎提取、2为液氮粉碎提取、3为揽拌粉碎提取并去除盐溶蛋白、4为液氮粉碎提取并去除盐 溶蛋白。5-8为憐酸盐缓冲液作为提取液的黑羊第四胃有效成分提取物，5为揽拌粉碎提取、 6为液氮粉碎提取、7为揽拌粉碎提取并去除盐溶蛋白、8为液氮粉碎提取并去除盐溶蛋白。
[0021] 图5为本发明胃蛋白酶活性测定结果对比图，其中1-4为氯化钢溶液提取，1为揽拌 粉碎提取、2为液氮粉碎提取、3为揽拌粉碎提取并去除盐溶蛋白、4为液氮粉碎提取并去除 盐溶蛋白。5-8为憐酸盐缓冲液作为提取液的黑羊第四胃有效成分提取物，5为揽拌粉碎提 取、6为液氮粉碎提取、7为揽拌粉碎提取并去除盐溶蛋白、8为液氮粉碎提取并去除盐溶蛋 白。
[0022] 图6为本发明酪氨酸标准曲线，其中方程式为：y = 0.01x+0.018,相关系数为 0 · 9990 〇
[0023] 图7为本发明蛋白水解活力测定结果对比图，其中1-4为氯化钢溶液提取，1为揽拌 粉碎提取、2为液氮粉碎提取、3为揽拌粉碎提取并去除盐溶蛋白、4为液氮粉碎提取并去除 盐溶蛋白。5-8为憐酸盐缓冲液作为提取液的黑羊第四胃有效成分提取物，5为揽拌粉碎提 取、6为液氮粉碎提取、7为揽拌粉碎提取并去除盐溶蛋白、8为液氮粉碎提取并去除盐溶蛋 白。
[0024] 图8为本发明十二烷基硫酸钢-聚丙締酷胺凝胶凝胶电泳-考马斯亮蓝染色图，其 中1为氯化钢揽拌粉碎提取物，2为氯化钢液氮粉碎提取物，3为氯化钢揽拌粉碎并去除盐溶 蛋白提取物，4为氯化钢液氮粉碎并去除盐溶蛋白提取物，Μ为标准蛋白标记(其中从上往下 数第7条带为胃蛋白酶标品），8为憐酸盐缓冲液液氮粉碎并去除盐溶蛋白提取物，7为憐酸 盐缓冲液揽拌粉碎并去除盐溶蛋白提取物，6为憐酸盐缓冲液揽拌粉碎提取物，5为憐酸盐 缓冲液液氮粉碎提取物，。
[0025] 图9为本发明十二烷基硫酸钢-聚丙締酷胺凝胶凝胶电泳-考马斯亮蓝染色图，其 中Β为凝乳酶标准品，3为氯化钢揽拌粉碎并去除盐溶蛋白提取物，4为氯化钢液氮粉碎并去 除盐溶蛋白提取物8为憐酸盐缓冲液液氮粉碎并去除盐溶蛋白提取物，7为憐酸盐缓冲液揽 拌粉碎并去除盐溶蛋白提取物，Μ为标准蛋白标记(其中从上往下数第7条带为胃蛋白酶标 品）。
【具体实施方式】：
[0026] 实施例1(对照1)
[0027] a、取新鲜黑羊第四胃，利用预冷的蒸馈水流水清洗，剥除脂肪及结缔组织，溫度- 24°C下冷冻保存；
[00%] b、取50克冷冻保存的黑羊第四胃，剪碎，溫度-4°C下加入石油酸机械揽拌进行脱 月旨，脱脂2次；
[0029] C、脱脂后提取物加入15倍体积的6%氯化钢溶液溶解，用揽拌机揽拌10分钟，溫 度-4 °C下自溶48小时；
[0030] d、将步骤C所得提取液用ImoL/L的盐酸溶液调节PH值为3.3,溫度-4°C下激活12小 时；
[0031] e、将步骤d活化后的提取液用ImoL/L的氨氧化钢溶液调节pH值为5.6,用纱布过 滤，在8000转/分下，离屯、8分钟，弃渣，上清液利用蒸馈水进行透析脱盐，每2小时换一次蒸 馈水，透析48小时；
[0032] f、将步骤e透析的提取液冷冻干燥即得黑羊第四胃有效成分提取物，冷冻保存。得 冻干品1.25克，即黑羊第四胃活性成分提取率为2.5%。
[0033] 实施例2(对照2)
[0034] a、取新鲜黑羊第四胃，利用预冷的蒸馈水流水清洗，剥除脂肪及结缔组织，溫度- 24°C下冷冻保存；
[0035] b、取50克冷冻保存的黑羊第四胃，剪碎，溫度-4°C下加入石油酸机械揽拌进行脱 月旨，脱脂2次，然后利用液氮冷冻，研磨粉碎；
[0036] C、脱脂后提取物加入15倍体积的6%氯化钢溶液溶解，揽拌10分钟，溫度-4°C下自 溶48小时；
[0037] d、将步骤C所得提取液用lnK)L/L的盐酸溶液调节PH值为3.3，-4°C下激活12小时；
[0038] 6、将步骤(1活化后的提取液用1111〇171^的氨氧化钢溶液调节?制直为5.6，用纱布过 滤，在8000转/分下，离屯、8分钟，弃渣，上清液利用蒸馈水进行透析脱盐，每2小时换一次蒸 馈水，透析48小时；
[0039] f、将步骤e透析的提取液冷冻干燥即得黑羊第四胃有效成分提取物，冷冻保存。得 冻干品1.92克，即黑羊第四胃活性成分提取率为3.8%。
[0040] 实施例3(对照3)
[0041] a、取新鲜黑羊第四胃，利用预冷的蒸馈水流水清洗，剥除脂肪及结缔组织，溫度- 24°C下冷冻保存；
[0042] b、取50克冷冻保存的黑羊第四胃，剪碎，溫度-4°C下加入石油酸机械揽拌进行脱 月旨，脱脂2次；
[0043] C、脱脂后提取物加入15倍体积的6%氯化钢溶液溶解，用揽拌机揽拌10分钟，溫 度-4 °C下自溶48小时；
[0044] d、将步骤C所得提取液用ImoL/L的盐酸溶液调节PH值为3.3,溫度-4°C下激活12小 时；
[0045] 6、将步骤(1活化后的提取液用1111〇171^的氨氧化钢溶液调节?制直为5.6，用纱布过 滤，在8000转/分下，离屯、8分钟，弃渣，上清液利用蒸馈水进行透析脱盐，每2小时换一次蒸 馈水，透析48小时；
[0046] f、将步骤e透析的提取液，在8000转/分下，离屯、8分钟去除盐溶蛋白，上清液进行 冷冻干燥即得黑羊第四胃有效成分提取物，冷冻保存。得冻干品0.81克，即黑羊第四胃活性 成分提取率为1.6%。
[0047] 实施例4(对照4)
[0048] a、取新鲜黑羊第四胃，利用预冷的蒸馈水流水清洗，剥除脂肪及结缔组织，溫度- 24°C下冷冻保存；
[0049] b、取50克冷冻保存的黑羊第四胃，剪碎，溫度-4°C下加入石油酸机械揽拌进行脱 月旨，脱脂2次，然后利用液氮冷冻，研磨粉碎；
[0050] C、脱脂后提取物加入15倍体积的6%氯化钢溶液溶解，用揽拌机揽拌10分钟，溫 度-4 °C下自溶48小时；
[0051] d、将步骤C所得提取液用ImoL/L的盐酸溶液调节PH值为3.3,溫度-4°C下激活12小 时；
[0052] 6、将步骤(1活化后的提取液用1111〇171^的氨氧化钢溶液调节?制直为5.6，用纱布过 滤，在8000转/分下，离屯、8分钟，弃渣，上清液利用蒸馈水进行透析脱盐，每2小时换一次蒸 馈水，透析48小时；
[0053] f、将步骤e透析的提取液，在8000转/分下，离屯、8分钟去除盐溶蛋白，上清液进行 冷冻干燥即得黑羊第四胃有效成分提取物，冷冻保存。得冻干品1.51克，即黑羊第四胃活性 成分提取率为3.0%。
[0054] 实施例5(对照5)
[0055] a、取新鲜黑羊第四胃，利用预冷的蒸馈水流水清洗，剥除脂肪及结缔组织，溫度- 24°C下冷冻保存；
[0056] b、取50克冷冻保存的黑羊第四胃，剪碎，溫度-4°C下加入石油酸机械揽拌进行脱 月旨，脱脂2次；
[0057] C、脱脂后提取物加入15倍体积的憐酸盐缓冲液(O.lmoL/L，地=5.6)溶解，用揽拌 机揽拌10分钟，溫度-4 °C下自溶48小时；
[005引d、将步骤C所得提取液用ImoL/L的盐酸溶液调节PH值为3.3,溫度-4°C下激活12小 时；
[0059] 6、将步骤(1活化后的提取液用1111〇171^的氨氧化钢溶液调节?制直为5.6，用纱布过 滤，在8000转/分下，离屯、8分钟，弃渣，上清液利用蒸馈水进行透析脱盐，每2小时换一次蒸 馈水，透析48小时；
[0060] f、将步骤e透析的提取液冷冻干燥即得黑羊第四胃有效成分提取物，冷冻保存。得 冻干品2.53克，即黑羊第四胃活性成分提取率为5.0%。
[0061] 实施例6 (对照6)
[0062] a、取新鲜黑羊第四胃，利用预冷的蒸馈水流水清洗，剥除脂肪及结缔组织，溫度- 24°C下冷冻保存；
[0063] b、取50克冷冻保存的黑羊第四胃，剪碎，溫度-4°C下加入石油酸机械揽拌进行脱 月旨，脱脂2次，然后利用液氮冷冻，研磨粉碎；
[0064] C、脱脂后提取物加入15倍体积的憐酸盐缓冲液(O.lmoL/L，地=5.6)溶解，揽拌10 分钟，溫度-4 °C下自溶48小时；
[0065] d、将步骤C所得提取液用ImoL/L的盐酸溶液调节PH值为3.3,溫度-4°C下激活12小 时；
[0066] 6、将步骤(1活化后的提取液用1111〇171^的氨氧化钢溶液调节?制直为5.6，用纱布过 滤，在8000转/分下，离屯、8分钟，弃渣，上清液利用蒸馈水进行透析脱盐，每2小时换一次蒸 馈水，透析48小时；
[0067] f、将步骤e透析的提取液冷冻干燥即得黑羊第四胃有效成分提取物，冷冻保存。得 冻干品3.02克，即黑羊第四胃活性成分提取率为6.0%。
[006引实施例7 (对照7)
[0069] a、取新鲜黑羊第四胃，利用预冷的蒸馈水流水清洗，剥除脂肪及结缔组织，溫度- 24°C下冷冻保存；
[0070] b、取50克冷冻保存的黑羊第四胃剪碎，溫度-4°C下加入石油酸机械揽拌进行脱 月旨，脱脂2次；
[0071] 〇、脱脂后提取物加入15倍体积的憐酸盐缓冲液(0.1111化/1，地=5.6)溶解，用揽拌 机揽拌10分钟，溫度-4 °C下自溶48小时；
[0072] d、将步骤C所得提取液用ImoL/L的盐酸溶液调节PH值为3.3,溫度-4°C下激活12小 时；
[0073] 6、将步骤(1活化后的提取液用1111〇171^的氨氧化钢溶液调节?制直为5.6，用纱布过 滤，在8000转/分下，离屯、8分钟，弃渣，上清液利用蒸馈水进行透析脱盐，每2小时换一次蒸 馈水，透析48小时；
[0074] f、将步骤e透析的提取液，在8000转/分下，离屯、8分钟去除盐溶蛋白，上清液进行 冷冻干燥即得黑羊第四胃有效成分提取物，冷冻保存。得冻干品2.06克，即黑羊第四胃活性 成分提取率为4.1%。
[00巧]实施例8
[0076] a、取新鲜黑羊第四胃，利用预冷的蒸馈水流水清洗，剥除脂肪及结缔组织，溫度- 24°C下冷冻保存；
[0077] b、取50克冷冻保存的黑羊第四胃，剪碎，溫度-4°C下加入石油酸机械揽拌进行脱 月旨，脱脂2次，然后利用液氮冷冻，研磨粉碎；
[007引。、将步骤6脱脂后提取物加入15倍体积的憐酸盐缓冲液0.1111化/1，地=5.6溶解， 揽拌10分钟，溫度-4 °C下自溶48小时；
[0079] d、将步骤C所得提取液用ImoL/L的盐酸溶液调节pH值为3.3,溫度-4°C下激活12小 时；
[0080] e、将步骤d活化后的提取液用ImoL/L的氨氧化钢溶液调节pH值为5.6,用纱布过 滤，在8000转/分下，离屯、8分钟，弃渣，上清液利用蒸馈水进行透析脱盐，每2小时换一次蒸 馈水，透析48小时；
[0081] f、将步骤e透析的提取液，在8000转/分下，离屯、8分钟去除盐溶蛋白，上清液进行 冷冻干燥即得黑羊第四胃有效成分提取物，冷冻保存。得冻干品2.59克，即黑羊第四胃活性 成分提取率为5.2%。
[0082] 实施例9
[0083] 蛋白质浓度的测定：
[0084] 利用二哇嘟甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定实施1-8所得黑羊胃提取物中 蛋白质浓度：
[0085] 标准曲线的绘制:根据BCA蛋白测量试剂盒说明书操作配制工作液，每50倍体积的 BCA试剂A溶液力日1倍体积的BCA试剂B溶液，充分混匀备用;根据表1吸取试剂盒中蛋白标准 品牛血清蛋白，用水稀释，摇匀，各管分别取25化于96孔板中，各加入17化L BCA工作液，轻 微振荡，混匀，于溫度37°C恒溫箱中溫育30分钟，取出96孔板，用酶标仪测定吸光度，ii定波 长为562nm。每个做Ξ组平行，W吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标进行回归运算；
[0086] 表1、系列稀释牛血清白蛋白（BSA)标准品
[0087]
[0088] 巧化的测足：
[0089] 精确称取2.5毫克样品，加入ImL蒸馈水溶解，10000转/分离屯、2分钟，按照标准曲 线操作方法，取SSiiL样品溶液于96孔板中，各加入17扣L BCA工作液，轻微振荡，混匀，于溫 度37°C恒溫箱中溫育30分钟，取出96孔板，用酶标仪测定吸光度，测定波长为562nm，每个样 品做Ξ组平行，按照标准曲线计算蛋白质的含量；
[0090] 实验结果：
[0091 ]由图3及表2可知，不管何种溶液提取，利用液氮研磨对原料处理的提取物蛋白质 含量高于揽拌方法处理原料所得提取物;采用同一种原料处理方法的提取物，利用憐酸盐 缓冲液提取的蛋白质含量高于利用氯化钢提取;去除盐溶蛋白后蛋白质含量减少。因此，利 用液氮研磨方法粉碎原料，用憐酸盐缓冲液提取所得提取物蛋白质含量最高，可达1965.66 yg/mL，占提取物的78.6%，去除盐溶蛋白后，蛋白含量减少，最终实施例8本发明的提取方 法所得蛋白质占提取物比率为64.3 %。
[0092]表2、有效成分及蛋白质提取率
[0093]
[0094] 实施例10
[OOM]凝乳酶活性测定：
[0096] 对实施1-8所得黑羊第四胃有效成分提取物进行凝乳酶活力测定；
[0097] 底物溶液的制备：取全脂奶粉12克，加入氯化巧溶液（取醋酸钢1.25克，氯化巧 0.55克，加水定容至500血，调节曲值至6.3 ±0.1 )，研磨均匀后用氯化巧溶液定容至100血， 摇匀，本溶液现用现配；
[0098] 标准品溶液的制备:精密称取12毫克凝乳酶标准品，滴入几滴抑=6.3憐酸盐缓冲 液（取憐酸二氨钢7.8克，憐酸二氨钢2.7克，加水溶解定容至lOOOmL，调节ph值为6.3 ± 0.5)，润湿研磨后加入缓冲液定容至lOmL，即得到每ImL约含1.06个活力单位(约在240秒内 凝结)的标准品溶液，溫度4°C保存，在配置2小时后使用；
[0099] 样品溶液的制备:将实施1-8所得提取物分别精密称取10毫克，照标准品溶液制备 方法配置5mL，既浓度为2mg/mL的样品溶液；
[0100] 样品测定:精密量取底物溶液1 OmL，置于试管中，在溫度30°C ( ±0.5°C )恒溫水浴 中溫预10分钟，精密加入标准品溶液ImL，摇匀并立即计时，用玻璃棒不薩取溶液沿管壁留 下，使成均匀薄层，当薄层出现片状凝结时，截止计时，记录下时间，重复测定3次，3次测定 值得相对标准偏差不得大于5%，取3次的平均值作为标准品溶液的凝结时间，取样品溶液 ImL，分别按上述方法操作，按下式计算：
[0101]
[0102] 式中S为标准品的活力，Ru/mg;Ts为标准品溶液的平均凝结时间，秒;T为样品溶液 的平均凝结时间，秒;Ws为标准品溶液每ImL中含凝乳酶标准品的量，g;W为样品取样量，g;N 为样品稀释倍数。
[0103] 实验结果：
[0104] 如图4所示，利用液氮研磨的原料处理方法可提高凝乳酶活性，去除盐溶蛋白后， 凝乳酶活性显著提高，说明该方法起到了浓缩纯化的作用。通过本发明方法实施例8,凝乳 酶活性可达25182Ru/g。
[010引实施例11
[0106]胃蛋白酶活力的测定：
[0107]按照药典方法，对实施1-8所得黑羊第四胃有效成分提取物进行胃蛋白酶活力测 定：
[010引对照品溶液的制备:精密称取酪氨酸(经溫度105°C±0.5°C干燥，至恒重)50毫克， 加盐酸溶液(取Imol/L盐酸溶液65mL，加水至lOOOmL)定容至ΙΟΟιΛ;
[0109] 样品的制备:分别取实施1-8所得黑羊第四胃有效成分提取物，精密称定，用盐酸 溶液制成每ImL中含有2毫克样品的溶液；
[0110] 测定法:每一个提取物样品均做3次平行，按下列方法测定。取3支试管各加入对照 品溶液ImL，另取3支各精密加入样品溶液ImL，置溫度37 °C ( ± 0.5 °C)水浴中，保溫5分钟，精 密加入预热至溫度37 °C ( ± 0.5°C )的血红蛋白试液5mL，摇匀，在溫度37 °C ( ± 0.5 °C )水浴锅 中反应10分钟，立即加入浓度为5%Ξ氯醋酸溶液5mL，摇匀，过滤，滤液备用；另取试管2支， 各加入血红蛋白试液5mL，置溫度37°C(±0.5°C)水浴中保溫10分钟，再加入浓度为5%Ξ氯 醋酸溶液5mL，其中1支加样品溶液ImL，摇匀过滤，滤液备用，作为样品对照；另1支加上述盐 酸溶液ImL，摇匀，过滤，滤液备用，作为对照品的空白对照，用紫外-可见分光光度计在 275nm波长处测定吸光度，算出平均值As和A，按下式计算胃蛋白酶活力(u/g)。
[0111]
[0112] 试中As为对照品的平均吸光度;A为样品的平均吸光度;化为每ImL对照品溶液中含 酪氨酸的量，yg;W为样品取样量，g;n为样品稀释倍数。
[011引实验结果：
[0114]如图5所示，利用氯化钢作为提取液所得的黑羊第四胃有效成分提取物中，胃蛋白 酶活性低，其中液氮处理原料的方法可提高胃蛋白酶活性。而利用憐酸盐缓冲液提取的黑 羊第四胃有效成分提取物，胃蛋白酶活性明显高于氯化钢溶液提取的提取物，且液氮处理 原料的方法可提高胃蛋白酶活性，去除盐溶杂蛋白后，胃蛋白酶活性增加。因此，利用本发 明方法实施例8所得提取物胃蛋白酶活性为3796.4u/g。
[011引实施例12
[0116] 蛋白水解活力的测定：
[0117] 利用福林-酪法测定实施1-8所得黑羊胃有效成分提取物中蛋白水解活力：
[0118] 标准曲线的绘制:取6支试管，按表3规定的体积加入蒸馈水与酪氨酸标准液，即得 不同浓度的酪氨酸标准溶液;从不同浓度的酪氨酸标准溶液中各吸出ImL，移入另外的6支 试管中，各加入0.4moL/L碳酸钢溶液5mL，福林试剂ImL，摇匀后置于溫度40°C ( ±0.2°C )水 浴中，显色10分钟后，在680nm波长处测定吸光度，W吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横 坐标，绘制标准曲线。
[0119] 表3、酪氨酸标准溶液
[0120]
[0121] 样品测定：
[0122] 实施1-8所得黑羊胃提取物，每个提取物均按下列操作测定;精密称取样品20毫 克，精确至0.0002克，用少量蒸馈水溶解，混匀，10000转/分离屯、2分钟，倒出上清液，沉渣部 分再加入少量水溶解，摇匀，离屯、，如此反复3次，将上清液移入lOmL容量瓶中，用水定容，摇 匀;取4支试管，各加入ImL酶液，取1支作为空白，加入5mL质量浓度为0.44g/L的Ξ氯乙酸溶 液，其他3管作为测试管，各加入5mL酪素摇匀后置于溫度35°C水浴中保溫10分钟，取出试 管，3支测试管中各加入5mL质量浓度0.44g/L的Ξ氯乙酸，空白管中加入5mL酪素，继续保溫 10分钟，过滤沉淀，各取上清2mL，加5mL浓度为0.55moL/L的碳酸钢，ImL福林-酪试剂，于溫 度35°C水浴中显色20分钟，再用紫外分光光度计于660nm波长处测定吸光度。按下列公式计 算蛋白水解活力：
[0123]
[0124] 式中:A为66化m处平均吸光度值;K为标准曲线中吸光度为1的酪氨酸量(yg/mU ;4 为酶促反应总体积(mU;10为反应时间(分钟）;n为酶液的稀释倍数。
[0125] 实验结果：
[0126] 由图7知，不管何种溶液提取，利用液氮研磨对原料处理的提取物蛋白水解活力均 高于揽拌方法处理原料所得提取物;采用同一种原料处理方法的提取物，利用憐酸盐缓冲 液提取的蛋白水解活力高于利用氯化钢提取;去除盐溶蛋白后蛋白水解活力明显提高，可 能是因为杂蛋白去除后起到了纯化浓缩的作用。利用本发明方法实施例8所得提取物蛋白 水解活力最高，水解活力可达4641. lu/g，说明凝乳酶及胃蛋白酶活性均高。
[0127] 实施例13
[01%]蛋白质种类的确定：
[01巧]试剂配制及样品处理：
[0130] 样品缓冲液:0.5mLS径甲基氨基甲烧与盐酸混合缓冲液0.5moL/L pH= 6.8、2mL 的10 %十二烷基硫酸钢、ImL甘油、0.5mL的β-琉基乙醇、ImL的水、微量的漠酪蓝；
[0131] 样品的处理:精密称取样品3毫克溶于ImL蒸馈水中，摇匀，与样品缓冲液等体积混 合，隔水煮沸10分钟，10000转/分，离屯、5分钟；
[0132] 电极缓冲液:将15.1克Ξ径甲基氨基甲烧、94克甘氨酸、50mL的10 %十二烷基硫酸 钢溶解并定容至化；
[0133] 十二烷基硫酸钢-聚丙締酷胺凝胶储存液:30% (W/V)超纯级丙締酷胺、0.8% (W/ V)N，N-亚甲双丙締酷胺；
[0134] 12%十二烷基硫酸钢-聚丙締酷胺凝胶的分离胶配制：3.3mL的此0、4mL的30%(V/ V)十二烷基硫酸钢-聚丙締酷胺凝胶储存液、2.5血的1.5nK)L/L的Ξ径甲基氨基甲烧与盐酸 混合缓冲液(pH=8.8)、0.1 mL的10% (W/V)十二烷基硫酸钢、0.1 mL的10% (W/V)过硫酸锭、 0.006mL的四甲基乙二胺；
[0135] 5%十二烷基硫酸钢-聚丙締酷胺凝胶的积层胶配制:0.681^的此0、0.171^的30% (V/V)十二烷基硫酸钢-聚丙締酷胺凝胶储存液、0.13mLS径甲基氨基甲烧与盐酸混合缓冲 液(0.5moL/L 抑= 6.8)、0.01mL的 10%(W/V)十二烷基硫酸钢、O.OlmL的 10%(W/V)过硫酸 锭、O.OOlmL的四甲基乙二胺；
[0136] 电泳条件:恒压75伏，40分钟，然后恒压150伏，90分钟；
[0137] 考马斯亮蓝固定液:25 %异丙醇、10 %的冰醋酸、65 %水；
[0138] 考马斯亮蓝染色液:将0.6克的考马斯亮蓝R-250溶解在300mL的固定液中，过滤， 栋色瓶储存；
[0139] 考马斯亮蓝脱色液:5 %甲醇、7 %的冰醋酸、88 %水；
[0140] 电泳结束后将凝胶片置于固定液中固定2小时，然后放入考马斯亮蓝染色液中，置 于摇床上染色2小时，再用脱色液浸泡至背景色稱色完全为止；
[0141] 实验结果：
[0142] 由图8所示，未去除盐溶蛋白的提取物蛋白条带多，去除之后条带明显减少，运与 蛋白含量测定结果一致，同时去除盐溶蛋白的提取物凝乳酶及胃蛋白酶条带更加明显，说 明去除盐溶蛋白起到了纯化浓缩的作用。如图9所示，去除盐溶蛋白的四条条带中，本发明 方法实施例8所得提取物凝乳酶及胃蛋白酶条带均很明显，漂亮，运与凝乳酶活性测定结 果，胃蛋白酶活性结果及蛋白水解活力的测定结果一致。
【主权项】
1. 一种羔羊第四胃有效成分提取物的制备方法，其特征在于按下列步骤进行： a、 取新鲜羔羊第四胃，利用预冷的蒸馏水流水清洗，剥除脂肪及结缔组织，温度-24 °C 下冷冻保存； b、 将步骤a所得羔羊第四胃剪碎，在温度-4 °C下加入石油醚机械搅拌进行脱脂2次，脱 脂后利用液氮冷冻，研磨粉碎； c、 将步骤b所得脱脂羔羊第四胃加入15倍体积预冷过的磷酸盐缓冲液0.1 m〇L/L，ph= 5.6溶解，温度-4 °C下自溶48小时； (1、将步骤(：所得提取液用1111〇171的盐酸溶液调节?田直为3.3，温度-4°(：下激活121 1; e、 将步骤d活化后的提取液用1 moL/L的氢氧化钠溶液调节pH值为5.6，用纱布过滤，在 8000转/分下，离心8 min，弃渣，上清液利用蒸馏水进行透析脱盐，每2h换1次蒸馏水，透析 48 h； f、 将步骤e透析的提取液，在8000转/分下，离心8 min去除盐溶蛋白，上清液进行冷冻 干燥即得羔羊第四胃有效成分提取物，冷冻保存。2. 根据权利要求1所述的方法获得的羔羊第四胃有效成分提取物在制备治疗或预防各 种胃病相关的药物中的用途。3. 根据权利要求1所述的方法获得的羔羊第四胃有效成分提取物在制备治疗或预防各 种胃病的保健品中的用途。
【文档编号】C12N9/64GK106011115SQ201610431827
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月17日
【发明人】阿布力米提·伊力, 阿吉艾克拜尔·艾萨, 刘冰
【申请人】中国科学院新疆理化技术研究所