专利名称：联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法
技术领域：
本发明属于天然产物的提取、分离和纯化领域，特别是涉及一种以新鲜大蒜或脱水大蒜为原料联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法。
背景技术：
大蒜(Allium sativum L.)在人类社会中延用了五千多年。古埃及人在建造金字塔时，每餐必食用大蒜，用于抵抗疾病，增强体魄；二战期间，英国士兵由于受到德军的包围和封锁，药品奇缺，英政府就使用大蒜为士兵疗伤；俄罗斯人称大蒜是土里长出的盘尼西林。在中国，唐朝的苏恭，明朝的李时珍、清朝黄宫萧等都认为大蒜有开胃健脾、祛寒除湿和消肿散毒等功能。近50年的现代医学、营养学的研究证明大蒜有降血脂、预防动脉硬化、防治冠心病、脑血栓、消炎杀菌、抗癌、提高机体免疫力、保护肝脏、降血压、降血脂和延缓衰老等作用，并且研究证实了大蒜的这些药用效果和保健作用都与蒜氨酸和大蒜多糖有直接或间接的作用。
蒜氨酸(S-烯丙基-L-半脱氨酸亚矾，S-Allyl-L-cysteinesulfoxide，alliin)又名蒜碱，其分子式为C6H11O3SN，分子量为177.22，熔点为164.5℃，主要存在于大蒜鳞茎的细胞中，是大蒜中含量最多的含硫化和物，是大蒜中独特的非蛋白类的含硫氨基酸，占大蒜中含硫化合物的90％，其含量高达0.5％-1.4％(以湿基计算)，最高达到3.2％(以干物质计算)。纯蒜氨酸对热稳定，在85℃加热数天也不会分解，能溶于水而不溶于乙醚等非极性有机溶剂。鲜蒜或复水后的脱水蒜片中的蒜氨酸，当受到外力如打浆时，极易与其共存的蒜氨酸酶反应生成具有辣味或臭味的大蒜辣素(又名大蒜素，Allicin)。近几年报道蒜氨酸有抗氧化、清除自由基、保肝、降糖、降脂、营养神经、抗肿瘤、抗血栓等多项功能(贾江滨等，大蒜中含硫氨基酸的研究进展，中草药，2000，31(6)468)。CN 1460520A已经发明了利用蒜氨酸和蒜氨酸酶生产具有防治脑血管病、抗病毒、抗真菌、抗肿瘤作用的复方蒜氨酸肠溶胶囊。为满足药品和保健品生产对蒜氨酸的需要，人们正在致力于研究获得蒜氨酸的方法。目前获得蒜氨酸的方法有①水提法(CN1412317A，CN 1425650A)，②有机溶剂提取法(CN 1273969A)，③组织培养法，④化学合成法。②和④两种方法因使用有机溶剂，成本较高，且有时造成化学污染，其所介绍的方法或所得产品难以在食品、医药生产中推广应用，③法因产量低、成本较高、仍处在研究阶段，还不能应用于生产。目前最为可行的生产蒜氨酸的方法是①法。如CN 1412317A发明专利，介绍了以水提取大蒜蒜氨酸，并且利用果胶酶、纤维素酶对提取的大蒜浆或大蒜汁进行酶解，然后进行微生物发酵除去对蒜氨酸提取、结晶有影响的化合物或大分子，然后再利用阳离子交换树脂吸附、洗脱后制取蒜氨酸。该发明专利的不足是未能提取大蒜多糖，而是利用微生物将宝贵的大蒜多糖分解掉了。CN 1425650A报道了水提取蒜氨酸并用阳离子交换树脂进行蒜氨酸分离的方法，但该法采用40％～70％的乙醇沉淀去除杂质，其成本较高，也未提及大蒜多糖的提取和利用，使生产蒜氨酸的原料成本和分离、提纯成本居高不下。上述两项专利均利用0.4-2N的氨水洗脱阳离子交换柱、并收集pH5-7的洗脱液部分，再进一步获得蒜氨酸晶体。
蒜氨酸容易在蒜氨酸酶的作用下，迅速地转化成具有大蒜辣味的大蒜素。因此，要提高蒜氨酸的得率，必须使蒜氨酸失去活性。CN 1412317A，CN1425650A，CN 1460520A均提到采用微波加热法进行灭活。微波灭活的不足是处理大量鲜蒜原料或脱水蒜片时，常常加热不均匀，即容易残留少量的蒜氨酸酶活性而影响蒜氨酸的得率。
大蒜多糖属于果聚多糖。Sabine Barmgartner(2000)报道大蒜多糖是类似菊糖的果聚糖，分子量9000～10000道尔顿，分支度为9(Characterisation ofthe high-molecular weight fructan isolated from garlic(Allium sativum L.)，Carbohydrate Research，2000(328)177)。CN 1239719A报道大蒜多糖的分子量为3500，是果糖含量为80％的杂果聚糖，并且有希望代替珍贵的牛膝多糖用于医药。现已研究证实了果聚多糖具有控制血脂、降低血糖、促进矿物质吸收、增殖肠道双岐杆菌、防便秘及治疗肥胖症等多种生理功能。最近还研究证实了大蒜多糖具有保肝护肝作用(郑敏等大蒜多糖对肝损伤小鼠血清和肝组织ALT/AST的影响及其急性毒性实验，咸宁学院学报，2003，17(2)85)，对实验性小鼠病毒心肌炎具有治疗作用(蔡飞等，大蒜多糖对小鼠病毒性心肌炎的治疗作用，武汉大学学报(医学版)，2003，24(2)109)。上述研究仅适用于提取少量的样品供研究用，不适用于大批量生产应用，难以满足食品和医药的应用。CN 1239719A，JP 10158306-A均报道了大蒜多糖的提取方法，但这些方法需要除臭、脱皮等操作，均未提及同时提取功能成分蒜氨酸，其成本既高，又易于造成环境污染。CN 1239719A在提取过程中使用了可以引起果糖和果聚糖沉淀的CaCl2，这不利于提高大蒜多糖的产率。
综合上述两方面的情况，为充分利用大蒜资源，尽可能多的提取大蒜中具有生物活性或保健作用的天然产物，以满足医药和保健食品制造对蒜氨酸和大蒜多糖需求，为了降低制造成本，减少环境污染，有必要改进目前的蒜氨酸和大蒜多糖各自单独生产、且工艺参数不合理的状况。
发明内容
本发明的目的在于研制从鲜大蒜或脱水蒜片等原料中既能提取蒜氨酸，同时又能提取大蒜多糖两种活性成分的最佳方法，以降低原料成本、降低设备投资、降低能量消耗、减少试剂消耗、减少这两种产品制造过程中造成的环境污染。
本发明所述的联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法，包括以下步骤A.洗涤去杂将新鲜大蒜用浸泡，洗去杂物；或者采用脱水大蒜片，加水浸泡。
B.蒜氨酸酶的灭活采用加热灭活法(蒸汽蒸煮法或水浸煮沸法)或调节酸度灭活法，使蒜氨酸酶失去活性。
所述的步骤B中的加热灭活法，是指将步骤A中洗净的新鲜大蒜用水蒸气加热10～15分钟；或者放入2～5倍水中煮沸5～10分钟；或者将步骤A中复水的脱水大蒜片放入5～10倍水中煮沸5～10分钟。
所述的步骤B中的调节酸度法，是指用2～5倍的酸性溶液浸泡大蒜0.5～1小时，通过调节酸度的办法使蒜氨酸酶失活。
所述的酸性浸泡液为使用食用级柠檬酸或其他酸调节自来水而制成的pH为3～4的酸性溶液。
检查酶灭活(使蒜氨酸酶失去活性)的方法将灭活的大蒜汁液于30～35℃放置0.5～1.5小时，再取少量汁液与0.01％蒜氨酸标准溶液，点在同一块硅胶薄板上，以正丁醇∶冰醋酸∶水(4∶1∶1)混和液为流动相，密闭层析10-20分钟，取出凉干后喷洒0.5％茚三酮乙醇溶液显色。标准蒜氨酸与茚三酮反应后显棕红色(桔红色)，若酶解液中有与蒜氨酸同样Rf值(2.8-3.8)的棕(桔)红色斑点，即为检测到蒜氨酸，即表明蒜氨酸未被水解，蒜氨酸酶已完全失去活性，证实酶灭活条件合理。
C.破碎取汁将灭活处理的大蒜打浆或磨制成粒度为100～150目的蒜浆，将蒜浆先用袋滤器、压榨机进行处理，除去大蒜组织颗粒、蒜皮杂质，得大蒜粗提液。
所述的步骤C中，在打浆时一并加入步骤B中的加热灭活法所用的蒸锅水或煮沸水；或者一并加入步骤B中的调节酸度法所用的酸性浸泡液。
D.大蒜粗提液的精制将大蒜粗提取液经过离心处理，上清液采用板框式压榨机过滤、或采用真空离心机过滤、或采用截留分子量1～2万道尔顿的过滤膜过滤、或采用水力旋流分离器分离、或加入总量为0.1～0.3％的明胶、单宁、膨润土混合澄清剂处理，或者将上述措施进行任意组合处理，然后获得白色或微黄色的澄清透明的精制大蒜提取液。
步骤D中所述的过滤膜为有机膜或者无机膜。
所述D步骤中，以白皮蒜为原料制得的是白色的澄清透明的精制大蒜提取液，以紫皮蒜为原料制得的是微黄色的澄清透明的精制大蒜提取液。
E.离子交换树脂吸附蒜氨酸将精制大蒜提取液通过阳离子交换树脂柱，吸附速度为每公斤树脂0.2～1升/小时；或者直接将阳离子交换树脂加入到精制大蒜提取液中，在50～100rpm的转速下吸附1～4小时，每公斤精制大蒜提取液的阳离子交换树脂用量300～500克。
F.大蒜多糖粗提液的获得加入精制大蒜提取液，使阳离子交换树脂吸附饱和后，再用无离子水洗脱树脂，洗至溶液无糖和无蛋白质反应且流出液呈微酸性(pH＝5.0～5.5)时，收集所有的洗脱液，得到大蒜多糖粗提液。
G.大蒜多糖溶液的精制将大蒜多糖粗提液通过阴离子交换树脂脱色，再用无离子水洗脱2～3个色谱柱体积，收集流出液和洗脱液，调节其pH为中性，再通过活性炭吸附柱，或者用0.1～0.2％活性炭吸附20～24小时后，得到精制的大蒜多糖溶液。
H.获得大蒜多糖产品在温度为60～80℃的真空条件下，将大蒜多糖溶液浓缩至大蒜多糖含量在30～60％，再进行喷雾干燥，得白色粉状的大蒜多糖产品；或烘房干燥、粉碎后得白色粉状的大蒜多糖。
所述的H步骤中，喷雾干燥的条件是大蒜多糖的含量为30～60％，离心喷雾压力为0.1～0.3MPa，进入喷雾塔的热空气温度为150～170℃，出口温度75～90℃。
所述的H步骤中，烘房干燥的条件是将精制大蒜多糖溶液在60～80℃下真空浓缩至可溶性固形物含量50～60％，再于60～70℃干燥至含水量0～5％，粉碎即得白色的粉状大蒜多糖。
I.蒜氨酸的洗脱阳离子交换树脂用无离子水洗脱后，再用0.2～0.7摩尔氨水作为洗脱液洗脱阳离子交换树脂，收集pH值为3.8～8.5范围内的洗脱液，即为含有蒜氨酸的洗脱液。
J.制取蒜氨酸粗品将I步骤所得的含有蒜氨酸的洗脱液经真空浓缩脱氨水，温度控制在60～70℃，加入乙醇使浓缩液含有20～80％的乙醇，再用碱调节pH值为5.5～6.5范围内，20～25℃静置10～24小时，析出结晶蒜氨酸，弃去上层液体得蒜氨酸粗品；K.蒜氨酸的精制将J步骤结晶的蒜氨酸粗品，经过离心和重结晶，于60～80℃下减压干燥至含水量0～5％后，即得蒜氨酸精制产品。
所得的蒜氨酸精制产品用氮气或惰性气体进行密闭保存，或用防潮塑料薄膜的防潮包装保存。
以本发明所述方法制造的蒜氨酸提取率可达2.5-3.0％(以干物质计算)，蒜氨酸纯度95％以上；蒜氨酸的定量测定采用茚三酮比色法(见何照范等保健食品化学及其检测技术，中国轻工业出版社，北京，1998年5月第一版，141-142页)，蒜氨酸的定性鉴定则以美国Indofine Chemical公司所提供的标准品蒜氨酸(纯度为99.5％)作为对照，采用薄板层析、紫外光谱、红外光谱等方法法进行分析鉴定。由薄板层析结果表明，本发明分离的蒜氨酸产品与标准蒜氨酸的Rf值是一致的，本发明所得的蒜氨酸的紫外光谱和红外光谱特征，与标准品对照也是完全一致的，这些测定结果表明，本发明所获结晶产品是蒜氨酸产品。
以本发明所述方法制造的大蒜多糖提取率50～70％(以干物质计算)，纯度为95％以上。大蒜多糖的定量测定采用苯酚-硫酸法(何照范等保健食品化学及其检测技术，中国轻工业出版社，北京，1998年5月第一版，70-71页)，大蒜多糖中的果糖测定采用间苯二酚法(哈森其木格等，间苯二酚分光光度法测定荠菜多糖中的果糖含量，光谱学与光谱分析，2002，22(3)446)。经测定，本发明所获得的大蒜多糖的果糖含量为85％，葡萄糖含量为15％，与SabineBarmgartner(2000)所获得的结论一致，即大蒜多糖为杂果聚糖。所获大蒜多糖的红外光谱特征吸收峰是3416，2933，1644，1457，1129，1025，932，877，817cm-1。其中，932，877，817cm-1为果聚糖相关峰，这些表明所获产品为果聚糖。经13C核磁共振谱测定，本发明所得的大蒜多糖的13C核磁共振谱与Sabine Barmgartner(2000)所获得的13C核磁共振谱也是完全一致的。上述结果表明本发明所获产品是大蒜多糖。
本发明的最大优点是利用同一批原料生产蒜氨酸和大蒜多糖两种有价值的生物活性物质，与过去利用大蒜原料只生产蒜氨酸(如CN 1412317A，CN1273969A，CN 1425650A)或只生产大蒜多糖(CN 1239719A，JP 10158306-A)相比，更充分地利用了大蒜资源；这在一定程度上降低了生产成本，减轻了生产单一产品时造成的环境污染，可使采用本发明技术的生产企业比单独生产蒜氨酸或大蒜多糖的效益翻番。因此，本发明技术具有更高的生产应用价值。
其次，本发明提供了两种安全、高效的灭活方法，即调节酸度灭活法与加热灭活法。
蒜氨酸容易在蒜氨酸酶的作用下，迅速地转化成具有大蒜辣味的大蒜素。因此，要提高蒜氨酸的得率，必须使蒜氨酸失去活性。CN 1412317A、CN1425650A、CN 1460520A均提到采用微波加热法进行灭活。微波灭活的不足是处理大量鲜蒜原料或脱水蒜片时，常常加热不均匀，即容易残留少量的蒜氨酸酶活性而影响蒜氨酸的得率。本发明所采用的“灭活”步骤克服了现有技术的不足。其中，调节酸度灭活法与加热灭活法相比，设备投资少，节省能源，使用方便，还有利于减少杂菌污染和保证产品质量。加热法只适于有加热条件的工厂采用。这两种灭活均较微波灭活法均匀(CN 1412317A、CN 1425650A)、安全，并且蒜氨酸产品得率高。
第三，本发明提取蒜氨酸时，与已有的专利技术相比(如CN 1412317A、CN 1273969A、CN 1425650A)，使用氨水浓度低，为0.2～0.7摩尔，降低了洗脱液试剂成本；而且所收集的氨水洗脱液的pH值范围比较宽，为pH3.8～8.5，使得蒜氨酸的得率大大提高。
第四，本发明提供了快速检测蒜氨酸存在和蒜氨酸酶灭活的正确方法。
在提取蒜氨酸过程中，需要经常检查蒜氨酸。CN 1273969A述及采用硅胶薄板层析，并用茚三酮显色检查蒜氨酸的存在。该专利述及蒜氨酸与茚三酮反应显蓝色。本发明所述的方法指出蒜氨酸与茚三酮反应是棕(桔)红色，而不是CN 1273969A所述的蓝色。采用本发明提供的检查蒜氨酸存在的简易方法，若检查不到蒜氨酸的存在，证明灭活条件合理。
第五，本发明采用喷雾干燥或60℃烘房干燥制取大蒜多糖的干燥方法，与已有的生产方法(CN 1239719A，JP 10158306-A)相比，没有脱臭的繁琐操作，没有CaCl2引起的大蒜多糖沉淀发生，产品得率高，生产量大，可应用于工业化生产；而且生产、制造工序简单，可简可繁，可根据投资大小、生产规模、产品要求等条件灵活选择。
图1联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的工艺流程2蒜氨酸的紫外吸收光谱(测定条件20％乙醇溶液，狭缝4nm；采样间隔1nm；仪器SC-53紫外可见分光光度计)图3蒜氨酸的红外光谱(德国Bruker公司 Equinox 55型傅立叶变换红外光谱仪，KBr压片)图4大蒜多糖的红外光谱(德国Bruker公司 Equinox 55型傅立叶变换红外光谱仪，KBr压片)图5大蒜多糖的13C核磁共振谱(德国Varian公司INOVA-300型核磁共振仪，池豫(Relaxation)时间为1秒，采样时间0.5秒，累加5万次，谱宽2万Hz，采样频率75MHz.。样品浓度40mg/ml(MeSO-d6))
具体实施例方式
实施例一以鲜大蒜为原料，如图1所示的联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法，具体按下述步骤进行第一步进行预处理将新鲜蒜瓣置于2.5倍饮用水中，浸泡4小时，流动水冲洗去掉泥土和蒜皮等杂质。控干明水，置于蒸笼上，蒸至圆汽后再蒸10分钟。以蒸透、使蒜氨酸酶失活为准。
第二步制取大蒜透明提取液将蒸熟后的蒜瓣和蒸煮用水一起加到打浆机上，制成150目的蒜浆；用250目滤布(或袋滤器)过滤蒜浆，得大蒜粗提液。粗提液在4000rpm下离心20分钟以上，所得上清夜用截留分子量为1.2万道尔顿的无机膜过滤，透过液即为透明的大蒜提取液。
第三步用阳离子交换树脂吸附浓缩提取液中的蒜氨酸将透明的大蒜提取液通过阳离子交换树脂吸附柱。在阳离子交换树脂吸附柱饱和后，先用无离子水对吸附柱进行洗脱，并冲洗至流出液无糖和无蛋白质反应。收集流出液和无离子水洗脱液，此即为大蒜多糖溶液，而蒜氨酸则吸附在阳离子交换树脂上。
第四步进行大蒜多糖溶液的精制大蒜多糖溶液进入阴离子交换柱，调节上柱速度以充分吸附溶液中的阴离子，吸附至接近饱和后，用无离子水洗脱得精制大蒜多糖溶液。
第五步大蒜多糖精制溶液的浓缩和干燥将精制大蒜多糖溶液在60℃下真空浓缩至可溶性固形物含量为30％，在喷雾干燥机上干燥。喷雾压力为0.25MPa，进入喷雾塔的热空气温度为150℃，出口温度为80℃。喷雾干燥所获得的白色粉沫即为大蒜多糖产品。
第六步洗脱蒜氨酸用0.2～0.7摩尔的氨水溶液继续洗脱已除去大蒜多糖的阳离子交换柱，收集pH值为3.8至8.5范围内的洗脱液，得含有蒜氨酸的氨水溶液。
第七步蒜氨酸的结晶和精制将含有蒜氨酸的氨水洗脱液经减压(60℃)浓缩，回收的氨水可重复使用或用作肥料，然后按浓缩液体积的25％加入乙醇，并用氨水调节pH值为5.8～6.2范围内，室温静置12小时以上，析出结晶的蒜氨酸，弃去上层液体得蒜氨酸粗品。将上述结晶的蒜氨酸粗品，经过离心，重结晶，再离心后于60～80℃范围条件减压干燥至含水量低于3％后，用氮气或惰性气体进行密闭保存，即得蒜氨酸精制产品。
实施例二以脱水蒜片为原料，如图1所示的联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法，按下述步骤进行第一步进行脱水蒜片的处理将脱水蒜片置于8倍饮用水中浸泡1～2小时，煮沸10分钟。以蒸软、使蒜氨酸酶失活为准。
第二步制取大蒜透明提取液将蒸熟后的蒜片用打浆机制成100～150目的蒜浆，用250目滤布过滤，得大蒜粗提液。采用水力旋流分离器分离除去悬浮杂质，所得清液用截留分子量为1万的有机膜过滤，即得透明的大蒜提取液。
第三步用阳离子交换树脂吸附浓缩提取液中的蒜氨酸将透明的大蒜提取液通过阳离子交换树脂吸附柱。在阳离子交换树脂吸附柱饱和后，先用无离子水对吸附柱进行洗脱，并冲洗至流出液无糖和无蛋白质反应。收集滤液和无离子水洗脱液，此即为大蒜多糖溶液，而蒜氨酸则吸附在阳离子交换树脂上。
第四步进行大蒜多糖溶液的精制将总量不超过0.3％的膨润土、明胶和硅溶胶加入到大蒜多糖溶液中，边加边搅拌，50分钟内加完，静置半小时，立即在板框式过滤机中过滤，滤液中加入0.1％的活性碳(或使滤液通过活性炭柱)，使之充分吸附后再过滤得精制大蒜多糖溶液。
第五步大蒜多糖精制溶液的浓缩和干燥将精制大蒜多糖溶液在60℃下真空浓缩至可溶性固形物含量为50％，趁热缓慢倒入烤盘中，在60℃的烘干房内慢慢干燥50小时，通过调节风速调节干燥速度，直至干燥至含水量低于4％，粉碎即得粉状大蒜多糖。
第六步洗脱蒜氨酸用0.2～0.7摩尔的氨水溶液继续洗脱已除去大蒜多糖的阳离子交换柱，收集pH值为3.8至8.5范围内的洗脱液，得含有蒜氨酸的氨水溶液。
第七步蒜氨酸的结晶和精制将含有蒜氨酸的氨水洗脱液经减压(60℃)浓缩，回收的氨水可重复使用或用作肥料，然后按浓缩液体积的25％加入乙醇，并用氨水调节PH值为5.5～6.5范围内，室温静置12小时以上，析出结晶的蒜氨酸，弃去上层液体得蒜氨酸粗品。将上述结晶的蒜氨酸粗品，经过离心，重结晶，再离心后于60～80℃范围条件减压干燥至含水量低于3％后，用氮气或惰性气体进行密闭保存，即得蒜氨酸精制产品。
实施例三以新鲜大蒜为原料，如图1所示的联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法，按下述步骤进行第一步制取大蒜提取液将鲜蒜瓣500克和2.5升pH3的盐酸水溶液，放入打浆机中，使其制成约150目的蒜浆，用250目滤布过滤，得大蒜粗提液。粗提液在4000rpm下离心20分钟、所得上清夜用板框式等压榨机过滤(压力0.1-3MPa)过滤，获得透明的大蒜提取液约3公斤。
第二步用阳离子交换树脂吸附浓缩提取液中的蒜氨酸将1公斤阳离子交换树脂，加入到约3公斤透明的大蒜提取液中，在50rpm的转速下吸附1～2小时，使阳离子交换树脂吸附柱饱和后，收集吸附残液用于生产大蒜多糖。再用约1-1.5升无离子水洗脱离子交换树脂，重复2-4次，洗脱至洗脱液无糖和无蛋白质反应。收集所有洗脱液和前述的吸附残液，此即为大蒜多糖溶液，而蒜氨酸则吸附在阳离子交换树脂上。
第三步进行大蒜多糖溶液的精制将总量不超过0.3％的膨润土、明胶和硅溶胶加入到大蒜多糖溶液中，边加边搅拌，50分钟内加完，静置半小时，立即在板框式过滤机中过滤。将滤液pH值调为中性后再加入0.1％的活性碳(或使滤液通过活性炭柱)，使之充分吸附后再过滤得精制大蒜多糖溶液。整个过程应在12小时内完成。
第四步大蒜多糖精制溶液的浓缩和干燥将精制大蒜多糖溶液在60℃下真空浓缩至可溶性固形物含量为50％，趁热缓慢倒入烤盘中，在60℃的烘干房内慢慢干燥24～48小时，通过调节风速调节干燥速度，直至干燥至含水量低于4％，粉碎即得粉状大蒜多糖。
第五步洗脱蒜氨酸用约1升0.7摩尔的氨水溶液浸没第二步所述吸附了蒜氨酸的阳离子交换树脂，在50rpm的转速下洗脱(解吸)1～2小时，重复两次，得含有蒜氨酸的氨水洗脱液。
第六步蒜氨酸的结晶和精制将含有蒜氨酸的氨水洗脱液经减压(60℃)浓缩，回收的氨水可重复使用或用作肥料，然后按浓缩液体积的25％加入乙醇，并用氨水调节pH值为5.5～6.5范围内，室温静置12小时以上，析出结晶的蒜氨酸，弃去上层液体得蒜氨酸粗品。将上述结晶的蒜氨酸粗品，经过离心，重结晶，再离心后于60～80℃范围条件减压干燥至含水量低于4％后，用氮气或惰性气体进行密闭保存，即得蒜氨酸精制产品。
上述各实施例中，离子交换树脂的预处理先用1摩尔氢氧化钠后用1摩尔盐酸将阳离子交换树脂处理成酸型树脂；对于阴离子交换树脂的处理，是先用1摩尔盐酸后用1摩尔氢氧化钠将阳离子交换树脂处理成OH-型树脂。
离子交换树脂的再生阳离子交换树脂的再生是将上述洗脱大蒜多糖和蒜氨酸的树脂，用1摩尔氢氧化钠洗脱除去大部分杂质后，再用1摩尔盐酸再生树脂，以备再一次吸附、洗脱使用。阴离子交换树脂的再生用的试剂与阳离子交换树脂所用试剂相同，只是添加试剂的顺序相反。
酸性阳离子交换树脂吸附材料可以是732型强酸阳离子交换树脂，或850型、800型、Dowex50型、Amberlite IR-120型等强酸阳树脂吸附。碱性阴离子交换树脂吸附材料可以是711型、717型、Dowex1型、Dowex2型等阴性离子交换树脂。
对上述实施例的产物的检测分析(1)蒜氨酸的提取率测定本发明所获蒜氨酸的提取率可达3.0％(以干物质计算)，蒜氨酸纯度95％以上。蒜氨酸的定量测定采用茚三酮比色法(见何照范等保健食品化学及其检测技术，中国轻工业出版社，北京，1998年5月第一版，141-142页)，蒜氨酸的定性测定采用薄板层析等方法，由薄板层析结果表明，分离的蒜氨酸与标准蒜氨酸的Rf值是一致的。
(2)蒜氨酸的紫外吸收光谱测定以SC-53紫外可见分光光度计测定上述实施例所得的蒜氨酸的紫外吸收光谱，测定条件为20％乙醇溶液，狭缝4nm；采样间隔1nm。结果如图2所示，与标准品对照，完全一致。
(3)蒜氨酸的红外光谱测定以德国Bruker公司 Equinox 55型傅立叶变换红外光谱仪，采用KBr压片法测定上述实施例所得的蒜氨酸的红外光谱，如图3所示，与标准品对照，完全一致。
综合上述(1)、(2)、(3)的结果，证实本发明所获的结晶产品为蒜氨酸。
(4)大蒜多糖的的提取率测定根据2000年药典规定的有关测定方法测定上述实施例所生产的大蒜多糖，其提取率为50～70％(以干物质计算)，纯度为95％以上。大蒜多糖的定量测定采用苯酚-硫酸法(何照范等保健食品化学及其检测技术，中国轻工业出版社，北京，1998年5月第一版，70～71页)。
大蒜多糖中的果糖测定采用间苯二酚法(哈森其木格等，间苯二酚分光光度法测定荠菜多糖中的果糖含量，光谱学与光谱分析，2002，22(3)446)。经测定，本发明所获大蒜多糖的果糖含量为85％，葡萄糖含量为15％。与SabineBarmgartner(2000)所获得的结论一致，即大蒜多糖为杂果聚糖。
(5)大蒜多糖的红外光谱测定以德国Bruker公司 Equinox 55型傅立叶变换红外光谱仪，采用KBr压片法测定上述实施例所得的大蒜多糖。结果如图4所示，其特征吸收峰分别为3416cm-1羟基(O-H)伸缩振动峰，2933cm-1亚甲基(C-H)伸缩振动峰，1644cm-1羟基(O-H)旋转振动峰，1457cm-1亚甲基(C-H)的剪切振动峰，1129cm-1仲醇基(O-H)的剪切振动峰，1025cm-1糖环上醚键的(C-O-C)的伸缩振动峰，932cm-1果呋喃糖环的对称伸缩振动峰，877cm-1果呋喃糖亚甲基(C-H)横向振动峰，817cm-1果呋喃糖亚甲基(C-H)剪切振动峰，其中，932，877，817cm-1为果聚糖相关峰，综合红外光谱特征吸收峰资料，表明所获产品为果聚糖。
(6)大蒜多糖的13C核磁共振谱测定测定条件为德国Varian公司INOVA-300型核磁共振仪，池豫(Relaxation)时间为1秒，采样时间0.5秒，累加5万次，谱宽2万Hz，采样频率75MHz.。样品浓度40mg/ml(MeSO-d6)。结果如图5所示，图中C1至C6表示果糖碳原子的特征峰。
经13C核磁共振谱测定，本发明所得的大蒜多糖的13C核磁共振谱与SabineBarmgartner(2000)所获得的13C核磁共振谱是完全一致的。
综合上述(4)、(5)、(6)的分析测定结果，标明本发明所获的大蒜多糖为杂果聚糖。
本发明不受上述实施例的限制，可根据上述本发明的技术方案和实际情况来确定具体的实施方式。
权利要求
1.一种联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤A.洗涤去杂将新鲜大蒜用浸泡，洗去杂物；或者采用脱水大蒜片，加水浸泡；B.蒜氨酸酶的灭活采用加热灭活法或调节酸度法，使蒜氨酸酶失去活性；C.破碎取汁将灭活处理的大蒜打浆或磨制成粒度为100～150目的蒜浆，将蒜浆先用袋滤器、压榨机进行处理，除去大蒜组织颗粒、蒜皮等杂质，得大蒜粗提液；D.大蒜粗提液的精制将大蒜粗提取液经过离心处理，上清液采用板框式压榨机过滤、或采用真空离心机过滤、或采用截留分子量1～2万道尔顿的过滤膜过滤、或采用水力旋流分离器分离、或加入总量为0.1～0.3％的明胶、单宁、膨润土混合澄清剂处理，或者将上述措施进行任意组合处理，然后获得白色或微黄色的澄清透明的精制大蒜提取液；E.离子交换树脂吸附蒜氨酸将精制大蒜提取液通过阳离子交换树脂柱，吸附速度为每公斤树脂0.2～1升/小时；或者直接将阳离子交换树脂加入到精制大蒜提取液中，在50～100rpm的转速下吸附1～4小时，每公斤精制大蒜提取液的阳离子交换树脂用量300～500克；F.大蒜多糖粗提液的获得加入精制大蒜提取液，使阳离子交换树脂吸附饱和后，再用无离子水洗脱树脂，洗至溶液无糖和无蛋白质反应且流出液呈微酸性(pH＝5.0～5.5)时，收集所有的洗脱液，得到大蒜多糖粗提液；G.大蒜多糖溶液的精制将大蒜多糖粗提液通过阴离子交换树脂脱色，再用无离子水洗脱2～3个色谱柱体积，收集流出液和洗脱液，调节其pH为中性，再通过活性炭吸附柱，或者用0.1～0.2％活性炭吸附20～24小时后，得到精制的大蒜多糖溶液；H.获得大蒜多糖产品在温度为60～80℃的真空条件下，将大蒜多糖溶液浓缩至大蒜多糖含量在30～60％，再进行喷雾干燥，得白色粉状的大蒜多糖产品；或烘房干燥、粉碎后得白色粉状的大蒜多糖；I.蒜氨酸的洗脱阳离子交换树脂用无离子水洗脱后，再用0.2～0.7摩尔氨水作为洗脱液洗脱阳离子交换树脂，收集pH值为3.8～8.5范围内的洗脱液，即为含有蒜氨酸的洗脱液；J.制取蒜氨酸粗品将I步骤所得的含有蒜氨酸的洗脱液经真空浓缩脱氨水，温度控制在60～70℃，加入乙醇使浓缩液含有20～80％的乙醇，再调节pH值为5.5～6.5范围内，20～25℃静置10～24小时，析出结晶蒜氨酸，弃去上层液体得蒜氨酸粗品；K.蒜氨酸的精制将J步骤结晶的蒜氨酸粗品，经过离心和重结晶后，于60～80℃下减压干燥至含水量2～5％后，即得蒜氨酸精制产品。
2.根据权利要求1所述的联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法，其特征在于所述的步骤B中的加热灭活法，是指将步骤A中洗净的大蒜用水蒸气加热10～15分钟，或者放入2～5倍水中煮沸5～10分钟；或者将步骤A中复水的脱水大蒜片放入5～10倍水中煮沸5～10分钟。
3.根据权利要求1所述的联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法，其特征在于所述的步骤B中的调节酸度法，是指用2～5倍的酸性溶液浸泡大蒜0.5～1小时，通过调节酸度的办法使蒜氨酸酶失活。
4.根据权利要求3所述的联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法，其特征在于所述的酸性浸泡液为使用食用级柠檬酸或其他酸调节自来水而制成的pH为3～4的酸性溶液。
5.根据权利要求1所述的联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法，其特征在于所述的步骤C中，在打浆时一并加入步骤B中的加热灭活法所用的蒸锅水或煮沸水。
6.根据权利要求1所述的联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法，其特征在于所述的步骤C中，在打浆时一并加入步骤B中的调节酸度法所用的酸性浸泡液。
7.根据权利要求1所述的联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的万法，其特征在于所述的步骤D中，过滤膜为有机膜或者无机膜。
8.根据权利要求1所述的联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法，其特征在于所述的步骤H中，将大蒜多糖溶液浓缩至多糖含量为30～60％，再进行喷雾干燥，离心喷雾压力为0.1～0.3MPa，进入喷雾塔的热空气温度为150～170℃，出口温度75～90℃。
9.根据权利要求1所述的联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法，其特征在于所述的步骤H中，将精制大蒜多糖溶液在60～80℃下真空浓缩至可溶性固形物含量为50～60％，再于60～70℃干燥至含水量0～5％，粉碎即得白色的粉状大蒜多糖。
全文摘要
本发明属于天然产物的提取、分离和纯化领域，公开了一种以新鲜大蒜或脱水大蒜为原料联合制备蒜氨酸与大蒜多糖的方法。本发明通过洗涤去杂、蒜氨酸酶的灭活、破碎取汁等步骤，得大蒜粗提液；精制后的大蒜粗提液经离子交换树脂处理，洗脱得大蒜多糖粗提液，再精制获得大蒜多糖产品；从再次洗脱液中制取蒜氨酸粗品，再精制获得蒜氨酸产品。本发明利用同一批原料生产蒜氨酸和大蒜多糖两种有价值的生物活性物质，更充分地利用了大蒜资源；降低了制造成本，减轻了生产单一产品时造成的环境污染，可使采用本发明技术的生产企业比单独生产蒜氨酸或大蒜多糖的效益翻番。
文档编号C07C315/00GK1556102SQ20031011762
公开日2004年12月22日 申请日期2003年12月30日 优先权日2003年12月30日
发明者黄雪松, 王文岭, 李爱军, 张宁, 段翰英 申请人:暨南大学