一种抗稻瘟病基因及其编码蛋白与应用的制作方法

专利名称：一种抗稻瘟病基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物抗病基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及一种抗稻瘟病基因及其编码蛋白与应用。
背景技术：
植物在自然界中往往会受到细菌、真菌、病毒及线虫等各种病害的袭击，表现为抗病(Resistance)或感病(Susceptibility)反应。对植物抗病性和抗病机制的研究一直是植物病理学和抗病育种十分关注的课题。
自1992年从玉米中克隆到植物第一个抗病基因Hm1以来，目前已克隆到了40多个植物抗病(R)基因，这些抗病基因涉及到细菌、真菌、病毒和线虫等不同病原微生物。这些基因多数编码的蛋白产物具有类似的结构特征如NBS(Nucleotidebinding site，核苷酸结合位点)，LRR(Leucine-rich repeat，富亮氨酸重复)，TM(Transmembrane domain，跨膜结构域)，PK(Protein kinase，蛋白激酶)，LZ(Leucine zipper，亮氨酸拉链)，CC(Coiled Coil，卷曲螺旋)和TIR(Toll-Interleukin-1 Receptor，Toll白介素-1区域)等。而且根据它们是否含有这些结构域，也可将这些抗病基因分为LZ(CC)-NBS-LRR，TIR-NBS-LRR，TM-LRR，TM-LRR，LRR-TM-STK等5类。但是，除了上述5类R基因外，目前还克隆了其它特殊类型的R基因。如玉米的Hm1基因是属于代表植物抗病基因中与病原菌亲和性因子作用的一类基因，其编码一个毒素还原酶，由于产生的抗性与病原菌的无毒基因没有关系，因而其抗病机制不符合基因对基因学说；甜菜的抗胞囊线虫的Hslpro-1基因所编码的蛋白含不完全的LRR和跨膜区；大麦的隐性抗白粉病(Erysiphegraminisf.sp.Hordei)mlo基因编码一个至少含有6个跨膜蛋白螺旋(Membranespanning helices)的膜蛋白，而没有其它R基因类似的结构域；拟南芥的抗白粉病基因RPW8编码的蛋白具有一个跨膜结构及胞内的卷曲螺旋区，并包含RPW8.1，RPW8.2两个不同的位点，能够对病原菌产生广谱抗性；拟南芥的抗烟草花叶病毒基因Rtm1和Rtm2分别编码热激蛋白；拟南芥中的抗病基因RRS1-R虽然也编码一个TIR-NBS-LRR蛋白，但其蛋白的羧基末端包含由60个氨基酸组成的与WRKY家族的转录激活蛋白具有类似结构的核定位信号结构，而且该基因对病原菌，Ralstoniasolanacearum，具有非小种特异性抗性，而且呈隐性遗传；西红柿对病原菌Verticillium alboatrum的抗病基因Ve编码的是类似于参与细胞内吞作用信号途径的细胞表面甘氨酸受体蛋白，另外最近在大麦中克隆的抗茎锈病基因Rpg1编码的蛋白含两个激酶区及一个疏水性较弱的跨膜区。因此，对于抗病基因的分类并不是一个简单的过程。只有克隆到更多的抗病基因，才可能更加全面地了解植物抗病基因的特征，并解析植物抗病的真正机制。
水稻是世界上主要的粮食作物之一，供养着全球近1/4的人口。水稻稻瘟病、白叶枯等重大病害一直是影响其产量的重要原因，研究水稻的抗病性及抗性机制日益热化，如目前已定位了20多个稻瘟病抗性基因及10多个稻瘟病抗性QTLs位点，定位的抗白叶枯病基因也已达20多个。但自1995年克隆到第一个水稻抗白叶枯病基因Xa21以来，目前仅在水稻中克隆到抗白叶枯病基因Xa1、抗稻瘟病Pi-b及Pi-ta等另外三个抗病基因。这对于单子叶的模式植物而言，克隆抗性基因的进展的确有些缓慢。而且所克隆的Xa21、Xa1、Pi-b、Pi-ta等四个抗病基因编码的蛋白产物都含有NBS及LRR结构，属于抗病基因的大类。而根据在植物上已克隆到的抗病基因结构特征出发，推测水稻中也应该存在多种类型的抗病基因。因此，克隆数量更多、种类更广的抗病基因才能更加系统深入地揭示水稻的抗病机制，也才能更好地用于基因工程改良水稻的抗病性，提高其产量。
发明创造内容本发明的目的是提供一种抗稻瘟病基因及其编码蛋白。
本发明所提供的抗稻瘟病基因，名称为Pi-d2，来源于水稻(Oryza sativavar.Lansheng)，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)序列表中的SEQ ID №2；3)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；4)与序列表中的SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1是Pi-d2的基因组DNA序列，由6261个碱基组成，其读码框为自5’端第3361到第5835位碱基；序列表中序列2是Pi-d2的全长cDNA序列，由2935个碱基组成，其读码框为自5’端第125到第2599位碱基；序列表中序列3是Pi-d2编码的蛋白质Pi-d2的氨基酸序列。Pi-d2的表达为组成型表达。
抗稻瘟病基因Pi-d2的编码蛋白Pi-d2，是具有序列表中SEQ ID №3氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №3的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №3衍生的蛋白质。
序列表中序列3是由825个氨基酸残基组成的一个丝氨酸/苏氨酸蛋白受体类激酶。序列3中，自氨基端第12-34位氨基酸残基序列为一个跨膜结构域(TM)，是具有信号肽功能的结构域；自氨基端第48-165位氨基酸残基序列是一个与外源凝集素蛋白相似的异体识别结构域(B-Lectin)，参与病原物的识别；自氨基端第436-458位氨基酸残基序列是一个跨膜结构域(TM)，是将上述识别信号传递给羧基端的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STYK)结构域的中介；自氨基端第501-771位氨基酸残基序列是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STYK)结构域，其磷酸化作用能将信号传导给抗病防卫反应系统。推测信号肽与异体识别结构域一起参与对稻瘟病病原菌ZB15无毒蛋白的识别，然后激发STYK区域。
含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。
扩增Pi-d2中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的抗稻瘟病基因Pi-d2导入植物细胞，可获得抗病的或抗病增强的转基因细胞系及转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物或转基因植物细胞进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期直接用稻瘟病菌接种进行筛选。本发明Pi-d2的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。本发明的基因对培育抗病植物品种，扩大作物种植范围，提高农作物产量具有重要意义。
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。


图1A为Pi-d2的精细定位示意1B为Pi-d2所在染色体区域的跨叠群示意2为GENSCAN对180kb的DNA序列的基因预测结果图3为Pi-d2编码蛋白的结构域分析图4A为Pi-d2与Pto和Xa21丝氨酸/苏氨酸激酶区的聚类分析图4B为Pi-d2与Pto和Xa21丝氨酸/苏氨酸激酶区的序列相似性比较图5为Pi-d2全长基因在水稻基因组中的拷贝数的Southern杂交结果图6A为互补实验表达载体pZH01/Pi-d2图6B为Pi-d2转基因T0代分子检测结果图6C为对部分转基因株系T1代抗性鉴定结果图6D为转基因株系T0-10的T2代分子检测结果图7A为Pi-d2在转录水平上的RT-PCR分析结果图7B为Pi-d2在转录水平上的Northern分析结果具体实施方式
实施例1、地谷抗稻瘟病基因的发现及鉴定应用我国南方稻区致病力较强的稻瘟病生理小种ZB15对地谷和感病的水稻品种丽江新团黑谷(LTH)、江南香糯(JNXN)以及杂交获得的F1、BC1F1、F2群体进行接种鉴定，结果如表1所示，地谷对ZB15表现为抗病，丽江新团黑谷、江南香糯均表现为感病，地谷与丽江新团黑谷、江南香糯杂交获得的F1植株对ZB15也都表现为抗病，而地谷与丽江新团黑谷、江南香糯杂交，进一步回交获得的群体B1F1中的抗病单株与感病单株符合1∶1，而且各F2群体的抗病感病的分离比均符合3∶1。这些结果表明水稻品种地谷对稻瘟病小种ZB15的抗性受细胞核内的单基因控制，并呈完全显性遗传，定名为Pi-d2。
表1 亲本地谷(Digu)，丽江新团黑谷(LTH)，江南香糯(JNXN)及其杂交后代对稻瘟病原菌小种ZB15的抗病感病情况(R＝抗病，S＝感病)


实施例2、Pi-d2与其它已知抗稻瘟病基因关系分析用稻瘟病小种ZB15对含已知抗病基因的日本鉴别系和ZYQ8及它们与地谷杂交获得的F1和F2群体进行接种鉴定。如表2所示，BL-1、K60、Pi-4号、K1、福锦、藤坂5号、梅雨明等7个品种对ZB15均表现感病反应，而与地谷杂交得到的F1均表现抗病反应，与地谷杂交得到的F2的抗病、感病分离比均符合3∶1，表明地谷所含的抗稻瘟病基因Pi-d2与该7个品种所含的抗稻瘟病基因不同。
表2地谷与各水稻稻瘟病鉴别品种杂交后代F1和F2群体对稻瘟病原菌ZB15的抗病感病分离情况(R＝抗病，S＝感病)

而水稻品种K59，窄叶青8号和砦1号及它们与地谷杂交获得的F1对ZB15均表现为抗病反应，但其相应的F2群体都分离出现了感病单株，其分离比既不符合3∶1，也不符合15∶1，表明K59，窄叶青8号和砦1号中可能也含有对ZB15的抗稻瘟病基因，但与地谷中的Pi-d2不同，而且也不等位。
实施例3、对抗稻瘟病基因的定位以地谷和丽江新团黑谷为亲本，发展了一个F2群体，用ZB15对F2群体进行接种处理，鉴定出抗病和感病的单株，并将抗病单株和感病单株进行抗、感分群，从抗病和感病植株中分别随机选取6个单株，取等量叶片，并将抗病和感病单株的叶片分别混合提取DNA，形成抗病和感病DNA池，对ZB15抗病和感病的DNA池分别定名为BR15和BS15。先后用比较平均地分布于水稻12条染色体的127个RFLP标记及322个SSR标记对亲本地谷和丽江新团黑谷进行DNA多态性筛选，发现其中有72个RFLP标记及119个SSR标记能揭示两亲本DNA的多态性，进而用这191个分子标记对抗病、感病的DNA池进行分析，并进一步将该基因定位于水稻第6染色体上。
实施例4、抗稻瘟病基因的精细定位在利用地谷和丽江新团黑谷为亲本构建扩大的F2群体，并将该F2群体种植于温室中，在其三叶一芯期，用稻瘟病生理小种ZB15进行喷雾接种，并保持100％的湿度及25-28℃的培养环境，接种10天后对F2单株进行抗感病鉴定。得到约4000株感病特别明显的F2单株，对这些F2单株的叶片按5株混合建池提取DNA，获得约800个感病DNA池，用于精细定位。用与Pi-d2定位分析的分子标记，并根据中国华大基因研究中心(http//btn.genomics.org.cn)和国际基因组计划(http//rgp.dna.affrc.go.jp)提供的序列设计引物，对800个感病的DNA池进行分析，将其定位于分子标记CAPs1和CAPs8之间，其中分子标记CAPs1和CAPs8与目标基因分别有1个和3个交换，而分子标记CAPs2，dCAPs1，dCAPs2则与目标基因共分离，如图1A所示。
实施例5、候选基因的获得首先对分子标记CAPs1和CAPs8所跨区域几附近的PACs序列进行分析后构建其PAC跨叠群(如图1B所示)，并发现这一区域的染色体交换频率很低(约500kb/cM)，因此，难以将目标基因定位在一个或两个基因的有限范围。于是用GENSCAN对CAPs1和CAPs8所跨叠的180KB的物理群进行了基因预测，预测结果如图2所示，该区域共含33个基因(如表3所示)，其中丝氨酸/苏氨酸受体激酶蛋白(STK Protein)，DNA结合蛋白(DNA Binding PROTEIN)，ATP酶蛋白(ATPases)，未知功能蛋白(Unkown function Protein)，剪切相关蛋白的富脯氨酸结构域(Proline rich domain)各1个，反转录酶(Reverse transcriptase)2个，细菌中的一类运动蛋白(MviN-like protein)5个，推测蛋白(Putative Protein)21个，推测其中编码一个丝氨酸/苏氨酸蛋白受体激酶的基因很可能是目标基因。于是，根据其转录区域的DNA序列设计引物进行5’和3’末端扩增(RapidAmplification cDNA Ends，RACE)及转录扩增(RT-PCR)获得其全长cDNA。具体过程如下对于5’末端扩增，先用引物5’(P)TGAATGGGTGAC 3’对水稻地谷中RNA(已去除DNA)进行反转录获得cDNA，然后以该cDNA为模板，用特异引物A15’CTTGCAGTGGTTCACATGGC 3’和S15’CCAAAGCCAAAGACAGAGCC 3’进行第一轮扩增，再以第一获得的PCR产物为模板，用特引物A25’CAGTCTGGTCTGCCAATCCT 3’和S25’CTTGCAGTGGTTCACATGGC 3’进行二轮扩增。类似的，对于3’末端扩增，先用5’GACTCGAGTCGACATCGA(T)16 3’对模板RNA进行反转录，然后用特异引物Con3R5’TCGACCCGCCCATCCTTGT 3’和Adapter5’GACTCGAGTCGACATCGA3’对反转录获得的进行扩增。对于5’和3’末端间的区域，以3’末端扩增过程中的cDNA为模板，用两对特异引物S1+CON2R(5’-CCAAAGCCAAAGACAGAGCC-3’，及5’-ATTTGAAGGCGTTTGCGTAGA-3’)和CON2F+CON3R(5’-TTGGCTATCATAGGCGTCC-3’及5’-TCGACCCGCCCATCCTTGT-3’)分别进行扩增获得。通过分析表明该全长cDNA共编码825个氨基酸，如序列表中的序列3所示。同时以引物GenRF上游5′端5’AGCATCAACATAGACGTAGCGTGG 3’，下游3′端5’CTAGTTACAGATCACTGTGCCAT 3’；利用高保真酶Pfu扩增，获得了该基因对应的基因组序列，如序列表中的序列1所示，通过比较其基因组和cDNA序列发现该基因，仅含一个开放阅读框，其包含了cDNA编码的完整区域，该结果表明该基因不含有内含子。
表3 GENSCAN对180kb的DNA序列的基因预测结果II

实施例6、Pi-d2编码蛋白的结构分析用Simple Modular Architecture Research Tool(SMART)(http//smart.embl-heidelberg.de/)方法对基因Pi-d2所编码的蛋白全长氨基酸序列分析，结果如图3所示，该蛋白的氨基最末端即自序列表中序列3的氨基端第1-32位氨基酸残基序列为一个跨膜结构域(TM)，是一个包含23个氨基酸的信号肽结构(Signaling domain) 自序列表中序列3的氨基端第48-165位氨基酸残基序列是一个与外源凝集素蛋白相似的异体识别结构域(B-Lectin)，参与病原物的识别；自序列表中序列3的氨基端第436-458位氨基酸残基序列是一个跨膜结构域(TM)，是将上述识别信号传递给羧基端的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STYK)结构域的中介；自序列表中序列3的氨基端第501-771位氨基酸残基序列是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STYK)结构域，其磷酸化作用能将信号传导给抗病防卫反应系统；自序列表中序列3的氨基端第419-431位氨基酸残基序列和自序列表中序列3的氨基端第797-808位氨基酸残基序列为low complexity区域。推测信号肽与异体识别结构域一起参与对稻瘟病病原菌ZB15无毒蛋白的识别，然后激发STYK区域的活性，从而激活植物体内的抗病防卫反应系统，实现对病原菌ZB15的抗病性。
实施例7、Pi-d2与Pto和Xa21丝氨酸/苏氨酸激酶区氨基酸序列的比较由于目前所克隆的植物抗病基因中，仅有西红柿的Pto和水稻的Xa21具有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，因此，从NCBI(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索到Pto和Xa21相应的STYK结构域的氨基酸序列并与Pi-d2的STYK结构域的氨基酸序列进行比较，结果如图4A所示，表明Pi-d2与Pto、Xa21间在某些区域相对十分保守，估计这些区域是该类丝氨酸/苏氨酸激酶发挥活性所必需的。三者相似性比较结果如图4B所示，表明Pi-d2与Pto、Xa21的STYK的同源性分别为32.3％，26.2％，而Pto与Xa21间STYK的同源性仅为21.2％。说明在进化上，Pi-d2与Pto的亲缘关系可能比与Xa21更近。
实施例8、基因组拷贝数分析对地谷、丽江新团黑谷、台北309(TP309)按照SDS法提取的水稻材料基因组DNA经ScaI、DraI等酶切后转膜，利用Pi-d2全长cDNA序列为探针，进行Southern杂交，结果如图5所示，表明经ScaI、DraI酶切后地谷、丽江新团黑谷、TP309三个样品杂交均显示一条带纹，而且杂交带纹在抗病品种地谷与感病品种丽江新团黑谷、TP309间均有差异。表明该基因在水稻基因组中以单拷贝形式存在，并且在抗病材料和感病材料中DNA序列存在差异。图中1，2，3分别代表水稻地谷、丽江新团黑谷、台北309的基因组DNA。
实施例9、功能互补由于该基因不含内含子，以水稻地谷cDNA为模板，以5’-TTGGGTCTAGAAGCATCAACATAGACGTAGCGTGG-3’和5’-TTTGCGTCGACCTAGTTACAGATCACTGTGCCAT-3’为引物(其中带下画线的区域分别为限制性内切酶XbaI，SalI的识别位点，斜体区域为酶切保护碱基)，利用高保真PCR扩增得到该基因的全长，并通过多次测序反复验证其序列正确无误后，将其构建在含有35S启动子pZH01上作为功能互补的表达载体，结果如图6A所示，表明基因Pi-d2构建于表达载体pZH01的烟草花叶病毒启动子35S的下游，得到功能互补的表达载体pZH01/Pi-d2，并利用农杆菌介导转化感病的水稻品种TP309，获得了41个转基因株系，对该41个株系T0代进行分子检测，所用引物为上游5’端5’TTGGCTATCATAGGCGTCC 3’；下游3’端5’ATTTGAAGGCGTTTGCGTAGA 3’。结果如图6B所示，其中3个株系表现为TP309的基因型，35个株系表现为地谷和TP309的杂合型，3个株系表现近为地谷型，表明有38个为阳性的转基因株系，其中基因型呈地谷型的三个株系很可能是目标基因发生了多拷贝整合。图6B中，A为台北309；B为地谷；C为丽江新团黑谷；1-41为转基因T0代，共41株系三种分子带型；*为台北309型(未转入的株系)，共3个；#为地谷型(可能是多拷贝株系)，共3个；杂合型，共35个。
对其中获有种子的20个株系在T1代苗期及分裂盛期分别进行喷雾和注射接种，结果如图6C所示，表明第8、10株系在T1代明显对ZB15具有抗性，进一步对该两个株系在T2代单株接种，并对各株系的抗病、感病单株进行分子检测，所用特异引物5’TTGGCTATCATAGGCGTCC 3’和5’ATTTGAAGGCGTTTGCGTAGA 3’，并用限制性内切酶MluI对PCR产物酶切后电泳。结果如图6D所示，表明在抗病单株中均能检测到目标基因，而在感病单株中则未能检测到目标转基因，说明转基因植株对ZB15的抗性确实是由目标抗病基因Pi-d2提供。图6D中，DL2000是分子量标准；A，B，C依次表示抗病的地谷，感病的丽江新团黑谷，感病的台北309；1至12分别表示该株系的抗病单株；13至17表示该株系的感病单株。
进一步用其他稻瘟病生理小种对该抗病的两个转基因株系后代接种，结果表明该两个转基因株系对稻瘟病小种ZB13，Zhong-10-8-14，Zh2-1，Zk-10-2等是感病的，这一结果进一步验证了转基因株系对ZB15的抗病性是由转入的抗病基因Pi-d2所致，而且具有抗病特异性。同时也证明了该基因就是目标抗病基因Pi-d2。
实施例10、抗病基因的表达分析用稻瘟病生理小种ZB15对地谷和丽江新团黑谷在苗期进行喷雾接种处理，然后按处理后0，12，24，48，96小时(hr)取样按常规方法提取RNA。并对各样品RNA进行DNA去除后用于RT-PCR分析，引物为基因Pi-d2内的一对特异性扩增引物(5’-TTGGCTATCATAGGCGTCC-3’和5’-ATTTGAAGGCGTTTGCGTAGA-3’)，并根据McElroy等(Plant Mol.Biol.14(2)，163-171(1990))发表的水稻Actin基因Racl的cDNA序列设计Actin引物(5’-CCTCGTCTCGACCTTGCTGGG-3’和5’-GAGAACAAGCAGGAGGACGGC-3’)作为对照。结果如图7A所示，抗病基因Pi-d2并不受ZB15的诱导，而且在水稻根、茎和叶中均有表达。Northern的结果如图7B所示也与RT-PCR的结果一致。表明该基因如同所克隆的其他多数植物抗性基因(如Xa21等)一样，为组成型表达，其表达量不是很高，但通过RT-PCR以及Northern杂交均能检测得到。
序列表<160>3<210>1<211>6261<212>DNA<213>水稻属水稻(Oryza sativa var.Lansheng)<400>1agcatcaaca tagacgtagc gtggccgtat ccatttttta atgcatatat aaatttctcc 60atcttttgcg atctctctgt tgctcacagt gtggccgtac acgctaaaca aatactccag120tactactact ccttattata ctcagcgtcc caaaatataa cttctatgct tcaaatttta180tctcgaaatt acactctcct cccaatcaat cacaaccttt caattccacc atttttataa240tcccgtattt aacaaacatt ttatatttca gaatgaaggt agttgtataa tattagtaat300aaataaacta ttcttttttc aaaaaataca ggacgcaatt tgataatgta aagcgtaaat360gcacacttaa ctagcacaac tctactaaat tcctttcaaa attctacacc atgagatctc420tggttctatt tagtgtctgt attgtatttt tttagtatga tatgatctaa acggtaaggt480aataataata acttttacta cctccattcc aaattagtag tcgctttcac ttttttcttt540tttcttgtaa cgtttgacca ttcgtcttat ttaaaaaatt agtgcaaata taaaaataga600gaagtcatac ttaaagtgct tttaataata aagcaaatca taaaaaaaac aaatattaat660tcgagtaaat tgcacccaca gtacaacaac ttgataggtg ggtgcgatat agtgcaagaa720cttgagaatt gaacgttcga gtgcaacaac ttgacaagtg ggtgcgtttt agtacaagaa780cttgacaatt tagtattttg gtgcatcaac taagctaagc atatgctagg tgagtttttc840tcacgatatc aatatgccat tacatagcaa tcatacggat attaccttgt aatattgaat900tttatcttta agaattatac tgcatatccc aatttacaac caattacctt taagaatttt960tgttttcttc acattcctaa atctcaaccg aaatataata atttctacat ctagttaatt 1020gacttttagt tattagttat tagaataaaa atataaatat gcttatatgc aaatccacgc 1080tagtatattg tcaaaataag aacttaaaaa ttgaatatgc ataaaaagtg ctccaaataa 1140ttaagttgtc gcataacttc ttatcttatt gtatcaaaat cgtacgtatc ttacaagttg 1200ttgcatttat acaatcactt ataaaatttt ttagctaaac tgcacatacc tgcgaagttg 1260atgcactaga atgctcgttt ctcaagttat tgcaccaaat tgcacccacc tactaagttg 1320
atacatcatg ggtgtaattt actctattaa ttctataatt tttgaataag acgaaagatt 1380aaaagttaaa aaaaactcaa agcgacaagt actgtaggac ggagaaagta tttattttta 1440cgtgtcttgt agttaagtac agtatatttt taggtggagg gatgaataat ctccctggtt 1500gagaggtgga gagagaagga tggtacccat tgaaaaatga agaattccaa taccacttgc 1560aggtaggttg ttgctcgttt taattcctac tgccctcttg ctgctcacca actgctactc 1620tctcctctcc caccatttcg tcaccctgcc tcctcctgcc tctgcctctg ctcggctagt 1680ctagtgtact actctatctt ctcctcctct ctttctccta cccaaatcca tccacccaac 1740atcttttttc tcagccgtcg tctcatctcg ccttcgtagc gttgcgtcgc gccgcgtcta 1800ccctttccag gtgagcctcc ccgattacat cgctcgttct agctagctag ctagctagct 1860cctgtgttct tgctgtttct ttgtttcttt ttgcgttttt aattttcctt tcttggatct 1920ttctttgcta gctcgttttg atttgtgtgc ttctgtattt gtgtgttttg tgggcgaaag 1980gggggctttc ttggttcttg ttccgggcga ttgttattct tgttctggag aatcggatta 2040cgagtgtgcc ttgcagtgga gttttgtaat gttaggctcc aattgagcaa gaaaaagatg 2100aggttcttgt taaattctag gttatccagc tcttgtttgg ttggctggtc tggaactctg 2160aattccctct gtagcttttt actaggtaat ggaatcccct ttgtaatgca aaatgtagat 2220gcctctgcca tggctatgtt ttatctttag atgtccggaa ttctcttcta agggagccta 2280aacacggcag ttcagttcag attaattatg ggtctgggtt tgaagaaaag aataaaggga 2340gtgaaataaa gaaacaaaca ggtctgaatt tgtgaccctg tttagctgaa agtgaaactg 2400aaaaggggaa cagaaaggaa gaattgacca tcgatttaat gttaggtgtt actgcatatg 2460tgcaagcaaa gattgttctt ttggcagtgg ataatgctct gatggtctct ggccgtgatc 2520aagtggttgt ttttctctgc aggatgtggt ttaccttttg ctgttggtca aaaggaactt 2580gtgccaccac tttctagttt gtttgttttg acacttggtg ctggcaattc ggttgctcac 2640gggctgatca attccttttg ctgatttctt tttgagagaa atcccttttt ctttttcttt 2700tttatatata tgccttttta tcttgcaact cattcatttc tcatgtttct gaaggtaacc 2760tggataagac ggtggaggag ctatcaaatg tttatagagg agctcaagaa accaatagaa 2820agctctatca ggaactgttc ccaattcagg tagtatactg gtttccgttt accaattgtt 2880tcttgctatc gatcgatatc attaatcatc atatcttgtt caagccttct tgaaggttca 2940aacatccttg taaatctgaa ctgagacatc atcttagtca ctgttgtttg tccagcagcc 3000cacctgcatg ttcacatgta atctgacacc actaatttga acctactgtt actgtcaggc 3060attgaaaaaa ccaggcatct ctgaatatcc tctatttgta gctatcatga acaacctgtt 3120tgagacccct cataagattc ttgcatgctt gccagtgcaa tttagaatca agttacttag 3180caaaattttc tgaataaatt ttgtagtatg ctcctcagct atatttattc tgcctatggt 3240
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Gly Asn Ala Phe Leu Gln Ser Gly Gly Gly Ser Asn Val Trp Ala Ala115 120 125Asn Ile Ser Gly Lys Gly Thr Ala Thr Ser Met Gln Leu Leu Asp Ser130 135 140Gly Asn Leu Val Val Leu Gly Lys Asp Ala Ser Ser Pro Leu Trp Gln145 150 155 160Ser Phe Ser His Pro Thr Asp Thr Leu Leu Ser Gly Gln Asn Phe Ile165 170 175Glu Gly Met Thr Leu Met Ser Lys Ser Asn Thr Val Gln Asn Met Thr180 185 190Tyr Thr Leu Gln Ile Lys Ser Gly Asn Met Met Leu Tyr Ala Gly Phe195 200 205Glu Thr Pro Gln Pro Tyr Trp Ser Ala Gln Gln Asp Ser Arg Ile Ile210 215 220Val Asn Lys Asn Gly Asp Ser Ile Tyr Ser Ala Asn Leu Ser Ser Ala225 230 235 240Ser Trp Ser Phe Tyr Asp Gln Ser Gly Ser Leu Leu Ser Gln Leu Val245 250 255Ile Ala Gln Glu Asn Ala Asn Ala Thr Leu Ser Ala Val Leu Gly Ser260 265 270Asp Gly Leu Ile Ala Phe Tyr Met Leu Gln Gly Gly Asn Gly Lys Ser275 280 285Lys Phe Ser Ile Thr Val Pro Ala Asp Ser Cys Asp Met Pro Ala Tyr290 295 300Cys Ser Pro Tyr Thr Ile Cys Ser Ser Gly Thr Gly Cys Gln Cys Pro305 310 315 320Ser Ala Leu Gly Ser Phe Ala Asn Cys Asn Pro Gly Val Thr Ser Ala325 330 335Cys Lys Ser Asn Glu Glu Phe Pro Leu Val Gln Leu Asp Ser Gly Val340 345 350Gly Tyr Val Gly Thr Asn Phe Phe Pro Pro Ala Ala Lys Thr Asn Leu355 360 365
Thr Gly Cys Lys Ser Ala Cys Thr Gly Asn Cys Ser Cys Val Ala Val370 375 380Phe Phe Asp Gln Ser Ser Gly Asn Cys Phe Leu Phe Asn Gln Ile Gly385 390 395 400Ser Leu Gln His Lys Gly Gly Asn Thr Thr Arg Phe Ala Ser Phe Ile405 410 415Lys Val Ser Ser Arg Gly Lys Gly Gly Ser Asp Ser Gly Ser Gly Lys420 425 430His Asn Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Leu Gly Thr Leu Ala Ile Ile435 440 445Gly Val Leu Ile Tyr Ile Gly Phe Trp Ile Tyr Lys Arg Lys Arg His450 455 460Pro Pro Pro Ser Gln Asp Asp Ala Gly Ser Ser Glu Asp Asp Gly Phe465 470 475 480Leu Gln Thr Ile Ser Gly Ala Pro Val Arg Phe Thr Tyr Arg Glu Leu485 490 495Gln Asp Ala Thr Ser Asn Phe Cys Asn Lys Leu Gly Gln Gly Gly Phe500 505 510Gly Ser Val Tyr Leu Gly Thr Leu Pro Asp Gly Ser Arg Ile Ala Val515 520 525Lys Lys Leu Glu Gly Ile Gly Gln Gly Lys Lys Glu Phe Arg Ser Glu530 535 540Val Thr Ile Ile Gly Ser Ile His His Ile His Leu Val Lys Leu Arg545 550 555 560Gly Phe Cys Thr Glu Gly Pro His Arg Leu Leu Ala Tyr Glu Tyr Met565 570 575Ala Asn Gly Ser Leu Asp Lys Trp Ile Phe His Ser Lys Glu Asp Asp580 585 590His Leu Leu Asp Trp Asp Thr Arg Phe Asn Ile Ala Leu Gly Thr Ala595 600 605Lys Gly Leu Ala Tyr Leu His Gln Asp Cys Asp Ser Lys Ile Val His610 615 620
Cys Asp Ile Lys Pro Glu Asn Val Leu Leu Asp Asp Asn Phe Ile Ala625 630 635 640Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ala Lys Leu Met Thr Arg Glu Gln Ser645 650 655His Val Phe Thr Thr Leu Arg Gly Thr Arg Gly Tyr Leu Ala Pro Glu660 665 670Trp Leu Thr Asn Tyr Ala Ile Ser Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Tyr675 680 685Gly Met Val Leu Leu Glu Ile Ile Gly Gly Arg Lys Ser Tyr Asp Pro690 695 700Ser Glu Ile Ser Glu Lys Ala His Phe Pro Ser Phe Ala Phe Lys Lys705 710 715 720Leu Glu Glu Gly Asp Leu Gln Asp Ile Phe Asp Ala Lys Leu Lys Tyr725 730 735Asn Asp Lys Asp Gly Arg Val Glu Thr Ala Ile Lys Val Ala Leu Trp740 745 750Cys Ile Gln Asp Asp Phe Tyr Gln Arg Pro Ser Met Ser Lys Val Val755 760 765Gln Met Leu Glu Gly Val Cys Glu Val Leu Gln Pro Pro Val Ser Ser770 775 780Gln Ile Gly Tyr Arg Leu Tyr Ala Asn Ala Phe Lys Ser Ser Ser Glu785 790 795 800Glu Gly Thr Ser Ser Gly Met Sar Asp Tyr Asn Ser Asp Ala Leu Leu805 810 815Ser Ala Val Arg Leu Ser Gly Pro Arg820 82权利要求
1.一种抗稻瘟病基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)序列表中的SEQ ID №2；3)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；4)与序列表中的SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于所述抗稻瘟病基因是序列表中的SEQ ID №1或SEQ ID №2。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述抗稻瘟病基因的读码框为序列表中SEQ ID №1的自5’端第3361到第5835位碱基或序列表中SEQ ID №2的自5’端第125到第2599位碱基。
4.抗稻瘟病基因的编码蛋白，是具有序列表中SEQ ID №3氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №3的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №3衍生的蛋白质。
5.根据权利要求4所述的蛋白质，其特征在于所述抗稻瘟病基因的编码蛋白是序列表中的SEQ ID №3。
6.根据权利要求4或5所述的蛋白质，其特征在于所述序列表中SEQ ID №3的自氨基端第12-34位氨基酸残基序列为一个跨膜结构域；自氨基端第48-165位氨基酸残基序列是一个与外源凝集素蛋白相似的异体识别结构域；自氨基端第436-458位氨基酸残基序列是一个跨膜结构域；自氨基端第501-771位氨基酸残基序列是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域。
7.含有权利要求1所述抗稻瘟病基因的表达载体和细胞系。
8.扩增权利要求1所述抗稻瘟病基因中任一片段的引物。
9.权利要求1所述抗稻瘟病基因在培育抗病植物品种中的应用。
10.权利要求1所述抗稻瘟病基因中的15个或15个以上连续碱基的寡聚核苷酸在植物抗病相关分析中的应用。
全文摘要
本发明公开一种抗稻瘟病基因及其编码蛋白与应用。本发明所提供的抗稻瘟病基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)序列表中的SEQ ID №2；3)编码序列表中SEQ ID №3蛋白质序列的多核苷酸；4)与序列表中的SEQ ID №1或SEQ ID №2限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。抗稻瘟病基因的编码蛋白，是具有序列表中SEQ ID №3氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №3的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №3的氨基酸残基序列相同活性的由SEQID №3衍生的蛋白质。本发明的基因对培育抗病植物品种，提高农作物产量，扩大作物种植面积具有重要意义。
文档编号C07K14/405GK1629293SQ20031011843
公开日2005年6月22日 申请日期2003年12月16日 优先权日2003年12月16日
发明者朱立煌, 陈学伟, 李仕贵, 徐吉臣 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所