专利名称：羔羊皱胃酶超声提取方法
技术领域：
本发明属于酶技术领域，具体涉及到从动物组织得到的蛋白酶。
背景技术：
皱胃酶在干酪生产中的应用可追朔到19世纪以前，起初人们用羊胃盛装鲜奶时发现放置一段时间后，奶就凝固，知道羊胃具有凝固作用。此后，人们就将羊胃在乳清中浸泡，利用浸泡过的乳清生产干酪，这便开始了早期皱胃酶的应用。到20世纪20年代，皱胃酶提取技术得到较大发展，30年代已进入商业化生产阶段，除了生产液体皱胃酶外，还能生产一些粉剂、片剂，使皱胃酶应用范围进一步扩大。50年代后，皱胃酶提取方法已达数十种，各国研究人员对提取方法不断加以改进，并纷纷取得专利，传统皱胃酶提取方法趋于成熟。目前，全世界有丹麦汉森实验室、新西兰皱胃酶公司等九个专业集团专门生产小牛皱胃酶，其中汉森实验室规模最大，年生产标准小牛皱胃酶200多吨。由于皱胃酶来自动物胃粘膜，主要用NaCl浸提，在干酪中应用不会对人体产生不良影响，联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)于1973年制定的食品添加剂安全评价表中已对皱胃酶作出了安全评价，即皱胃酶人体每日允许摄入量“不需要特殊规定”，这说明皱胃酶是一种安全无毒的天然食品添加剂。
在干酪生产中，把能够起凝乳作用的一类蛋白酶统称为凝乳酶，包括动物凝乳酶，有小牛皱胃酶、羔羊皱胃酶、胃蛋白酶等；植物凝乳酶，有木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶等；微生物凝乳酶，有细菌凝乳酶、毛霉凝乳酶等；重组凝乳酶，主要利用大肠杆菌克隆表达。上述的几种酶中，皱胃酶是应用最早效果最好的凝乳酶。传统皱胃酶是从哺乳小牛第四胃即皱胃中提取的，在干酪生产中已广泛应用。近年来，随着世界干酪产量的逐年增加，皱胃酶的需求量也越来越大，致使每年要屠宰3000多万头小牛提取小牛皱胃酶，仍不能满足干酪生产需要。自20世纪60年代以来，全世界范围内已出现皱胃酶的短缺，导致皱胃酶价格上涨，供不应求。世界各国都在寻找皱胃酶的代用品，胃蛋白酶、植物凝乳酶和微生物凝乳酶在干酪生产中都被使用过，但这些代用品大多存在一些缺陷，在正常牛乳pH值中不够稳定，活性较低，易使蛋白水解，干酪出品率低，且易产生苦味。猪胃蛋白酶、牛胃蛋白酶曾被认为是较好的皱胃酶代用品，但单独使用效果不够理想，必须与小牛皱胃酶混合使用。植物凝乳酶由于具有较强的蛋白水解活性和较低的凝乳活性，在干酪生产中应用较少。微生物凝乳酶是一种具有应用前景的皱胃酶代用品，由于具有较高的热稳定性，造成乳清处理困难，这类酶在英美国家使用较多，但在欧洲一些国家被禁止使用。近年来，随着生物技术的迅速发展，人们已能从一些微生物如大肠杆菌中克隆生产重组凝乳酶，并证明与天然小牛皱胃酶具有十分相似的功能和特性，但受到一些消费者和一些国家的文明限制。小牛皱胃酶是干酪生产中应用最早的蛋白酶，用其生产的干酪在风味、质量和产量等方面都优于其它酶类，至今仍是干酪生产者首选的凝乳酶。羔羊和小牛同属反刍动物，其皱胃具有相似的特点和功能，用羔羊皱胃提取皱胃酶在干酪生产完全可与小牛皱胃酶相比拟，只是由于羔羊皱胃较小，没有受到人们的重视。
我国土地面积辽阔，羔羊皱胃并不匮乏，传统养羊业生产中，用于生产羔皮和裘皮的羔羊及一些奶山羊的公羔一般都在30日龄前屠宰，其下角料——皱胃是生产羔羊皱胃酶的优质原料。近年来，随着羔羊肉消费量的增加，羔羊屠宰数量大幅度提高，据不完全统计，我国每年屠宰的羔羊大约有400～500万只。利用这些资源提取羔羊皱胃酶，可变废为宝，增加当地农牧民的经济收入，同时也不会造成环境污染，不与其它行业争夺原料，当前可应急我国干酪生产所需的皱胃酶，长远可取代进口，降低干酪生产成本，促进我国干酪生产普及和发展。
我国是一个后起的乳业生产大国，干酪规模化生产是近年来才发展起来的，随着我国对外交流的进一步扩大和加入WTO后面临的挑战，干酪生产和消费逐年上升，但所需的皱胃酶全靠进口，而且对皱胃酶的开发利用研究起步较晚，报道很少，特别是对羔羊皱胃酶的系统研究还是空白。传统皱胃酶通常采用犊牛皱胃为原料，在5～10％的盐溶液中需要浸提2～3天才能完成提取过程，由于提取时间长，提取效率较低，特别是在提取温度较高的环境中，微生物污染程度较大，甚至使皱胃原料腐败变质，影响产品质量。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种操作简单、提取效率高、提取时间短、产品质量好的羔羊皱胃酶超声提取方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是它包括下述工艺步骤1、羔羊皱胃的预处理羔羊屠宰后，立即取出皱胃，用流水冲洗1～2分钟除出内容物，然后剥除皱胃外部的脂肪及结缔组织，在-24℃下冷冻备用。
2、切碎羔羊皱胃用绞肉机将羔羊皱胃切成0.001～0.01cm3的羔羊皱胃块。
3、超声提取在pH值为2.0～5.0的磷酸盐缓冲液中添加2～10％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，使羔羊皱胃块与缓冲液的重量比为1∶10～25，在超声频率为20KHz、超声强度为20～45W/cm2下，提取20～50分钟，并保持提取液温度20～25℃。
4、离心分离将超声提取后的混合液装入离心机中，在3000～4000转/分离心15分钟，去除杂质，取上清液。
5、激活经离心后的上清液用0.1mol/L HCl调整pH至4.6，在室温下激活24小时，得羔羊皱胃酶粗提液。
6、羔羊皱胃酶激活后的羔羊皱胃酶粗提液再装入离心机中，在3000～4000转/分再离心15～30分钟，以除去杂蛋白，然后再将其pH调整至5.3～6.0，即为提取的液态羔羊皱胃酶。
本发明的超声提取工艺步骤中，在pH值的优选范围为3.0～5.0的磷酸盐缓冲液中添加优选配比为5～10％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，使羔羊皱胃块与缓冲液的优选重量比为1∶10～20，在超声频率为20KHz、超声强度的优选范围为30～40W/cm2下，提取的优选时间范围为30～40分钟，并保持提取液温度20～25℃。
本发明的超声提取工艺步骤中，在pH的最佳值为4.0的磷酸盐缓冲液中添加最佳配比为8％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，使羔羊皱胃块与缓冲液的重量比为1∶15，在超声频率为20KHz、超声强度最佳为40W/cm2下，提取的最佳时间为40分钟，并保持提取液温度20～25℃。
本发明采用出生3周内的羔羊皱胃为原料，应用超声波在溶液中产生的空化效应作用，破坏皱胃细胞结构，加速提取液在溶液中的渗透速度和细胞中酶的溶出速度，大大缩短了提取时间。超声提取20～50分钟可达到传统方法提取2～3天的酶活性产量，且产品微生物污染程度较低。该方法具有操作简单、提取效率较高、产品质量较好等特点，可在食品工业生产中推广使用。
图1是试验因素与试验指标关系图。
图中试验因素为横坐标，羔羊皱胃酶活性为纵坐标。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1本实施例的羔羊皱胃酶超声提取方法的工艺步骤如下1、羔羊皱胃的预处理羔羊屠宰后，立即取出皱胃，用流水冲洗1～2分钟除出内容物，然后剥除皱胃外部的脂肪及结缔组织，在-24℃下冷冻备用。
2、切碎羔羊皱胃用绞肉机将羔羊皱胃切成0.001～0.01cm3的羔羊皱胃块。
3、超声提取在pH值为4的磷酸盐缓冲液中添加8％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，使羔羊皱胃块与缓冲液的重量比为1∶15，在超声频率为20KHz、超声强度为40W/cm2下，提取40分钟，并保持提取液温度20～25℃。
4、离心分离将超声提取后的混合液装入离心机中，在3000～4000转/分离心15分钟，去除杂质，取上清液。
5、激活经离心后的上清液用0.1mol/L HCl调整pH至4.6，在室温下激活24小时，得羔羊皱胃酶粗提液。
6、制备羔羊皱胃酶激活后的羔羊皱胃酶粗提液再装入离心机中，在3000～4000转/分再离心15～30分钟，以除去杂蛋白，然后再将其pH调整至5.3～6.0，即为提取的液态羔羊皱胃酶。
实施例2本实施例的超声提取工艺步骤中，在pH值为2.0的磷酸盐缓冲液中添加2％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，使羔羊皱胃块与缓冲液的重量比为1∶10，在超声频率为20KHz、超声强度为20W/cm2下，提取20分钟，并保持提取液温度20～25℃。本实施例中的其它工艺步骤与实施例1相同。
实施例3本实施例的超声提取工艺步骤中，在pH值为5.0的磷酸盐缓冲液中添加10％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，使羔羊皱胃块与缓冲液的重量比为1∶25，在超声频率为20KHz、超声强度为45W/cm2下，提取50分钟，并保持提取液温度20～25℃。本实施例中的其它工艺步骤与实施例1相同。
实施例4本实施例的超声提取工艺步骤中，在pH值为2.0的磷酸盐缓冲液中添加2％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，使羔羊皱胃块与缓冲液的重量比为1∶10，在超声频率为20KHz、超声强度为20W/cm2下，提取50分钟，并保持提取液温度20～25℃。本实施例中的其它工艺步骤与实施例1相同。
实施例5本实施例的超声提取工艺步骤中，在pH值为5.0的磷酸盐缓冲液中添加2％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，使羔羊皱胃块与缓冲液的重量比为1∶10，在超声频率为20KHz、超声强度为45W/cm2下，提取20分钟，并保持提取液温度20～25℃。本实施例中的其它工艺步骤与实施例1相同。
实施例6本实施例的超声提取工艺步骤中，在pH值为2.0的磷酸盐缓冲液中添加10％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，使羔羊皱胃块与缓冲液的重量比为1∶25，在超声频率为20KHz、超声强度为20W/cm2下，提取20分钟，并保持提取液温度20～25℃。本实施例中的其它工艺步骤与实施例1相同。
实施例7本实施例的超声提取工艺步骤中，在pH值为5.0的磷酸盐缓冲液中添加10％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，使羔羊皱胃块与缓冲液的重量比为1∶25，在超声频率为20KHz、超声强度为45W/cm2下，提取20分钟，并保持提取液温度20～25℃。本实施例中的其它工艺步骤与实施例1相同。
实施例8本实施例的超声提取工艺步骤中，在pH值为2.0的磷酸盐缓冲液中添加10％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，使羔羊皱胃块与缓冲液的重量比为1∶10，在超声频率为20KHz、超声强度为45W/cm2下，提取50分钟，并保持提取液温度20～25℃。本实施例中的其它工艺步骤与实施例1相同。
实施例9本实施例的超声提取工艺步骤中，在pH值为5.0的磷酸盐缓冲液中添加2％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，使羔羊皱胃块与缓冲液的重量比为1∶25，在超声频率为20KHz、超声强度为20W/cm2下，提取50分钟，并保持提取液温度20～25℃。
其它工艺步骤与实施例1相同。
为了确定本发明的工艺步骤的可行性，发明人进行了超声处理时间和强度对羔羊皱胃酶提取活性的影响、NaCl浓度对羔羊皱胃酶提取活性的影响、羔羊皱胃与提取液比例对羔羊皱胃酶提取活性的影响、提取液的pH值对羔羊皱胃酶提取活性的影响、超声提取工艺参数的优化进行了研究试验，为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备的羔羊皱胃酶进行了皱胃酶活性的测定试验、微生物指标的测定、重金属的测定、酶活性保存率的测定、感官性状评定测试，各种试验情况如下1、超声处理时间和强度对羔羊皱胃酶提取活性的影响在浸提液中加入6％NaCl，以羔羊皱胃与提取液之比为1∶10，在不同超声强度下进行提取，测定不同提取时间酶活性，试验结果见表1。
表1 超声处理时间和强度对羔羊皱胃酶提取活性的影响(SU/g)超声处理 超声强度(W/cm2)时间(min)传统方法 510 20 30 4010 19351h23302e 30372g 30763g 37502f 37502g20 23083g27907d 31581f 32000f 38718ef38713fg30 27274f32436d 33332f 34283e 48000d 46156cd40 28342ef 33334cd 34784f 36923e 53333a 53200a50 28233e33803c 35826ef 34000e 53331a 53103a60 32436d34282c 36363e 43632d 52177ab48977b70 33334cd 34780c 38090d 46156c 51063b 48000cd80 33807c35823bc 40000cd 48000bc50000bc48000cd90 34280b36360a 43645b 50000a 48978c 46155cd120 35219b38707a 48000a 50000a 48000d 43640e2d 53204a------- ------ ------ ------ ------3d 53000a------- ------ ------ ------ ------注表中数据系5次测定平均值。相同字母表示P＞0.05，不同字母表示P＜0.01，纵向比较。
由表1可以看出，超声处理时间和强度对羔羊皱胃酶提取活性有很大的影响。从提取时间看，利用超声提取可明显缩短提取时间，传统提取方法提取2天时，酶提取活性最大为53204SU/g(P＜0.01)，在30W/cm2超声强度下，仅需40分钟，提取活性可达53333SU/g，显著高于30分钟提取活性(P＜0.01)。当超声强度小于30W/cm2时，皱胃酶提取活性随提取时间延长逐渐增大；当超声强度大于30W/cm2时，提取活性在较短时间内达到最大，提取时间超过50分钟后，酶活性不仅未升高，反而有下降的趋势，这可能与超声处理时间过长、强度过大时，使已提取的酶部分失活有关。
从超声处理强度看，在提取时间较短、超声强度较小时，随着超声强度的增加，皱胃酶提取活性逐渐升高，当超声强度大于30W/cm2时，皱胃酶提取活性变化不大，这可能是由于在较高的超声处理强度下，皱胃中酶的扩散速度加快，在较短时间内几乎完全提出，若继续提高超声强度，不仅不会增加酶的提取活性，反而会造成酶活性损失。
2、NaCl浓度对羔羊皱胃酶提取活性的影响在提取液中加入NaCl，使其浓度为0％、2％、4％、6％、8％、10％、12％，在30W/cm2超声强度下提取40分钟。
试验结果见表2。
表2 NaCl浓度对羔羊皱胃酶提取活性的影响NaCL浓度(％) 024 68 1012激活前酶活性(SU/g) 6340A9531B12510C16200D19600E22600F24600G激活后酶活性(SU/g) 21030A48201B52343C53402d53135d53276d53315d注数据为5次实验结果的平均值。
由表2可知，羔羊皱胃酶在激活前后提取活性差别较大，激活后活性比激活前活性明显提高(P＜0.01)。在较低NaCl浓度下，激活后提取活性随NaCl浓度增加而提高；当NaCl浓度大于4％时，提取后活性变化不大(P＞0.05)。但在激活前羔羊皱胃酶提取活性随NaCl浓度增加明显增大(P＜0.01)。说明在NaCl存在下，超声处理对羔羊皱胃具有一定的激活作用，可使原来无活性酶原转变为活性的皱胃酶。
3、羔羊皱胃与提取液比例对羔羊皱胃酶提取活性的影响在60g羔羊皱胃中加入6％的NaCl提取液，使其比例为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，在30W/cm2超声强度下提取40分钟。结果表明，随着羔羊皱胃与提取液比例增大，羔羊皱胃酶提取活性逐渐增加，当提取比例小于1∶15时，提取活性增加较快(P＜0.01)；提取比例大于1∶15时，提取活性缓慢增加(P＜0.05)；当提取比例为1∶15时，提取活性占总活性的92％，说明羔羊皱胃中绝大部分羔羊皱胃酶已被提出。此外，提取比例过大时，虽然提取总活性增加，提取较充分，但单位体积羔羊皱胃酶活性较低，不利于产品的保存及干燥。
试验结果见表3。
表3 皱胃与提取液比例对羔羊皱胃酶提取活性的影响提取比例1∶5 1∶10 1∶151∶20 1∶25 1∶30提取活性(SU/g) 53800C58630B69480A71970A73630A74530A注数据为5次实验结果的平均值(激活后)。
4、提取液的pH值对羔羊皱胃酶提取活性的影响用0.1mol/L HCl和0.1mol/L NaOH将提取液的pH值调至1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，在30W/cm2超声强度下提取40分钟，然后将提取液的pH值调至4.6，测定酶活性。
试验结果见表4。
表4 提取液pH对羔羊皱胃酶提取活性的影响提取液pH 1 2 3 4 567提取活性(SU/g) 47205C50235B54230A51620D47630E42030F38201G注数据为5次实验结果的平均值(激活后)。
由表4可知，当提取液的pH值为3.0时，提取羔羊皱胃酶活性最高为54230SU/g；提取液的pH值小于3时，随着pH值增大，提取活性逐之提高(P＜0.01)，而当提取液的pH值大于3时，提取活性下降较快(P＜0.01)，说明在较低pH下用超声提取皱胃酶可获得较高的收率。但pH也不宜过低，否则会引起酶蛋白变性丧失活力。
5、超声提取工艺参数的优化试验在以上单因素提取试验的基础上，为了考虑多因素的综合效应，以超声提取时间，超声强度，NaCl浓度和皱胃与提取液比例为因素，提取活性为试验指标，进行四因素三水平L9(34)正交试验。
试验结果见表5。
表5 超声提取羔羊皱胃酶正交试验提取时间超声强度NaCl浓度(％) 皱胃/提取液 皱胃酶活性试验号(min)A (W/cm2)B CD(SU/g)1 1(30) 1(20) 1(4) 1(1∶15) 20285±1532 1(30) 2(30) 2(6) 2(1∶20) 39269±1043 1(30) 3(40) 3(8) 3(1∶25) 41358±2014 2(40) 1(20) 2(6) 3(1∶25) 30108±1785 2(40) 2(30) 3(8) 1(1∶15) 62947±2136 2(40) 3(40) 1(4) 2(1∶20) 44723±1097 3(50) 1(20) 3(8) 2(1∶20) 32461±1358 3(50) 2(30) 1(4) 3(1∶25) 34793±1659 3(50) 3(40) 2(6) 1(1∶15) 46822±158k136971 27618 33267 43351k245926 45670 38733 38818k338025 44301 45598 35420R 900918052 12331 7931注①提取液pH为3。②表中数据系4次测定平均值。
由表5可以看出，超声处理因素对羔羊皱胃酶提取活性有明显的影响。超声强度极差最大为18052，其次为NaCl浓度和提取时间，皱胃与提取液比例影响最小。方差分析表明，超声强度和NaCl浓度两因素达到极显著水平(P＜0.01)，提取时间达到显著水平(P＜0.05)，皱胃与提取液比例影响不大(P＞0.05)，说明在试验取值范围内，超声强度和NaCl浓度是影响羔羊皱胃酶提取的主要因素，其次为提取时间，皱胃与提取液比例应取最小值。
为了更直观地观察各因素对羔羊皱胃酶提取效果的影响，以试验因素为横坐标，超声提取羔羊皱胃酶活性为纵坐标作因素与试验指标关系图，见图1。
由图1可以看出，超声提取羔羊皱胃酶最优组合为A2B2C3D1，即超声提取时间为40min，超声强度为30W/cm2，NaCl浓度为8％，皱胃与提取液比例为1∶15时，提取羔羊皱胃酶活性最高，为验证此结果，以8％NaCl溶液，皱胃与提取液比例为1∶15，在30W/cm2超声强度下，提取40分钟，获得羔羊皱胃酶活性为63100SU/g，证明提取技术参数合理可行，可在实际生产中应用。
6、羔羊皱胃酶活性的测定按干酪生产中凝乳活性表示。取10ml10％的脱脂乳液，在35℃下保温10分钟，加入0.5ml酶液，迅速混合均匀，准确记录从加入酶液到乳液凝固的时间(秒)，把40分钟凝固1ml10％脱脂乳液的酶量定义为一个索氏单位(Soxhelt unit，SU)，用每克羔羊皱胃提取酶活性单位表示提取酶活性产量，按下式计算酶活性和酶活性产量酶活性(SU)＝(2400/T)×(10/0.5)×D式中T为凝乳时间(秒)，D为稀释倍数酶活性产量(SU/g)＝SU/皱胃重量式中皱胃重量单位为g。
7、微生物指标的测定细菌总数按GB4789.2食品卫生微生物学检验中菌落总数测定方法进行检验，检验结果见表6。
大肠菌群按GB4789.3食品卫生微生物学检验中大肠菌群测定方法进行检验，检验结果见表6。
8、重金属含量的测定按GB5009.12食品中铅的含量测定方法进行检验，检验结果见表6。
9、酶活性保存率的测定将酶液在0～5℃下保存3个月和6个月后，分别测定其酶活性，然后用下式计算酶活性保存率。
酶活性保存率(％)＝(保存后酶活性/保存前酶活性)×10010、感官性状评定在自然光下用肉眼观察酶液的颜色、粘稠度及澄清状况。
观察结果见表6。
表6 羔羊皱胃酶的微生物指标检测结果表指标 传统方法 超声提取皱胃酶活性(SU/g) 5320463100细菌总数(个/ml) 4500013500大肠菌群(个/ml) 25 5重金属(以Pb计)(％)未检出 未检出酶活性保存率(％) 3个月 100 1006个月 95 92颜色 稍黄 微黄粘稠度粘稠 稍粘澄清度稍浑浊 清澈结论应用超声波可大大缩短提取时间，在超声濒率为20KHz，超声强度为30W/cm2下提取40分钟获得的羔羊皱胃酶活性高于传统方法提取活性的18.60％；应用超声提取羔羊皱胃酶，其微生物污染程度明显低于传统方法，细菌总数和大肠菌群分别由传统方法的45000个/ml和25个/ml降为13500个/ml和5个/ml；应用超声提取羔羊皱胃酶，其理化指标、微生物指标和感官指标均符合QB1805.3-93工业用蛋白酶制剂的应用指标。
权利要求
1.一种羔羊皱胃酶超声提取方法，其特征在于它包括下述工艺步骤(1)羔羊皱胃的预处理羔羊屠宰后，立即取出皱胃，用流水冲洗1～2分钟除出内容物，然后剥除皱胃外部的脂肪及结缔组织，在-24℃下冷冻备用。(2)切碎羔羊皱胃用绞肉机将羔羊皱胃切成0.001～0.01cm3的羔羊皱胃块。(3)超声提取在pH值为2.0～5.0的磷酸盐缓冲液中添加2～10％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，使羔羊皱胃块与缓冲液的重量比为1∶10～25，在超声频率为20KHz、超声强度为20～45W/cm2下，提取20～50分钟，并保持提取液温度20～25℃。(4)离心分离将超声提取后的混合液装入离心机中，在3000～4000转/分离心15分钟，去除杂质，取上清液。(5)激活经离心后的上清液用0.1mol/L HCl调整pH至4.6，在室温下激活24小时，得羔羊皱胃酶粗提液。(6)制备羔羊皱胃酶激活后的羔羊皱胃酶粗提液再装入离心机中，在3000～4000转/分再离心15～30分钟，以除去杂蛋白，然后再将其pH调整至5.3～6.0，即为提取的液态羔羊皱胃酶。
2.按照权利要求1所述的羔羊皱胃酶超声提取方法，其特征在于其中超声提取工艺步骤中，在pH值为2.0～5.0的磷酸盐缓冲液中添加5～10％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，羔羊皱胃块与缓冲液的重量比为1∶10～20，在超声频率为20KHz、超声强度为30～40W/cm2下，提取30～40分钟，并保持提取液温度20～25℃。
3.按照权利要求1所述的羔羊皱胃酶超声提取方法，其特征在于其中超声提取工艺步骤中，在pH值为4.0的磷酸盐缓冲液中添加8％的NaCl，制备成NaCl浸提缓冲液，将NaCl浸提缓冲液装入超声提取仪的容器内，然后在该浸提缓冲液中加入切碎后的羔羊皱胃块，羔羊皱胃块与缓冲液的重量比为1∶15，在超声频率为20KHz、超声强度为40W/cm2下，提取40分钟，并保持提取液温度20～25℃。
全文摘要
一种羔羊皱胃酶超声提取方法，其工艺步骤为羔羊皱胃预处理、羔羊皱胃切碎、超声提取、离心分离、激活、制备羔羊皱胃酶。本发明采用出生3周内的羔羊皱胃为原料，应用超声波在溶液中产生的空化效应作用，破坏皱胃细胞结构，加速提取液在溶液中的渗透速度和细胞中酶的溶出速度，大大缩短了提取时间。超声提取20～50分钟可达到传统方法提取2～3天的酶活性产量，且产品微生物污染程度较低。该方法具有操作简单、提取效率较高、产品质量较好等特点，可在食品工业生产中推广使用。
文档编号C07K1/14GK1546659SQ20031011891
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月10日 优先权日2003年12月10日
发明者张富新, 陈锦屏, 李林强 申请人:陕西师范大学