具有提高的凝乳特性的凝乳酶变体的制作方法
【专利摘要】具有提高的凝乳特性的凝乳酶变体。
【专利说明】
具有提高的凝乳特性的凝乳酶变体
技术领域
[0001 ]本发明设及具有提高的凝乳特性的凝乳酶变体。
【背景技术】
[0002] 通过乳凝固酶(例如凝乳酶和胃蛋白酶）的酶促乳凝固是乳酪生产中的最重要工 艺之一。酶促乳凝固是一个两阶段工艺:第一阶段，其中蛋白水解酶凝乳酶或胃蛋白酶攻击 K-酪蛋白，导致酪蛋白胶束结构的亚稳态;第二阶段，其中乳随后凝固并形成凝块。
[0003] 凝乳酶化C 3.4.23.4)和胃蛋白酶化C 3.4.23.1)(哺乳动物胃中的乳凝固酶)是 属于肤酶中的一大类的天冬氨酸蛋白酶。
[0004] 当在胃黏膜细胞中产生时，凝乳酶和胃蛋白酶分别作为无酶活性的前凝乳酶原 (pre-prochymosin)和前胃蛋白酶原存在。当分泌凝乳酶时，N端肤片段，即前片段（pre- fragmentK信号肤)被切除W产生包含原片段(pro-fragment)的凝乳酶原。凝乳酶原是该 酶的基本无活性形式酶，但是其在酸性条件下通过原片段的自动催化性去除被活化而变成 活性凝乳酶。运种活化在适宜的pH条件下在胃腔中体内发生或者在酸性条件下体外发生。
[0005] 牛(Bos taurus)前凝乳酶原、凝乳酶原和凝乳酶的结构和功能特征已得到广泛研 究。牛前凝乳酶原分子的前部分包含16个aa残基并且对应凝乳酶原的原部分的长度是42个 aa残基。活性牛凝乳酶包含323个aa，是两种皆具有活性的形式A和B的混合物。
[0006] 凝乳酶在哺乳动物物种中天然产生，所述哺乳动物例如牛、骆驼、山羊、水牛、绵 羊、猪、人、猴和大鼠。
[0007] 牛凝乳酶已商用于乳品工业多年。
[000引 W002/36752A2(C虹.Hansen))描述了骆驼凝乳酶的重组产生。
[0009] W02013/174840A1 (化r.化nsen)描述了牛和骆驼凝乳酶的突变体/变体。
[001日]W02013/164479A2(DSM)描述了牛凝乳酶的突变体。
[0011] 下文紧接着列出的参考文献在本发明的上下文中可看作描述凝乳酶突变体的参 考文献：
[0012] -Suzuki等：Site directed mutagenesis reveals functional contribution of Thr218,Lys220and Asp304in chymosin,Protein Engineering,第4卷，1990年1月，第 69-71 页；
[0013] -Suzuki等：Alteration of catalytic properties of chymosin by site- directed mutagenesis,Protein Engineering,第2卷，1989年5月，第563-569页；
[0014] -V曰n den Brink等：Incre曰sed production of chymosin by glycosyl曰tion, Journal of biotechnology,第 125卷，2006年9月，第304-310页；
[0015] -Pitts等：Expression and characterisation of chymosin pH optima mutants produced in Tricoderm曰 reesei,Journal of biotechnology,第28卷，1993年3 月，第69-83页；
[0016] -M.G.Williams等：Mutagenesis,biochemical characterization and X-ray structural analysis of point mutants of bovine chymosin,Protein engineering design and selection,第 10卷，1997年9月，第991-997页；
[0017] -Strop等：Engineering enzyme subsite specificity:prep曰r曰tion,kinetic characterization,and x-ray analysis at 2.GANG resolution of Vallllphe site mu1:ated calf chymosin,Biochemistry,第29卷，1990年 10月，第9863-9871 页；
[0018] -Supannee^ ： Site-specific mutations of calf chymosin B which influence mUk-clotting activity,Food Qiemistry,第62卷 1998年6月，第133-139页；
[0019] -Zhang等：Functional implications of disulfide bond,Cys45-Cys50, in recombinant prochymosin,Biochimica et biophysica acta,第1343卷，1997年12月，第 278-286 页。
[0020] 上文提及的现有技术参考文献均未直接且明确地描述下文中所述/要求保护的任 一凝乳酶突变体/变体。
【发明内容】
[0021 ]本发明要解决的问题是提供具有提高的凝乳特性的凝乳酶变体。
[0022] 如本文的工作实施例中所讨论的一一本发明人已鉴定出多种经改进的骆驼(参见 本文中实施例6)和牛/骆驼(参见本文中实施例7)凝乳酶变体。
[0023] 基于对该骆驼和牛变体的比较分析一一本发明人鉴定出多个另外的就W下方面 而言在本文中具有重要意义的氨基酸位置:通过制备运些位置中一个或多个的变体可得到 经改进的凝乳酶变体。
[0024] 如本领域中已知的一一从不同哺乳动物种（例如，如牛、骆驼、绵羊、猪或大鼠）获 得的不同天然野生型凝乳酶多肤序列具有相对高的序列相似性/同一性。
[0025] 在本文的图1中，运通过对本文中相关的不同凝乳酶序列进行比对来例示。
[0026] 鉴于运一相对密切的序列关系一认为不同的天然野生型凝乳酶的3D结构也是相 对类似的。
[0027] 在本发明的上下文中一天然获得的野生型凝乳酶(例如牛凝乳酶或骆驼凝乳酶） 在本文中可W是亲本多肤的一个实例一一即对其进行改变W产生本发明的变体凝乳酶多 肤的亲本多肤。
[0028] 不受理论的限制一认为本文中所讨论的凝乳酶相关的氨基酸位置就W下方面而 言在本文中任意相关的目的凝乳酶(例如，例如牛、骆驼、绵羊、猪、大鼠等的凝乳酶）中具有 普遍重要性一通过制备运些位置中一个或多个的变体一般可得到经改进的凝乳酶变体(例 如，经改进的牛、骆驼、绵羊、猪或大鼠凝乳酶变体）。
[0029] 如本文所讨论的一作为确定目的亲本凝乳酶多肤(例如骆驼、绵羊、牛等）的氨基 酸位置的参照序列，本文中使用公知的牛凝乳酶B前凝乳酶原序列（Genbank登录号 P00794-在本文中公开为沈Q ID N0:1)。
[0030] SEQ ID N0:1的牛凝乳酶B前凝乳酶原在本文中可另称为牛(Bos bovis)凝乳酶B 或者简称为牛凝乳酶。该序列也示出在本文的图1中。
[0031] 本文中相关的另一凝乳酶序列是公知的本文中SEQ ID ^:2的单峰驼(〔曰111611118 化omedarius)凝乳酶序列。其在本文中可另称为骆驼凝乳酶。该序列也示于本文的图1中。
[0032] 在本发明上下文中，认为与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有至少65%序 列同一性的亲本凝乳酶多肤(例如，来自绵羊或大鼠的亲本凝乳酶多肤)在本文中可视为与 例如牛或骆驼凝乳酶具有充分的结构相关性W通过制备如本文中所述的任意氨基酸位置 的变体来进行改进。
[0033] 因此，本发明的第一方面设及一种用于制备分离的凝乳酶多肤变体的方法，其包 括W下步骤：
[0034] (a):在具有凝乳酶活性的亲本多肤中的一个或更多个位置处产生改变，其中所述 改变包含在至少一个氨基酸位置的替换、缺失或插入，所述至少一个氨基酸位置对应于W 下任意位置:70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156、163; 212; 222;223;224;238;246;256;261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、 M、F、Y、W;G309;R312D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320;324;D325Q;326;331; 336;346;361;367和379;W及
[0035] (b):产生并分离步骤(a)的经改变多肤，从而获得所述分离的凝乳酶多肤变体，其 中所述变体具有凝乳酶活性；
[0036] 并且其中：
[0037] (i):通过将所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多肤进行比对来确定所述 亲本多肤的氨基酸位置--即，使用SEQ ID NO: 1的多肤来确定所述亲本多肤的对应氨基 酸序列;且
[0038] (ii):所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有至少65%的序列 同一性，所述成熟多肤为SEQ ID NO: 1的第59位氨基酸至第381位氨基酸；
[0039] 并且前提是所述分离的凝乳酶多肤变体不是选自W下的特定变体：
[0040] Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[0041 ] R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[0042] Y185F+R213Q+Q246E；
[0043] V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
[0044] G128D+L188I+Y326F；
[0045] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0046] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0047] D117化V261A+R312S;
[0048] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D；
[0049] Y79S+L224V+L311I;和
[0050] R119S+L224V+T297S〇
[0化1] 上述前提可视为与上文所讨论的W02013/174840A1 (化r.化nsen)相关一因为运些 特定变体在该文件中进行了明确描述。
[0052]如技术人员在本发明上下文中所理解的一该前提仅与特定的提及变体相关。
[0化3] 例如，仅包含Q24犯替换（即，不包含G309D、S329P和/或D337E)的变体不是在该前 提之内的此类特定变体-即，其不是本发明上下文中放弃要求保护的。
[0054]如本领域中已知的一技术人员可基于其公知常识来常规地产生并纯化凝乳酶及 凝乳酶变体。换言之，一旦技术人员拥有本文中相关的具有凝乳酶活性的目的亲本多肤(例 如，来自牛、骆驼、绵羊、猪或大鼠），则对技术人员来说产生运样的目的亲本凝乳酶的变体 是常规工作。
[0055] 本发明的第二方面设及一种分离的凝乳酶多肤变体，其是通过第一方面的方法或 所述方法在本文中相关的任意实施方案获得的。
[0056] 与上述第二方面相关的术语"获得的"应理解为该分离的凝乳酶多肤变体已通过 第一方面的方法或所示方法在本文中相关的任意实施方案获得。因此，与第二方面相关的 术语"获得的"不应被理解为可获得的。
[0057] 如文中所讨论的一在本文中的工作实施例中，使用SEQ ID NO: 1(牛）的多肤作为 亲本多肤来制备变体一运样的变体在本文中可称为牛凝乳酶变体。
[0058] 因此，本发明的第=方面设及分离的凝乳酶多肤变体：
[0059] (a):其在具有凝乳酶活性的亲本多肤中的一个或更多个位置处包含改变，其中所 述改变包含对应于W下任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换、缺失或插入:70;75;77; 79；90；102；103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；222；223；224；238；246； 256;261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、 S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320;324;D325Q;326;331;336;346;361;367和379;且
[0060] (b):其中所述变体具有凝乳酶活性；
[0061] 并且其中：
[0062] (i):通过将所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多肤进行比对来确定所述 亲本多肤的氨基酸位置一即，使用SEQ ID NO: 1的多肤来确定所述亲本多肤的对应氨基酸 序列;且
[0063] (ii):所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有至少90%的序列 同一性，所述成熟多肤为SEQ ID NO: 1的第59位氨基酸至第381位氨基酸;且
[0064] (iii):所述分离的变体多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有小于 100%的序列同一性；
[0065] 并且前提是所述分离的凝乳酶多肤变体不是选自W下的特定变体：
[0066] Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[0067] R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[006引 Y185F+R213Q+Q246E；
[0069] V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
[0070] G128D+L188I+Y326F；
[0071] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0072] G128化R312S+S313Y+Y326F;和
[0073] D117化V261A+R312S;
[0074] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D [00 巧]Y79S+L224V+L311IW及
[0076] R119S+L224V+T297S〇
[0077] 如本文中所讨论的-在本文中的工作实施例中，使用SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶)的 多肤作为亲本多肤来制备变体一一运样的变体在本文中可称为骆驼凝乳酶变体。
[0078] 因此，本发明的第四方面设及分离的凝乳酶多肤变体，其包含：
[0079] (a):在具有凝乳酶活性的亲本多肤中的一个或更多个位置处的改变，其中所述改 变包含对应于W下任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换、缺失或插入:70; 75; 77; 79; 90；102；103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；222；223；224；238；246；256； 261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、S、T、 N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320;324;D325Q;326;331;336;346;361;367和379;且
[0080] (b):其中所述变体具有凝乳酶活性；
[0081] 并且其中：
[0082] (i):通过将所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多肤进行比对来确定所述 亲本多肤的氨基酸位置一即，使用SEQ ID NO: 1的多肤来确定所述亲本多肤的对应氨基酸 序列;且
[0083] (ii):所述亲本多肤与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成熟多肤具有至少90%的序 列同一性，所述成熟多肤为SEQ ID NO:2的第59位氨基酸至第381位氨基酸;且
[0084] (iii):所述分离的变体多肤与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成熟多肤具有小于 100%的序列同一性；
[0085] 并且前提是所述分离的凝乳酶多肤变体不是选自W下的特定变体：
[00 化]Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[0087] R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[0088] Y185F+R213Q+Q246E；
[0089] V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
[0090] G128D+L188I+Y326F；
[0091] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0092] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0093] D117化V261A+R312S;
[0094] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D；
[00 巧]Y79S+L224V+L311I;和
[0096] R119S+L224V+T297S〇
[0097] 本文中所述的分离的凝乳酶多肤变体可根据领域而用于例如制备目的食品产品 或饲料产品（例如，如目的乳基产品，例如其可W是乳酪产品）。
[0098] 因此，本发明的第五方面设及一种用于制备食品产品或饲料产品的方法，其包括 向食品或饲料成分添加有效量的本文中所述的分离凝乳酶多肤变体并进行进一步的制备 操作W获得所述食品产品或饲料产品。
[0099] 在下文仅通过实例来描述本发明的实施方案。
[0100] 定义
[0101] 本文中相关术语的所有定义均根据技术人员针对本文中相关的技术背景所理解 的。
[0102] 术语"凝乳酶"设及EC 3.4.23.4类的酶。凝乳酶具有高特异性并且其通过切割酪 蛋白K-链中的单个105-Ser-Phe-|-Met-Ala-108键来使乳凝固。本领域中使用的一个别名 是凝乳素(rennin)。
[0103] 术语"凝乳酶活性"设及技术人员在本发明上下文中所理解的凝乳酶的凝乳酶活 性。
[0104] 技术人员知晓如何确定本文中相关的凝乳酶活性。
[0105] 在本文中的工作实施例4中，提供了确定凝乳酶比活一另称为凝固活性或凝乳活 性一的标准方法的一个实例。
[0106] 在本文中的工作实施例5中，提供了确定蛋白水解活性的标准方法的一个实例。
[0107] 如本领域中已知的一本文中相关的所谓C/P比通过将凝固比活(C)除W蛋白水解 活性(P)来确定。
[0108] 如本领域中已知的一较高的C/巧k通常意味着在例如乳酪生产期间由于非特异性 蛋白质降解而导致的蛋白质损失降低，即乳酪产量得W提高，并且在熟化期间乳酪中苦味 的生成降低。
[0109] 术语"分离的变体"意指通过人工修饰的变体。在一个方面，如通过SDS PAGE确定 的，变体具有至少1 %纯度，例如至少5 %纯度，至少10 %纯度，至少20 %纯度，至少40 %纯 度，至少60 %纯度，至少80 %纯度和至少90 %纯度。
[0110] 术语"成熟多肤"意指在翻译和任何翻译后修饰(例如，N端加工、C端截短、糖基化、 憐酸化等)之后的最终形式的肤。在本发明上下文中，本文中相关的成熟凝乳酶多肤可视为 活性凝乳酶多肤序列一即没有前部分和/或原部分序列。本文中相关的成熟多肤实例是例 如SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤，其为SEQ ID NO: 1的氨基酸第59位氨基酸至第381 位氨基酸氨基酸;或者是SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成熟多肤，其为SEQ ID N0:2的第59 位氨基酸至第381位氨基酸。
[0111] 术语"亲本"或"具有凝乳酶活性的亲本多肤"意指对其进行改变W产生本发明的 酶变体的多肤。亲本可为天然产生(野生型）的多肤或其变体。
[0112] 术语"序列同一性"设及两条氨基酸序列之间或两条核巧酸序列之间的相关度。
[0113] 出于本发明的目的，两条氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如在EMBOSS软件 包化MBOSSil'he European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000, Trends Genet. 16 : 276-277 )(优选3.0.0版本或更新版本）的Needle程序中执行的 化edleman-Wunsch算法（Needleman和Wunsch, 1970, J.Mol.Biol. 48:443-453)来确定。所用 的可选参数是开放空位罚分10、空位延伸罚分0.5和邸L0SUM62(化0SUM62的EMBOSS版本)置 换矩阵。使用化edle标记的"最长同一性"的输出（使用-nobrief选项获得)用作百分比同一 性并如下计算：
[0114] (相同残基X 100)/(比对长度-比对中空位的总数）。
[0115] 出于本发明的目的，两条脱氧核巧酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软 件包（EMBOSS:1116 European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等，2000,同 上）（优选3.0.0版本或更新版本）的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法 (化edleman及Wunsch, 1970,如上所述)来确定。所用的可选参数是开放空位罚分10、空位延 伸罚分0.5和抓NA即LL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)置换矩阵。使用化edle标记的"最长同 一性"的输出（使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性并且如下计算：
[0116] (相同的脱氧核巧酸x100 )/(比对长度-比对中空位的总数）。
[0117] 术语"变体"意指在一个或更多个(数个)位置处包含改变（即，替换、插入和/或缺 失）的具有凝乳酶活性的肤。替换意指占据一个位置的氨基酸被一个不同的氨基酸取代;缺 失意指占据一个位置的氨基酸的移除;插入意指邻近占据一个位置的氨基酸添加1至3个氨 基酸。
[011引氨基酸可W是天然或非天然氨基酸一例如，被例如D-丙氨酸的例如特定D-异构体 (或D-形式)替换在理论上是可行的。
[0119] 术语"野生型"凝乳酶肤意指由天然存在的生物体(例如，自然界中可见的哺乳动 物(例如，骆驼或牛））表达的凝乳酶。
[0120] 附图
[0121] 图1:本文中相关的不同凝乳酶序列的比对。所示的"牛凝乳酶B"是本文中SEQ ID N0:1的牛凝乳酶并且所示的"单峰驼"是本文中SEQ ID N0:2的骆驼凝乳酶。使用如本文中 所述的SEQ ID NO: 1之牛凝乳酶作为参照序列，可例如看出牛凝乳酶在第10位中具有"V"而 骆驼凝乳酶在相同的第10位中具有"A"。例如还可看出牛/大鼠在第352位中具有而骆 驼/双峰驼(C._bactt;rianus)在相同的第352位中具有"E"。
[0122] 针对图1中所示的凝乳酶序列一一绵羊与牛SEQ ID NO: 1具有94.5%序列同一性； 双峰驼与牛569 10^:1具有83.2%序列同一性;单峰驼(569 10^:2的骆驼凝乳酶)与牛 SEQ ID NO: 1具有84%序列同一性;猪与牛沈Q ID NO: 1具有80.3%序列同一性，并且大鼠 与牛沈Q ID NO: 1具有71.9%序列同一性。
[0123] 如技术人员在本发明上下文中所理解的一例如绵羊、双峰驼、骆驼、猪或大鼠凝乳 酶的成熟多肤序列与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶一即SEQ ID NO: 1的第59至381位氨基酸)之成 熟多肤的本文中相关的序列同一性百分比相对类似于上文提及的序列同一性百分比。
[0124] 图2:牛凝乳酶的3D结构一一3D结构是公众可获得的。作为一个实例，示出了其中 第296和294位氨基酸在牛凝乳酶中存在的位置。
[01巧]图3:示出了多种凝乳酶变体的REMCAT和Proteol值的图示。
[0126] 图4:各个替换的效应的PCA图。所有的位置编号均比文本中所使用的编号小15。
【发明内容】
[0127]
[012引确定目的凝乳酶的氨基酸位置
[0129] 如上所讨论的一作为用于确定本文中相关的目的凝乳酶多肤(例如，骆驼、绵羊、 牛等)的氨基酸位置的参照序列，本文中使用在本文中公开为SEQ ID NO: 1的公知牛凝乳酶 序列。
[0130] 出于本发明的目的，使用SEQ ID N0:1(牛凝乳酶）中公开的多肤来确定另一凝乳 酶多肤中的对应氨基酸残基。将另一凝乳酶多肤的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1中公开的多 肤进行比对，并且基于该比对，如本文中工作实施例1中所述使用ClustalW算法来确定对应 于SEQ ID NO: 1中所公开多肤中的任意氨基酸残基的氨基酸位置编号。
[0131] 对另一凝乳酶多肤中对应氨基酸残基的鉴定可通过使用如EMBOSS软件包 (EMBOSS:Hie Eluropean Molecular Biology Open Software Suite,I?ice等，2000,Trends Genet. 16 :276-277)(优选3.0.0版本或更新版本）的Needle程序中执行的Needleman- Wunsch算法（Needleman和Wunsch，1970，J.Mol. Biol. 48:443-453)来证实。
[0132] 基于上述公知的计算机程序一对于技术人员而言，确定本文中相关的目的凝乳酶 多肤(例如，骆驼、绵羊、牛等)的氨基酸位置是常规工作。
[0133] 在本文的图1中示出了比对的一个实例。
[0134] 仅作为一个实例一在图1中，可W例如看出本文中所使用的牛参照SEQ ID NO: 1在 第50位具有"G"而"单峰驼"（本文中SEQ ID N0:2)在该第50位中具有"A"。
[0。引变体的命名
[0136] 在描述本发明的变体中，为了便于参考，采用W下所述的命名法。采用公认的 IUPAC单字母或=字母氨基酸缩写。
[0137] 在下文该"命名"部分中所讨论的特定变体可W不是本发明的本文中相关变体一 良P，该"命名"部分仅是为了描述本文中相关的所使用命名本身。
[0138] 替换:对于氨基酸替换，使用^下命名法:原始氨基酸，位置，替换的氨基酸。因此， 在第226位苏氨酸在理论上被丙氨酸替换表示为叮hr226Ala"或叮226A"。多个突变通过加 号（叩'）隔开，例如"Gly205A巧+Ser41 IPhe"或"G205R+S411F"表示第205和411位甘氨酸(G) 和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)替换。例如表示为"226A"的替换指第226位亲 本氨基酸(例如，T、Q、S或另一亲本氨基酸)被丙氨酸替换。
[0139] 缺失:对于氨基酸缺失，使用^下命名法:原始氨基酸，位置，*。因此，第195位甘氨 酸的缺失表示为％lyl95*"或"G195*"。多个缺失是通过加号（"+")隔开，例如/'Glyl95*+ Ser411*"或"G195*+S411*"。
[0140] 插入:对于氨基酸插入，使用W下命名法:原始氨基酸，位置，原始氨基酸，插入的 氨基酸。因此，在第195位的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为％lyl95GlyLys"或％195GK"。多 个氨基酸的插入表示为[原始氨基酸，位置，原始氨基酸，插入的氨基酸#1，插入的氨基酸# 2;等]。例如，在195位的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为"Glyl95GlyLysAla"或 '它 195GKA"。
[0141] 在运样的情况下，插入的氨基酸残基通过将小写字母加到所插入氨基酸残基之前 的氨基酸残基的位置编号来编号。在上述实施例中，序列因此是： 「01421
[014引多个改变：包含多个改变的变体通过加号（"+")隔开，例如"Argl70Tyr + Glyl95Glu"或"R170Y+G195E"表示第170和195位精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸替 换。
[0144] 不同替换：当可在一个位置处引入不同的替换时，通过逗号将不同的替换隔开，例 如"Argl70Tyr，Glu"或"R170Y，E"，表示第170位精氨酸被酪氨酸或谷氨酸替换。因此， 叮 yr 167Gly，Ala+Argl 70Gly，Ala"或叮167G，A+R170G，心'表示 W 下变体：
[0145] 。17^67617+4'邑17061/'、'叮7^67617+4'邑17041曰"、'叮7^6741曰+4'邑17061/'和 叮yrl67Ala+Argl70Ala"。
[01W 用于制备分离的凝乳酶多肤变体的方法
[0147]如上文所讨论的一如本领域中已知的，技术人员可基于其公知常识来常规地产生 并纯化凝乳酶及凝乳酶变体。
[0148] 换言之，一旦技术人员拥有本文中相关的具有凝乳酶活性的目的亲本多肤(例如， 来自牛、骆驼、绵羊、猪或大鼠），则对技术人员来说生产运样的目的亲本凝乳酶的变体是常 规工作。
[0149] 生产并分离凝乳酶（变体或亲本）的合适方法的一个实例可为如例如W002/ 36752A2(化r.化nsen)中所述通过公知的例如基于真菌重组表达/生产的技术来进行。
[0150] 在具有凝乳酶活性的亲本多肤中的一个或多个位置处产生改变对技术人员而言 也是常规工作，其中所述改变包含至少一个氨基酸位置中的置换、缺失或插入。
[0151] 如技术人员已知的一运可例如通过基于所谓的定点诱变和重组表达/生产的技术 来进行。
[0152] 确定本文中相关的亲本多肤(例如，骆驼或牛野生型凝乳酶)和/或本文中相关的 变体是否具有凝乳酶活性对于技术人员而言也是常规工作。
[0153] 如本领域中已知的一凝乳酶活性可通过所谓的C/巧k来确定，而C/巧k通过将凝固 比活(C)除W蛋白水解活性(P)来确定。
[0154] 如本领域中已知的一较高的C/巧k通常意味着在例如乳酪生产期间由于非特异的 蛋白质降解而导致的蛋白质损失降低，即乳酪产量得W提高，并且在熟化期间乳酪中苦味 的生成降低。
[0155] 在本文中的工作实施例4中描述了一种确定凝固比活(C)的合适方法，并且在本文 中的工作实施例5中描述了一种确定蛋白水解活性(P)的合适方法。
[0156] 优选地，本文中所述的分离的凝乳酶多肤变体是运样的变体，其中所述变体具有 与包含本文中SEQ ID NO: 1之成熟多肤的牛凝乳酶的C/巧k相比提供更高C/巧k的凝乳酶活 性。
[0157] 优选地，本文中所述的分离的凝乳酶多肤变体是运样的变体，其中所述变体具有 与包含本文中SEQ ID NO:2之成熟多肤的骆驼凝乳酶的C作比相比提供更高C/巧k的凝乳酶 活性。
[0158] 更优选地，本文中所述的分离的凝乳酶多肤变体是运样的变体，其中所述变体具 有：
[0159] -与包含本文中SEQ ID NO: 1之成熟多肤的牛凝乳酶的C/巧k相比提供更高C/巧k 的凝乳酶活性；W及
[0160] -与包含本文中SEQ ID NO: 2之成熟多肤的骆驼凝乳酶的C/巧k相比提供更高C/P 比的凝乳酶活性。
[0161] 如本文所讨论的-作为用于确定本文中相关的目的凝乳酶多肤(例如骆驼、绵羊、 牛等)的氨基酸位置的参照序列，本文中使用在本文中公开为SEQ ID NO: 1的公知牛凝乳酶 序列。
[0162] 如上文所讨论的一基于例如本文中所讨论的计算机序列比对程序一对于技术人 员而言，确定本文中相关的目的凝乳酶多肤(例如，骆驼、绵羊、牛等）的本文中相关氨基酸 位置是常规工作。
[0163] 例如本文中第一方面的方法中的术语"所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶） 的成熟多肤具有至少65%序列同一性"可视为与用于制备其本文中相关变体的亲本凝乳酶 多肤的基于序列的限制相关。
[0164] 换言之一认为与成熟牛凝乳酶具有至少65%序列同一性的成熟亲本凝乳酶多肤 (例如，绵羊或猪）与例如牛或骆驼凝乳酶具有足够的结构同一性W是本文中相关的一即， 在本发明上下文中，认为与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有至少65%序列同一性 的成熟亲本凝乳酶多肤(例如，来自例如绵羊或大鼠）在本文中可视为与例如牛或骆驼凝乳 酶具有足够的结构相关性W通过制备如本文中所述的任意氨基酸位置的变体来进行改进。
[0165] SEQ ID N0:2的骆驼凝乳酶多肤与SEQ ID N0:1的牛多肤（即，从第1位到第381位 的完整SEQ ID NO: 1，其包含前序列和原序列）具有84%序列同一性。
[0166] 如技术人员在本发明上下文中所理解的一具有凝乳酶活性的本文中相关亲本多 肤可W已经是例如诸如对应野生型凝乳酶的变体。
[0167] 例如，与SEQ ID N0:2之野生型骆驼凝乳酶多肤相比具有例如5至10个改变(例如， 替换）的骆驼凝乳酶变体仍会是如在例如本文中第一方面中所要求的与SEQ ID NO: 1(牛） 之成熟多肤具有至少65%序列同一性的亲本多肤。
[0168] 换言之，本文中相关的分离的凝乳酶多肤变体可包含除例如本文中第一方面的位 置之外的其他位置中的改变(例如，替换）。
[0169] 关于本文图1中所述的凝乳酶序列一绵羊与牛SEQ ID NO: 1具有94.5%序列同一 性;双峰驼与牛SEQ ID NO: 1具有83.2%序列同一性;猪与牛SEQ ID NO: 1具有80.3%序列 同一性，并且大鼠与牛沈Q ID NO: 1具有71.9%序列同一性。
[0170] 如技术人员在本发明上下文中所理解的一例如成熟绵羊、双峰驼、骆驼、猪或大鼠 凝乳酶与SEQ ID NO: 1之成熟多肤(牛凝乳酶一即SEQ ID NO: 1的第59至381位氨基酸）的本 文中相关序列同一性百分比相对地类似于与上文提及的序列同一性百分比。
[0171] 优选变体
[0172] 如上文所讨论的一例如第一方面设及一种分离的凝乳酶多肤变体，其中改变包含 对应于W下任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换、缺失或插入:70; 75; 77; 79; 90; 102; 103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；223；224；238；246；256；261；K279V； L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、S、T、N、Q、C、U、G、 ?、八、￥、1、1^、]?、尸、￥、胖；320;324;03259;326;331;336;346;361;367和379。
[0173] -个优选实施方案设及一种分离的凝乳酶多肤变体，其中改变包含对应于例如本 文中第一方面的任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换、缺失或插入。
[0174] 可优选地，至少一个改变是替换一即，本文中相关的优选实施方案设及运样的分 离的凝乳酶多肤变体，其中改变包含对应于例如本文中第一方面的任意位置的至少一个氨 基酸位置中的替换。
[0175] 优选地，一种分离的凝乳酶多肤变体，其中改变包含对应于W下任意位置的至少 一个氨基酸位置中的替换：L70M;F75Y;K77T;Y79S;V90LD102N;I103V;K120Q;F124Y; H134Q；I154L；D156V；L163E；S212A；S222G；M223E；L224V；L238I；Q246E；V256I；V261A； K279V;L280I;F281A;R300D、E、S、T、N、Q;R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V;D325Q;Y326F; K336D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;S331Y;Q346E;I361レV367I;或K379P。
[0176] 优选地，所述替换为其中该替换是92466;1(279￥;1?3009;1?125;￥326。或者1(3360、 E、S、T、N、Q，其中优选的K336替换是K336Q。
[0177] 如技术人员在本发明上下文中所理解的一如果亲本凝乳酶多肤已在第156位具有 例如"r，则讨论对该特定亲本凝乳酶多肤进行156V替换没有意义。如本文的图1中可见一 大鼠野生型凝乳酶在第156位具有"V"-156V替换可视为与图1的特定大鼠凝乳酶多肤序列 在本文中不相关。
[0178] 如技术人员在本发明上下文中所理解的一如果亲本凝乳酶多肤在第156位不具有 例如"护，则讨论对该特定亲本凝乳酶多肤进行D156V替换没有意义。如本文的图1中可见一 大鼠野生型凝乳酶在第156位具有"V"-因此D156V替换可视为与图1的特定大鼠凝乳酶多 肤序列在本文中不相关。
[0179] 在一个实施方案中，所述替换为其中该替换是：
[0180] H1：MQ+Q246化 Y326F;
[0181] D117化L280I+G309D;
[0182] H1：MQ+D156V+G309D;
[0183] D156V+Q246化L280I;
[0184] D117 化 H1：MQ+L280I;
[0185] D156V+G309D巧326F;
[0186] D117化D156V+D325M;
[0187] L280I+D325M+Y326F；
[0188] D117化Q246化Y326F;
[0189] D117 化 H1：MQ+D325M;
[0190] N310Q+N349Q+K279V；
[0191] R300Q+N307D；
[0192] N307D+G309D；
[0193] N307D+R312S；
[0194] R300Q+K336Q；
[01 巧]N307D+K336Q;
[0196] G309D+R312S；
[0197] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[019 引 N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0199] L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q；
[0200] L280I+G309D+L224V+E320T+T235S；
[0201] L280I+G309W+K77T+R324I；
[0202] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0203] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0204] L280I+G309D+Q220S+L224V+H1：MQ;
[0205] L280I+G309W+L238I+T342S;
[0206] L280I+G309W+F75Y+Y79S ；
[0207] L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E；
[0208] L280I+G309D+L224V+I103V+L238I；
[0209] L280I+G309D+F124Y+Q346化 115 化；
[0210] L280I+G309D+I154L+V261A+V367I；
[0211] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0212] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0213] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0214] L280I+G309D 巧 79S+T342S+115化；
[0215] L280I+G309D巧79S+I103V+F281A;
[0216] L280I+G309D+V256I+V261A+K379P；
[0217] L280I+G309D+Q：M 犯+K77T+T235S;
[021 引 L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[0219] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0220] L280I+G309D巧326F+L70M+D325Q;
[0221] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0222] L280I+G309W+S212A+V261A；
[0223] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0224] L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N；
[02巧]L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[02%] L280I+G309W+L238I+T342S;
[0227] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0228] L280I+G309D+L70M+T342S；
[02 巧]L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A;
[0230] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0231 ] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0232] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0233] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0234] L280I+G309D+V213F 巧3201+￥901^;或
[0235] L280I+G309W+S212A+V261A〇
[0236] 在一个更优选的实施方案中，所述替换为其中该替换是：
[0237] D117化L280I+G309D;
[0238] L280I+D325M+Y326F；
[0239] D117 化 Q246化 Y326F;
[0240] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;或
[0241] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q。
[0242] 具有凝乳酶活性的优选亲本多肤:
[0243] 优选地，亲本多肤具有与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有至少70%序列 同一性，更优选地亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有至少75%序列同一 性。
[0244] 仅作为一个实例一本文中合适的相关亲本多肤可W是例如牛凝乳酶A-如在本领 域中已知的，牛凝乳酶B与本文中SEQ ID N0:1的牛凝乳酶B相比可能只具有一个氨基酸差 异。
[0245] 如上文所讨论的一在本文中的工作实施例中，使用SEQ ID NO: 1(牛）的多肤作为 亲本多肤来制备变体一运样的变体本文中可称为牛凝乳酶变体。
[0246] 因此，在一个优选实施方案中一亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤 至少90%序列同一性，更优选地，亲本多肤与SEQ ID N0:1(牛凝乳酶)的成熟多肤具有至少 95%序列同一性，并且甚至更优选地亲本多肤具有与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤 至少97%序列同一性。可优选地，亲本多肤是SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多肤。
[0247] 如技术人员在本发明上下文中所理解的一具有凝乳酶活性的本文中相关亲本多 肤可W已经是例如诸如对应野生型凝乳酶的变体。
[024引例如，与SEQ ID NO: 1之成熟野生型骆驼凝乳酶多肤相比具有例如5至10个改变 (例如，替换）的牛凝乳酶变体仍会是与SEQ ID NO: 1 (牛凝乳酶）的成熟多肤具有至少95% 序列同一性的亲本多肤。
[0249] SEQ ID NO: 1(牛）的成熟多肤的长度为323个氨基酸一因此，与SEQ ID NO: 1的成 熟野生型牛凝乳酶多肤相比具有例如25个氨基酸替换的牛凝乳酶变体将不会是与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多肤具有至少95%序列同一性的亲本多肤。
[0250] 换言之并且一般来说一本文中相关的分离的凝乳酶多肤变体可包含除例如本文 中第一方面的位置之外的其他位置的改变(例如，置换）。
[0251] 如上文所讨论的一在本文中的工作实施例中，使用SEQ ID N0:2(骆驼）的多肤用 作亲本多肤来制备变体一一运样的变体在本文中可称为骆驼凝乳酶变体。
[0252] 因此，在一个优选实施方案中一亲本多肤具有与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成 熟多肤具有至少90%序列同一性，更优选地亲本多肤与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成熟 多肤具有至少95%序列同一性，并且甚至更优选地亲本多肤与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶） 的成熟多肤具有至少97%序列同一性。可优选地，亲本多肤是SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶)的 成熟多肤。
[0253] 如技术人员在本发明上下文中所理解的一与SEQ ID N0:2(骆驼）的成熟多肤具有 至少90%序列同一性的亲本多肤仍在本文中第一方面的点（ii)中基于SEQ ID NO: 1(牛）的 序列同一性要求之内一即，其将是与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有至少65%序 列同一性的亲本多肤。
[0254] 分离的牛凝乳酶变体
[02W]如上文所讨论的一在本文中的工作实施例中，使用SEQ ID NO: 1(牛）的多肤作为 亲本多肤来制备变体一运样的变体在本文中可称为牛凝乳酶变体。
[0256] 如上文所讨论的一因此，第S方面设及一种分离的凝乳酶多肤变体：
[0257] (a):其在具有凝乳酶活性的亲本多肤中的一个或更多个位置处包含改变，其中所 述改变包含对应于W下任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换、缺失或插入:70;75;77; 79；90；102；103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；222；223；224；238；246； 256;261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、 S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320;324;D325Q;326;331;336;346;361;367和379;且
[0258] (b):其中所述变体具有凝乳酶活性；
[0巧9] 并且其中：
[0260] (i):通过将所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多肤进行比对来确定所述 亲本多肤的氨基酸位置-即，使用SEQ ID NO: 1的多肤来确定所述亲本多肤的对应氨基酸序 列;且
[0%1] (ii):所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有至少90%的序列 同一性，所述成熟多肤为SEQ ID NO: 1的第59位氨基酸至第381位氨基酸;且
[0262] (iii):所述分离的变体多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有小于 100%的序列同一性；
[0263] 并且前提是所述分离的凝乳酶多肤变体不是选自W下的特定变体：
[0264] Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[02 化]R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[0266] Y185F+R213Q+Q246E；
[0%7] V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
[0268] G128D+L188I+Y326F；
[0269] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0270] G128化R312S+S313Y+Y326F;和
[0271] D117化V261A+R312S;
[0272] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D
[0273] Y79S+L224V+L311I和
[0274] R119S+L224V+T297S〇
[0275] 上述定义和优选实施方案也适用于该方面。
[0276] 优选地，本文中所述的分离的牛凝乳酶多肤变体是运样的变体，其中所述变体具 有与包含SEQ ID NO: 1之成熟多肤的牛凝乳酶的C作比相比提供更高C作比的凝乳酶活性。
[0277] 在一个优选实施方案中一亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多肤具有至 少92%序列同一性，更优选地亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有至少 95%序列同一性，并且甚至更优选地亲本多肤具有与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤 至少97%序列同一性。可优选地，亲本多肤是SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多肤。
[0278] 如技术人员在本发明上下文中所理解的一分离的凝乳酶变体可包含除上文给出 氨基酸位置之外的氨基酸位置中的改变(例如替换）。
[0279] 例如，与SEQ ID NO: 1之野生型牛凝乳酶多肤相比具有例如5至10个改变(例如替 换）的牛凝乳酶变体仍会是与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有至少95%序列同一 性的亲本多肤。
[0280] 可优选地，分离的牛凝乳酶变体与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤相比包含 少于30个氨基酸改变(例如替换），或者可优选地分离的牛凝乳酶变体与SEQ ID NO: 1(牛凝 乳酶）的成熟多肤相比包含少于20个氨基酸改变(例如替换），或者可优选地分离的牛凝乳 酶变体与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多肤相比包含少于10个氨基酸改变(例如替换）， 或者可优选地分离的牛凝乳酶变体与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤相比包含少于5 个氨基酸改变(例如替换）。
[0281] 如技术人员在本发明上下文中所理解的一上述点（iii)中的术语"所述分离的变 体多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多肤具有小于100%序列同一性"设及本文中所述 的分离牛凝乳酶变体理所当然不应具有与SEQ ID NO: 1的公知野生型牛凝乳酶序列100% 相同的多肤序列。
[0282] -个优选实施方案设及运样的分离的牛凝乳酶多肤变体，其中改变包含对应于第 =方面的任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换、缺失或插入。
[0283] 可优选地，至少一个改变是替换一即，本文中相关的优选实施方案设及运样的分 离的凝乳酶多肤变体，其中改变包含对应于第=方面的任意位置的至少一个氨基酸位置中 的替换。
[0284] 优选地，所述替换是 L70M;F75Y;K77T;Y79S;V90UD102N;I103V;N108D;D117N; F114Y;K120Q;F124Y;H134Q;I15A;D156V;L163E;S212A;M223E;L224V;L238I;Q246E; V256I;V261A;K279V;L280I;F281A;R300D、E、S、T、N、Q;R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V; D325Q;Y326F;K336D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;S331Y;Q346E;I36a;V367I; 或K379P。
[02 化]优选地，所述替换是 Q246E;K279V;R300Q;R312S;Y326F或者K336D、E、S、T、N、Q，其 中一个优选的K336替换是K336Q。
[0286] 在一个优选实施方案中，所述替换是：
[0287] H1：MQ+Q246化 Y326F;
[0288] D117 化 L280I+G309D;
[0289] H1：MQ+D156V+G309D;
[0290] D156V+Q246化L280I;
[0291] D117 化 H1：MQ+L280I;
[0292] D156V+G309D巧326F;
[0 巧 3] D117化D156V+D325M;
[0294] L280I+D325M+Y326F；
[0 巧 5] D117 化 Q246化 Y326F;
[0 巧 6] D117 化 H1：MQ+D325M;
[0297] N310Q+N349Q+K279V；
[0298] R300Q+N307D；
[0299] N307D+G309D；
[0300] N307D+R312S；
[0301] R300Q+K336Q；
[0302] N307D+K336Q；
[0303] G309D+R312S；
[0304] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0305] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;
[0306] L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q；
[0307] L280I+G309D+L224V+E320T+T235S ；
[0308] L280I+G309W+K77T+R324I；
[0309] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0310] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0311] L280I+G309D+Q220S+L224V+H1：MQ;
[0312] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0313] L280I+G309W+F75Y+Y79S；
[0314] L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E；
[0315] L280I+G309D+L224V+I103V+L238I；
[0316] L280I+G309D+F124Y+Q346化 115 化；
[0317] L280I+G309D+I154L+V261A+V367I；
[0318] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0319] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0320] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0321] L280I+G309D 巧 79S+T342S+I15 化；
[0322] L280I+G309D巧79S+I103V+F281A;
[0323] L280I+G309D+V256I+V261A+K379P；
[0324] L280I+G309D+Q：M 犯+K77T+T235S;
[03 巧]L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[03%] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A;
[0327] L280I+G309D巧326F+L70M+D325Q;
[0328] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0329] L280I+G309W+S212A+V261A；
[0330] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0331] L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N；
[0332] L280I+G309D+H239化R324I+D325Q;
[0333] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0334] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0335] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0336] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0337] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0338] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0339] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0340] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0：341] L280I+G309D+V213F 巧3201+￥901^;或
[0342] L280I+G309W+S212A+V261A〇
[0343] 在一个更优选的实施方案中，所述替换为其中该替换是：
[0344] D117化L280I+G309D;
[0345] L280I+D325M+Y326F；
[0346] D117化Q246化Y326F;
[0347] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;或
[0348] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q。
[0349] 分离的骆驼凝乳酶变体:
[0350] 如上文所讨论的一在本文中的工作实施例中，使用SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的 多肤作为亲本多肤来制备变体一运样的变体在本文中可称为骆驼凝乳酶变体。
[0351] 如上文所讨论的一因此，第四方面设及运样的分离的凝乳酶多肤变体：
[0352] (a):其在具有凝乳酶活性的亲本多肤中的一个或更多个位置处包含改变，其中所 述改变包含对应于W下任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换、缺失或插入:70;75;77; 79；90；102；103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；223；224；238；246；256； 261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、S、T、 N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320;324;D325Q;326;331;336;346;361;367和379;且
[0353] (b):其中所述变体具有凝乳酶活性；
[0巧4] 并且其中：
[0355] (i):通过将所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多肤进行比对来确定所述 亲本多肤的氨基酸位置一即，使用SEQ ID NO: 1的多肤来确定所述亲本多肤的对应氨基酸 序列;且
[0356] (ii):所述亲本多肤与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成熟多肤具有至少90%的序 列同一性，所述成熟多肤为SEQ ID NO:2的第59位氨基酸至第381位氨基酸;且
[0357] (iii):所述分离的变体多肤与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成熟多肤具有小于 100%的序列同一性；
[0358] 并且前提是所述分离的凝乳酶多肤变体不是选自W下的特定变体：
[0359] Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[0360] R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[0361] Y185F+R213Q+Q246E；
[0362] V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
[0363] G128D+L188I+Y326F；
[0364] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[03 化]G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0366] D117化V261A+R312S;
[0367] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D；
[0368] Y79S+L224V+L311I;和
[0369] R119S+L224V+T297S〇
[0370] 上述定义和优选实施方案也适用于该方面。
[0371] 优选地，本文中所述的分离的牛凝乳酶多肤变体是运样的变体，其中所述变体具 有与包含SEQ ID NO: 2之成熟多肤的骆驼凝乳酶的C/P比相比提供更高C/P比的凝乳酶活 性。
[0372] 在一个优选实施方案中一亲本多肤与SEQ ID NO: 2(骆驼凝乳酶)的成熟多肤具有 至少92%序列同一性，更优选地亲本多肤与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成熟多肤具有至 少95%序列同一性，并且甚至更优选地亲本多肤具有与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成熟 多肤至少97%序列同一性。可优选地，亲本多肤是SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肤。
[0373] 如技术人员在本发明上下文中所理解的一分离的凝乳酶变体可包含除上文给出 氨基酸位置之外的氨基酸位置中的改变(例如替换）。
[0374] 例如，与SEQ ID N0:2之野生型骆驼凝乳酶多肤相比具有例如5至10个改变(例如 替换）的骆驼凝乳酶变体仍会是与SEQ ID NO: 2(骆驼凝乳酶）的成熟多肤具有至少95%序 列同一性的亲本多肤。
[0375] 可优选地，分离的骆驼凝乳酶变体与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成熟多肤相比 包含少于30个氨基酸改变(例如替换），或者可优选地分离的骆驼凝乳酶变体与SEQ ID NO: 2(骆驼凝乳酶）的成熟多肤相比包含少于20个氨基酸改变(例如替换），或者可优选地分离 的骆驼凝乳酶变体与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肤相比包含少于10个氨基酸改变 (例如替换），或者可优选地分离的骆驼凝乳酶变体与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成熟多 肤相比包含少于5个氨基酸改变(例如替换）。
[0376] 如技术人员在本发明上下文中所理解的一上述点（iii)中的术语"所述分离的变 体多肤与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶)的成熟多肤具有小于100%序列同一性"设及本文中所 述的分离骆驼凝乳酶变体理所当然不应具有与SEQ ID N0:2的公知野生型骆驼凝乳酶序列 100%相同的多肤序列。
[0377] -个优选实施方案设及运样的分离的骆驼凝乳酶多肤变体，其中改变包含对应于 第四方面的任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换、缺失或插入。
[0378] 可优选地，至少一个改变是替换一即，本文中相关的优选实施方案设及运样的分 离的凝乳酶多肤变体，其中改变包含对应于第四方面的任意位置的至少一个氨基酸位置中 的替换。
[03 巧]优选地，所述替换是 L70M;F75Y;K77T;Y79S;V90UD102N;I103V;K120Q;F124Y; 115化；L163E;S212A;M223E;L224V;L238I;Q24犯；V256I;V261A;K279V;R300D、E、S、T、N、Q; R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V;Y326F;K336D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W; S331Y;Q346E; I36a; V367I;或K379P。
[0380]优选地，所述替换是 Q246E;K279V;R300Q;R312S;Y326F或者K336D、E、S、T、N、Q，其 中一个优选的K336替换是K336Q。
[0381 ]在一个优选实施方案中，所述替换是：
[0382] H1：MQ+Q246化 Y326F;
[0383] D117 化 L280I+G309D;
[0384] H1：MQ+D156V+G309D;
[0385] D156V+Q246化 L280I;
[0386] D117 化 H1：MQ+L280I;
[0387] D156V+G309D巧326F;
[0388] D117化D156V+D325M;
[0389] L280I+D325M+Y326F；
[0390] D117 化 Q246化 Y326F;
[0391] D117 化 H1：MQ+D325M;
[0392] N310Q+N349Q+K279V；
[0393] R300Q+N307D；
[0394] N307D+G309D；
[0395] N307D+R312S；
[0396] R300Q+K336Q；
[0397] N307D+K336Q；
[0398] G309D+R312S；
[0399] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0400] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0401 ] L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q；
[0402] L280I+G309D+L224V+E320T+T235S；
[0403] L280I+G309W+K77T+R324I；
[0404] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0405] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0406] L280I+G309D+Q220S+L224V+H1：MQ;
[0407] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0408] L280I+G309W+F75Y+Y79S；
[0409] L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E；
[0410] L280I+G309D+L224V+I103V+L238I ；
[0411] L280I+G309D+F124Y+Q346化 115 化；
[0412] L280I+G309D+I154L+V261A+V367I；
[0413] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0414] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0415] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0416] L280I+G309D 巧 79S+T342S+115化；
[0417] L280I+G309D巧79S+I103V+F281A;
[0418] L280I+G309D+V256I+V261A+K379P；
[0419] L280I+G309D+Q：M 犯+K77T+T235S;
[0420] L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[0421] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0422] L280I+G309D巧326F+L70M+D325Q;
[0423] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0424] L280I+G309W+S212A+V261A；
[04 巧]L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F;
[04%] L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N;
[0427] L280I+G309D+H239化R324I+D325Q;
[0428] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0429] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0430] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0431] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0432] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0433] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0434] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0435] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0436] L280I+G309D+V213F 巧3201+￥901^;或
[0437] L280I+G309W+S212A+V261A〇
[0438] 在一个更优选的实施方案中，所述替换为其中该替换是：
[0439] D117化L280I+G309D;
[0440] L280I+D325M+Y326F；
[0441 ] D117化Q246化Y326F;
[0442] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;或
[0443] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q。
[0444] 用于制备乳基产品的方法
[0445] 如上文所讨论的-本文中所述的分离的凝乳酶多肤变体可根据领域而用于一例如 制备目的乳基产品（例如，如乳酪产品）。
[0446] 如上文所讨论的一本发明的一个方面设及一种用于制备食品产品或饲料产品的 方法，其包括向食品或饲料成分添加有效量的如本文中所述的分离凝乳酶多肤变体并进行 进一步的制备步骤W获得食品产品或饲料产品。
[0447] 优选地，所述食品产品或饲料产品是一种乳基产品并且其中所述方法包括向乳添 加有效量的如本文中所述的分离凝乳酶多肤变体并进行进一步的制备步骤制W获得乳基 产品。
[0448] 所述乳可W是例如大豆乳、绵羊乳、山羊乳、水牛乳、巧牛乳、美洲驼乳、骆驼乳或 牛乳。
[0449] 所述乳基产品可W是例如发酵乳产品、夸克或乳酪。
[04加]本文中的各个方面/实施方案一W权利要求的形式示出
[0451] 本文中所述的本发明的各个方面和优选实施方案可所谓的权利要求的形式 示出/描述一如下进行。
[0452] 1.-种用于制备分离的凝乳酶多肤变体的方法，其包括W下步骤：
[0453] (a):在具有凝乳酶活性的亲本多肤中的一个或更多个位置处产生改变，其中所述 改变包含对应于W下任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换、缺失或插入:70;75;77; 79；90；102；103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；222；223；224；238；246； 256;261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、 S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320;324;D325Q;326;331;336;346;361;367和379;? 及
[0454] (b):产生并分离步骤(a)的经改变多肤，从而获得所述分离的凝乳酶多肤变体，其 中所述变体具有凝乳酶活性；
[0455] 并且其中：
[0456] (i):通过将所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多肤进行比对来确定所述 亲本多肤的氨基酸位置一即，使用SEQ ID NO: 1的所述多肤来确定所述亲本多肤的对应氨 基酸序列;且
[0457] (ii):所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有至少65%序列同 一性，所述成熟多肤为SEQ ID NO: 1的第59位氨基酸至第381位氨基酸；
[0458] 并且前提是所述分离的凝乳酶多肤变体不是选自W下的特定变体：
[0459] Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[0460] R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[0461] Y185F+R213Q+Q246E；
[0462] V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
[0463] G128D+L188I+Y326F；
[0464] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[04 化]G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0466] D117化V261A+R312S;
[0467] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D；
[0468] Y79S+L224V+L311I;和
[0469] R119S+L224V+T297S〇
[0470] 2.如权利要求1所述的用于制备分离的凝乳酶多肤变体的方法，其中所述分离的 凝乳酶多肤变体具有：
[0471] -与包含SEQ ID N0:1之成熟多肤的牛凝乳酶的C/巧k相比提供更高C/P比的凝乳 酶活性;和
[0472] -与包含SEQ ID NO: 2之成熟多肤的骆驼凝乳酶的C/巧k相比提供更高C/P比的凝 乳酶活性。
[0473] 3.如前述权利要求中任一项所述的用于制备分离的凝乳酶多肤变体的方法，其中 所述改变包含对应于权利要求1所述的任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换、缺失或 插入。
[0474] 4.如前述权利要求中任一项所述的用于制备分离的凝乳酶多肤变体的方法，其中 所述改变包含对应于权利要求1所述的任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换。
[0475] 5.如权利要求4所述的用于制备分离的凝乳酶多肤变体的方法，其中所述替换是 L70M；F75Y；K77T；Y79S；V90L；D102N；I103V；N108D；D117N；F114Y；K120Q；F124Y；H134Q； I15A;D156V;L163E;S212A;S222G;M223E;L224V;L238I;Q246E;V256I;V261A;K279V; L280I;F281A;R300D、E、S、T、N、Q;R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V;D325Q;Y326F;K336D、E、 S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;S331Y;Q346E;I361レV367I;或K379P。
[0476] 6.如权利要求5所述的用于制备分离的凝乳酶多肤变体的方法，其中所述替换是 Q24 犯；K279V; R300Q; R312S; Y326F 或者 K336D、E、S、T、N、Q。
[0477] 7.如权利要求6所述的用于制备分离的凝乳酶多肤变体的方法，其中所述替换是 K336Q。
[0478] 8.如权利要求4所述的用于制备分离的凝乳酶多肤变体的方法，其中所述替换是： [04 巧]H1：MQ+Q246化 Y326F;
[0480] D117化L280I+G309D;
[0481 ] H1：MQ+D156V+G309D;
[0482] D156V+Q246化L280I;
[0483] D117 化 H1：MQ+L280I;
[0484] D156V+G309D巧326F;
[0485] D117化D156V+D325M;
[04化]L280I+D325M+Y326F;
[0487] D117化Q246化Y326F;
[0488] D117 化 H1：MQ+D325M;
[0489] N310Q+N349Q+K279V；
[0490] R300Q+N307D；
[0491 ] N307D+G309D；
[0492] N307D+R312S；
[0493] R300Q+K336Q；
[0494] N307D+K336Q；
[04巧]G309D+R312S;
[0496] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0497] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0498] L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q；
[0499] L280I+G309D+L224V+E320T+T235S；
[0如0] L280I+G309W+K77T+R324I ；
[0如 1 ] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0502] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0503] L280I+G309D+Q220S+L224V+H1：MQ;
[0504] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0 如 5] L280I+G309W+F75Y+Y79S；
[0 如 6] L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E；
[0 如 7] L280I+G309D+L224V+I103V+L238I；
[0 如引 L280I+G309D+F124Y+Q346化 115 化；
[0509] L280I+G309D+I154L+V261A+V367I；
[0510] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0511] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0512] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0513] L280I+G309D 巧 79S+T342S+I15 化；
[0514] L280I+G309D巧79S+I103V+F281A;
[0515] L280I+G309D+V256I+V261A+K379P；
[0516] L280I+G309D+Q：M 犯+K77T+T235S;
[0517] L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[051 引 L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0519] L280I+G309D巧326F+L70M+D325Q;
[0520] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0521] L280I+G309W+S212A+V261A；
[0522] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0523] L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N；
[0524] L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[05 巧]L280I+G309W+L238I+T342S;
[05%] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0527] L280I+G309D+L70M+T342S；
[052引 L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0529] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0530] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0531] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0532] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0533] L280I+G309D+V213F 巧3201+￥901^;或
[0534] L280I+G309W+S212A+V261A〇
[0535] 9.如权利要求4所述的用于制备分离的凝乳酶多肤变体的方法，其中所述替换是：
[0536] D117 化 L280I+G309D;
[0537] L280I+D325M+Y326F；
[053引 D117 化 Q246化 Y326F;
[0539] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;或
[0540] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q。
[0541] 10.如前述权利要求中任一项所述的用于制备分离的凝乳酶多肤变体的方法，其 中所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多肤具有至少75%序列同一性。
[0542] 11.如权利要求10所述的用于制备分离的凝乳酶多肤变体的方法，其中所述亲本 多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的成熟多肤具有至少95%序列同一性。
[0543] 12.如权利要求1至9中任一项所述的用于制备分离的凝乳酶多肤变体的方法，其 中所述亲本多肤与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成熟多肤具有至少95%序列同一性，所述 成熟多肤为SEQ ID NO:2的第59位氨基酸至第381位氨基酸。
[0544] 13.-种分离的凝乳酶多肤变体，其是通过权利要求1至12中任一项所述的方法获 得的。
[0545] 14.-种分离的凝乳酶多肤变体：
[0546] (a):其在具有凝乳酶活性的亲本多肤中的一个或更多个位置处包含改变，其中所 述改变包含对应于W下任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换、缺失或插入:70;75;77; 79；90；102；103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；222；223；224；238；246； 256;261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、 S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320;324;D325Q;326;331;336;346;361;367和379;且
[0547] (b):其中所述变体具有凝乳酶活性；
[054引并且其中
[0549] (i):通过将所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多肤进行比对来确定所述 亲本多肤的氨基酸位置一即，使用SEQ ID NO: 1的所述多肤来确定所述亲本多肤的对应氨 基酸序列;且
[0550] (ii):所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有至少90%的序列 同一性，所述成熟多肤为SEQ ID NO: 1的第59位氨基酸至第381位氨基酸;且
[0551] (iii):所述分离的变体多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肤具有小于 100 %序列同一性；
[0552]并且前提是所述分离的凝乳酶多肤变体不是选自W下的特定变体：
[0 巧 3] Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[0 巧 4] R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[0 巧 5] Y185F+R213Q+Q246E；
[0 巧 6] V261A+V263I+G309W+L3111+Y326F；
[0巧7] G128D+L188I+Y326F；
[0 巧引 G128 化 R312S+S313Y+Y326F;
[0 巧 9] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0560] D117化V261A+R312S;
[0561 ] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D
[0562] Y79S+L224V+L311I和
[0563] R119S+L224V+T297S〇
[0564] 15.如权利要求14所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述分离的变体具有与包 含SEQ ID NO: 1之成熟多肤的牛凝乳酶的C作比相比提供更高C作比的凝乳酶活性。
[0565] 16.如权利要求14至15中任一项所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述亲本多 肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的所述成熟多肤具有至少97%序列同一性。
[0566] 17.如权利要求14至16中任一项所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述分离的 牛凝乳酶变体与SEQ ID N0:1(牛凝乳酶）的所述成熟多肤相比包含少于10个氨基酸改变 (例如替换）。
[0567] 18.如权利要求14至17中任一项所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述改变包 含对应于权利要求14所述的任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换、缺失或插入。
[0568] 19.如权利要求16至18中任一项所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述改变包 含对应于权利要求14所述的任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换。
[0569] 20.如权利要求19所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述替换是L70M;F75Y; K77T；Y79S；V90L；D102N；I103V；N108D；D117N；F114Y；K120Q；F124Y；H134Q；I154L； D156VL163E;S212A;S222G;M223E;L224V;L238I;Q24 犯；V256I;V261A;K279V;L280I;F281A; R300D、E、S、T、N、Q;G309D、W;R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V;D325Q;Y326F;K336D、E、S、T、 N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;S331Y;Q346E;I361レV367I;或K379P。
[0570] 21.如权利要求20所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述替换是Q246E;K279V; R300Q;R312S;Y326F 或者 K336D、E、S、T、N、Q。
[0571] 22.如权利要求21所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述替换是K336Q。
[0572] 23.如权利要求19所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述替换是
[0573] H1：MQ+Q246化 Y326F;
[0574] D117化L280I+G309D;
[化巧]H1：MQ+D156V+G309D;
[0576] D156V+Q246化L280I;
[0577] D117 化 H1：MQ+L280I;
[057引 D156V+G309D巧326F;
[0579] D117化D156V+D325M;
[0580] L280I+D325M+Y326F；
[0581] D117化Q246化Y326F;
[0582] D117 化 H1：MQ+D325M;
[0583] N310Q+N349Q+K279V；
[化 84] R300Q+N307D；
[0585] N307D+G309D；
[05 化]N307D+R312S;
[化 87] R300Q+K336Q；
[058引 N307D+K336Q；
[0589] G309D+R312S；
[0590] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0591 ] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0592] L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q；
[0593] L280I+G309D+L224V+E320T+T235S ；
[0594] L280I+G309W+K77T+R324I；
[05M ] L2801+G309D+H134Q+V213F+F281A;
[0596] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0597] L280I+G309D+Q220S+L224V+H1：MQ;
[059引 L280I+G309W+L238I+T342S；
[0599] L280I+G309W+F75Y+Y79S；
[0600] L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E；
[0601 ] L280I+G309D+L224V+I103V+L238I ；
[0602] L280I+G309D+F124Y+Q346化 115 化；
[0603] L280I+G309D+I154L+V261A+V367I；
[0604] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0605] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0606] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0607] L280I+G309D 巧 79S+T342S+115化；
[060引 L280I+G309D巧79S+I103V+F281A;
[0609] L280I+G309D+V256I+V261A+K379P；
[0610] L280I+G309D+Q：M 犯+K77T+T235S;
[0611] L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[0612] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0613] L280I+G309D巧326F+L70M+D325Q;
[0614] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0615] L280I+G309W+S212A+V261A；
[0616] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0617] L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N；
[0618] L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[0619] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0620] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0621] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0622] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0623] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0624] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[06 巧]L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[06%] L280I+G309W+L238I+T342S;
[0627] L280I+G309D+V213F 巧3201+￥901^;或
[062引 L280I+G309W+S212A+V261A0
[0629] 24.如权利要求19所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述替换是：
[0630] D117化L280I+G309D;
[0631] L280I+D325M+Y326F；
[0632] D117化Q246化Y326F;
[0633] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;或
[0634] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q。
[0635] 25. -种分离的凝乳酶多肤变体：
[0636] (a):其在具有凝乳酶活性的亲本多肤中一个或多个位置处包含改变，其中所述改 变包含对应于W下任意位置的至少一个氨基酸位置的替换、缺失或插入:70;75;77;79;90; 102；103；108；114；117；120；124；134；154；156；163；212；222；223；224；238；246；256；261； K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;G309;R312D、E、S、T、N、Q、 0、1]、6、口、4、￥、1、1^、]\1、尸、￥、胖；320;324;03259;326;331;336;346;361;367和379;且
[0637] (b):其中所述变体具有凝乳酶活性；
[063引并且其中：
[0639] (i):通过将所述亲本多肤与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶)的多肤进行比对来确定所述 亲本多肤的氨基酸位置一即，使用SEQ ID NO: 1的所述多肤来确定所述亲本多肤的对应氨 基酸序列;且
[0640] (ii):所述亲本多肤与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成熟多肤具有至少90%序列 同一性，所述成熟多肤为SEQ ID N0:2的第59位氨基酸至到第381位氨基酸;且
[0641] (iii):所述分离的变体多肤与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶)的所述成熟多肤具有小 于100 %序列同一性；
[0642] 并且前提是所述分离的凝乳酶多肤变体不是选自W下的特定变体：
[0643] Q24犯+G309D+S329P+D337E;
[0644] R125Q+G128 化肥 04R+Q246化 S284T;
[0645] Y185F+R213Q+Q246E；
[0646] V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F；
[0647] G128D+L188I+Y326F；
[0648] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0649] G128化R312S+S313Y+Y326F;
[0化0] D117 化 V261A+R312S;
[0化 1 ] D216S+L224V+V263I+F281V+G309D；
[0 化 2] Y79S+L224V+L311I;和 [0化3] R119S+L224V+T297S〇
[0654] 26.如权利要求25所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述分离的变体具有与包 含SEQ ID N0:2之成熟多肤的骆驼凝乳酶的C作比相比提供更高C作比的凝乳酶活性。
[0655] 27.如权利要求25至26中任一项所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述亲本多 肤与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶)的所述成熟多肤具有至少97%序列同一性。
[0656] 28.如权利要求25至26中任一项所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述分离的 骆驼凝乳酶变体与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶)的所述成熟多肤相比包含少于10个氨基酸改 变(例如替换）。
[0657] 29.如权利要求25至28中任一项所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述改变包 含对应于权利要求23所述的任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换、缺失或插入。
[0658] 30.如权利要求25至29中任一项所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述改变包 含对应于权利要求23所述的任意位置的至少一个氨基酸位置中的替换。
[0659] 31.如权利要求30所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述替换是L70M;F75Y; K77T;Y79S;V901^;D102N;I103V;N108D;D117N;F114Y;K120Q;F124Y;H134Q;I15A;D156V; L163E;S212A;S222G;M223E;L224V;D325Q;L238I;Q2^E;V256I;V261A;K279V;L280I; F281A;R300D、E、S、T、N、Q;G309D、W;R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V;Y326F;K336D、E、S、T、 N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;S331Y;Q346E;I361レV367I;或K379P。
[0660] 32.如权利要求31所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述替换是Q246E;K279V; R300Q;R312S;Y326F 或者 K336D、E、S、T、N、Q。
[0661] 33.如权利要求32所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述替换是K336Q。
[0662] 34.如权利要求30所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述替换是：
[0663] H1：MQ+Q246化 Y326F;
[0664] D117化L280I+G309D;
[0665] H1：MQ+D156V+G309D;
[0666] D156V+Q246化 L280I;
[0667] D117 化 H1：MQ+L280I;
[066引 D156V+G309D巧326F;
[0669] D117化D156V+D325M;
[0670] L280I+D325M+Y326F；
[0671] D117化Q246化Y326F;
[0672] D117 化 H1：MQ+D325M;
[0673] N310Q+N349Q+K279V；
[0674] R300Q+N307D；
[0675] N307D+G309D；
[0676] N307D+R312S；
[0677] R300Q+K336Q；
[067引 N307D+K336Q；
[0679] G309D+R312S；
[0680] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0681 ] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q；
[0682] L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q；
[0683] L280I+G309D+L224V+E320T+T235S ；
[0684] L280I+G309W+K77T+R324I；
[0685] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0686] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0687] L280I+G309D+Q220S+L224V+H1：MQ;
[0688] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0689] L280I+G309W+F75Y+Y79S；
[0690] L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E；
[0691] L280I+G309D+L224V+I103V+L238I；
[0692] L280I+G309D+F124Y+Q346化 115 化；
[0693] L280I+G309D+I154L+V261A+V367I；
[0694] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0695] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0696] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0697] L280I+G309D 巧 79S+T342S+115化；
[0698] L280I+G309D巧79S+I103V+F281A;
[0699] L280I+G309D+V256I+V261A+K379P；
[0700] L280I+G309D+Q：M 犯+K77T+T235S;
[0701] L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[0702] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0703] L280I+G309D巧326F+L70M+D325Q;
[0704] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0705] L280I+G309W+S212A+V261A;
[0706] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0707] L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N；
[0708] L280I+G309D+肥39化R324I+D325Q;
[0709] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0710] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;
[0711] L280I+G309D+L70M+T342S；
[0712] L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A；
[0713] L280I+G309D巧79S+L224V+S212A;
[0714] L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F；
[0715] L280I+G309D+H134Q+M223化L70M;
[0716] L280I+G309W+L238I+T342S；
[0717] L280I+G309D+V213F 巧320T+V901^;或
[0718] L280I+G309W+S212A+V261A〇
[0719] 35.如权利要求30所述的分离的凝乳酶多肤变体，其中所述替换是：
[0720] D117化L280I+G309D;
[0721] L280I+D325M+Y326F；
[0722] D117化Q246化Y326F;
[0723] R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;或
[0724] N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q。
[0725] 36.-种用于制备食品产品或饲料产品的方法，其包括向食品或饲料成分添加有 效量的根据权利要求14至35中任一项所述的分离的凝乳酶多肤变体，W及进行进一步的制 备步骤W获得所述食品产品或饲料产品。
[0726] 37.如权利要求35所述的用于制备食品产品或饲料产品的方法，其中所述产品是 乳基产品，并且其中所述方法包括向乳添加有效量的根据权利要求14至36中任一项所述的 分离的凝乳酶多肤变体W及进行进一步的制备步骤W获得所述乳基产品。
[0727] 38.如权利要求37所述的用于制备乳基产品的方法，其中所述乳是大豆乳、绵羊 乳、山羊乳、水牛乳、巧牛乳、美洲驼乳、骆驼乳或牛乳。
[0728] 39.如权利要求36至38中任一项所述的用于制备乳基产品的方法，其中所述乳基 产品是发酵乳产品、夸克或乳酪。 实施例：
[0729] 实施例1:凝乳酶蛋白序列及变体序列的比对和编号
[0730] 使用如邸1(邸I，工具，多重序列比对，化USTALr，ht化：//www.ebi .ac.址/Tools/ msa/clustalw2/)所提供的并如Larkin MA,Blackshields G,B;rown NP,化enna R, McGettigan PA,McWilliam H,Valentin F,Wallace IM,film A,Lopez R,Thompson JD, G化son TJ,Higgins DG(2007).Bioinformatics 23(21) ,2947-2948中所述的Clus化IW算 法来比对凝乳酶蛋白序列。
[0731] 用于多重序列比对的ClustalW2设置为蛋白质加权矩阵二化0SUM、空位开放= 10、 空位延伸=〇,〇5、空位间距=8、无末端空位、ITERATI0N=none、NUMIT邸=1、化USTERING = NJ。
[0732] 作为参照序列，使用牛凝乳酶B前凝乳酶原(Genbank登录号P00794-在本文中公 开为SEQ ID N0:1)，其中N端甲硫氨酸的编号为UMRCL……）并且C端异亮氨酸(在蛋白质序 列…LAKAI中）的编号为381。将变体针对牛B前凝乳酶原进行比对并根据对应的牛凝乳酶残 基对残基编号。
[07削实施例2:凝乳酶变体的设计
[0734] 使用不同的策略来设计凝乳酶变体。
[0735] 当提及骆驼凝乳酶时，提及包含本文中SEQ ID N0:2的多肤的骆驼凝乳酶。
[0736] SEQ ID NO: 2的骆驼凝乳酶可视为用于制备其骆驼凝乳酶变体的具有凝乳酶活性 的本文中相关的亲本多肤。
[0737] 当提及牛凝乳酶时，提及包含本文中SEQ ID N0:1的多肤的牛凝乳酶。
[0738] SEQ ID NO: 1的牛凝乳酶可视为用于制备其牛凝乳酶变体的具有凝乳酶活性的本 文中相关的亲本多肤。
[0739] 骆驼凝乳酶的变体基于比对一大组与牛凝乳酶B相比具有25%或更大同一性的公 知天冬氨酸蛋白酶序列来设计。
[0740] -般将变化引入在高变区中，而不改变保守区。在每个变体构建体中引入多个改 变，确保每个单一突变均存在于多个变体构建体中（对于结果讨论一参见下文的实施例6)。
[0741] 牛凝乳酶的变体基于将牛和骆驼凝乳酶进行比较来设计。将牛残基例如改变为骆 驼的对应残基(对于结果讨论一参见下文的实施例7)。
[07创实施例3:凝乳酶变体酶材料的制备
[0743] 所有的凝乳酶变体均作为合成基因合成并克隆到基本上对应于pGAMpR-C(描述于 W002/36752A2中）的真菌表达载体中。
[0744] 将载体转化到大肠杆菌中并使用本领域技术人员已知的标准分子生物学方案来 纯化质粒DNA。
[0745] 将变体质粒单独地转化到黑曲霉(Aspergi 1 lus niger)或构巢曲霉(Aspergi 1 lus nidulans)菌株中，基本上如W002/36752A2中所述制备蛋白质并使用标准的色谱技术进行 纯化。
[0746] 如本领域中已知的一技术人员可根据其公知常识来制备并纯化凝乳酶及凝乳酶 变体一例如本文中所述的牛和骆驼凝乳酶变体。
[0747] 实施例4:凝乳酶比活的确定 [074引4.1凝固活性的确定
[0749] 使用REMCAT方法来确定凝乳活性，所述REMCAT方法是由International Daiir F'ederation开发的标准方法（IDF方法）。
[0750] 凝乳活性由标准乳底物发生可见絮凝所需的时间来确定，所述标准乳底物由低 热、低脂的乳粉末与〇.5g/升的氯化巧溶液(抑>6.5)制备而成。将凝乳(rennet)样品的凝 固时间与参照标准物的凝固时间进行比较，所述参照标准物具有已知的凝乳活性并且根据 IDF标准110B与该样品具有相同的酶组成。在相同的化学和物理条件下测量样品和参照标 准物。使用84mM乙酸pH 5.5缓冲液将变体样品调节至约3這〇]/1111。在此之后，将20化1酶添 加至放置于水浴中的玻璃试管中的10ml经预加热乳，所述水浴能够在恒定揽拌下维持32°C ±rc的恒溫。
[0751] 根据下式来计算相对于与样品具有相同酶组成的标准物的凝乳总凝乳活性（强 度），单位为国际凝乳单位(IMCUVml:
[0巧 2]
[0753] S标准物:针对凝乳的国际参照标准物的凝乳活性。
[0754] T标准物:对标准物稀释物获得的W秒计的凝固时间。
[0755] D样品:样品的稀释因子
[0756] D标准物:标准物的稀释因子
[0757] T样品:从添加酶到絮凝时间的对经稀释凝乳样品获得的W秒计的凝固时间
[075引对于实施例9中骆驼变体评价中的凝固活性确定，使用iilMCU方法来代替REMCAT方 法。与REMCAT相比，凝乳酶变体在iilMCU测定中的絮凝时间通过在96孔微量滴定板中在UV/ VIS读板器中在800nm下的0D测量结果来确定。记录每个板上的凝固强度已知的参照标准物 的不同稀释物的标准曲线。样品通过将酶在84mM乙酸、0.1%t;ritonX-100,pH5.5中稀释 来制备。在32°C下的反应通过向25uL酶样品添加250UL标准乳底物来起始，所述标准乳底物 包含4%(w/w)低热、低脂的乳粉末和7.5%(w/w)氯化巧(pH>6.5)。凝乳酶变体W国际凝乳 单位(IMCUVml计的凝乳活性基于相对于标准曲线的样品絮凝时间来确定。
[0759] 4.2总蛋白质含量的确定
[0760] 总蛋白质含量使用来自化ermo Scientific的Pierce BCA蛋白质测定试剂盒遵循 提供商的说明来确定。
[0761] 4.3凝固比活的计算
[0762] 凝固比活（IMCU/mg总蛋白质)通过将凝固活性（IMCU/ml)除W总蛋白质含量(mg总 蛋白质/ml)来确定。
[076引实施例5:蛋白水解活性的确定
[0764] 总蛋白水解活性使用巧光标记的Bodipy-FL酪蛋白作为底物化nz化ek;Molecular Bioprobes，E6638)来测量。经pH不灵敏性绿色巧光Bodipy-化重度标记的酪蛋白衍生物导 致缀合物的巧光几乎完全巧灭。蛋白酶催化的水解释放巧光Bodipy-FL。该方法非常灵敏， 运对本实验而言必不可少，因为CHYMAX M在迄今已知的所有促凝剂中具有最低的总蛋白水 解活性。
[0765] 该测定在底物终浓度为0.04mg/ml的调节至期望抑的0.2M憐酸盐缓冲液中进行。 在将1份底物与1份酶(二者均在憐酸盐缓冲液中制备）混合之前，将所有的酶变体相对于 50IMCU/ml归一化(根据实施例4)。将底物和酶在96孔Nunc Fluoro微量滴定板中混合，密封 并在32°C下溫育60分钟。在溫育之后，解除密封并在巧光计中记录巧光。对于实施例9和10 中评价的变体，将1份底物与1份未经归一化的酶样品在386孔Nunc Fluoro微量滴定板中混 合并在巧光计中于32°C下连续记录巧光10小时。使用巧光增加的线性部分的斜率来确定总 蛋白水解活性。
[07W 实施例6:骆驼凝乳酶变体的评价
[0767] 对于所有的变体，根据实施例4在PH6.5下确定凝固比活（（IMCU/mg总蛋白质），并 根据实施例5在抑6.5下确定蛋白水解活性。通过将凝固比活（IMCU/mg)除W蛋白水解活性 来确定所有变体在pH 6.5下的C作比。
[0768] 包括骆驼野生型基因作为参照。
[0769] 具有多个替换的变体
[0770] 可W推断出，存在明显的组合效应，其中不同的替换对相应的效应具有影响。
[0771]
[0772] 可W得出结论，变体1、2、3、4、8、9、10和11具有较高的凝乳比活，其中变体2、8、10 和11具有最强的提高。
[0773] 可W得出结论，变体2和9具有降低的蛋白水解活性。
[0774] 可W得出结论，变体2、9和10具有增加的C作比。
[0775] 基于此，变体2是最优选的变体，而变体9和10也显示出优选特征。
[077引单独突变
[0777] 由于所有的变体都包含多个突变，因此使用统计学方法和3D结构分析来对经分级 变体的数据进行更详细研究W确定具有正或负效应的单独氨基酸改变。
[0778] 单独氨基酸改变的效应可总结如下，但是在很大程度上取决于不同变体中的其他 氨基酸改变。基于运些，优选的突变是D117N、Q246E、G 309D、Y326F和L280I。
[0779]
[0780] 术语'V'指正氨基酸交换一即，"++"比'V'更正。
[0781 ]术语指负氨基酸交换一即，比更负。
[0782] 术语"正"指对变体的乳酪制备特性具有正效应，即认为提高的凝固活性（"C")和 增加的C/P比是正的（V'或"++")，而认为增加的总蛋白水解活性（"P")是负特性或 。评定指示相对中和的效应。
[0783] 表格右列的说明设及单独突变位于骆驼凝乳酶的3D结构中的位置。骆驼凝乳酶的 3D结构是公众可获得的。
[0784] 结论;
[0785] 上述结果证明，骆驼凝乳酶中的W下单独突变是优选的（即，与骆驼野生型凝乳酶 相比C作比提高）：D117N、Q246E、G 309D、Y326F、L280I。
[0786] 上述结果证明，骆驼凝乳酶中的W下多个替换/突变是优选的（即，与骆驼野生型 凝乳酶相比C作比提高）：
[0787] D117化L280I+G309D;
[0788] L280I+D325M+Y326F；
[0789] D117 化 Q246化 Y326F。
[0790] 实施例7:骆驼和牛凝乳酶变体的评价
[0791] 对于所有的变体，根据实施例4在抑6.5下确定凝固比活（IMCU/mg总蛋白质），而如 实施例5中所述确定总体或非特异性蛋白水解活性。通过将凝固比活(IMCU/mg)除W蛋白水 解活性来确定所有变体在pH 6.5下的C作比。
[0792] 包括骆驼野生型基因作为参照。
[0793] 为了更好地比较，在不具有活性N-糖基化位点的背景下制备所有的变体，所谓的 化ly变体。运些变体通过将两个潜在N-糖基化位点中的N改变成Q来制备。
[0794] 对于进一步的结果，参见图3。
[0巧引变体说明
[0796] 在变体J2中，牛非糖基化凝乳酶中的K279被V替代。
[0797] 在变体J32中，来自牛非糖基化凝乳酶的flap区被来自胃蛋白酶的flap区替代。
[0798] 在变体J72中，使用来自牛凝乳酶的负补下(negative patch)来替代骆驼凝乳酶 中的对应区域。在变体J44中，骆驼凝乳酶中的R300被牛凝乳酶中的对应氨基酸残基Q替代。 该突变还见于变体J72中。
[0799]
[0800] 结论;
[0801] 牛凝乳酶第279位的赖氨酸的突变产生与牛凝乳酶相比显示出相当蛋白水解活性 和增加的凝固比活的变体(变体J2)。因此，可推断出第279位的鄉氨酸是优选的氨基酸。
[0802] 骆驼凝乳酶的糖基化对乳酪制备特性的影响是可忽略的。将非糖基化骆驼变体与 野生型骆驼凝乳酶进行比较指示无显著变化。然而，在骆驼凝乳酶中引入来自牛凝乳酶的 负补下因素(变体J72)显示出对凝固比活的正效应，而总蛋白水解活性降低至约1/2,导致 C/P比加倍。引入来自该补下的单一突变R300Q(变体J44)显示出对凝固活性类似的正效应， 如对变体J72所见。推断出，Q是第300位中的优选氨基酸。
[0803] 预期，牛凝乳酶中的负补下区域对将酶定位于正确切割位点之外具有重要作用， 由此提高酶特异性。预期，该作用是电荷最相关的，即为此增加负电荷的任何改变均将产生 增加的特异性。
[0804] 下文示出了牛和骆驼凝乳酶的带负电区域的比对。仅标示出带电残基。
[0805] RxxxxxxNxGxxRxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxK 骆驼
[0806] QxxxxxxDxDxxSxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxQ牛
[0807] 关于位置编号并且使用骆驼作为参照，编号从右开始：
[080引 R300
[0809] N307
[0810] G309
[0811] R312
[0812] K336
[081引实施例8:骆驼变体的评价
[0814]对多种不同的变体进行分析，每种变体与野生型骆驼凝乳酶相比均具有多个替 换。
[081引对于所有的变体，根据实施例4在抑6.5下确定凝固比活（IMCU/mg总蛋白质），而如 实施例5中所述通过测量每lOOIMCU的蛋白水解活性来确定非特异性蛋白水解活性。
[0816] 包括骆驼野生型基因作为参照。
[0817] 变体分析
[0818] 除对每种变体提及的变化之外，表格中所示的变体均具有与骆驼凝乳酶基因（由 骆驼wt表示)相同的氨基酸序列。
[0819]凝固活性从這〇]/111肖总蛋白质提及。提高的凝固活性用一个或更多个V'符号来表 示。蛋白水解活性W每100IMCU的人造单位来表示。经改进的变体（即，蛋白水解活性降低的 变体)用一个或更多个V'符号来表示。V'符号越多表示改进越强。在"总体"列中，V'符号 表示具有总体上得W改善的特性（即，低蛋白水解活性，高凝固活性)的变体。表1:骆驼凝乳 酶变体的分析
[0820]
[0821] 高凝固比活性对优良的凝乳酶而言必不可少。鉴定到总共21种相对于骆驼凝乳酶 而言凝固比活提高的变体，并且包括在下表2中。
[0822] 表2:凝固活性增加的骆驼凝乳酶变体
[0823]
[0824] 降低的蛋白水解活性对优良的凝乳酶而言是一种额外益处。鉴定到总共10种相对 于骆驼凝乳酶而言蛋白水解活性降低的变体(参见下表3)。
[0825] 表3:蛋白水解活性降低的骆驼凝乳酶变体
[08261
[0827] 基于总体分析，鉴定到5种在凝乳和蛋白水解活性两方面的特性均得W改善的变 体。运5种变体示于下表4中。
[0828] 表4:凝固活性增加且蛋白水解活性降低的骆驼凝乳酶变体
[0829]
[0830] 单独突变的效应的统计学分析
[0831] 使用基于PCA的统计学分析来鉴定对蛋白水解活性、凝乳活性或二者具有正效应 的单一突变。在下表中，总结了导致凝固活性增加、蛋白水解活性降低或者同时导致凝固活 性降低和蛋白水解活性降低的突变。PCA图示于图4中。
[0832] 表5:对凝固活性、蛋白水解活性或二者具有正效应的单一突变
[0833]
[0834] 位置效应
[0835] 预期，对凝固活性或总蛋白水解活性（即，特异性)具有作用的大多数突变位于催 化裂隙中或接近催化裂隙。底物进入催化裂隙，并且在此还发生切割。
[0836] 令人吃惊的是，仅少数显示对凝固活性和/特异性具有正效应的替换位于该区域 中（例如L280I、L70M和巧5Y)。具有正效应的很多突变见于该分子的其他部分上。
[0837] 导致凝固活性提高的替换
[0838] 导致凝固活性提高的大部分突变位于酶本体中并且可能已引起该分子中发生构 象变化。F75Y替换位于裂隙的进口处并且相当细微，导致极性增加。
[0839] 表6:提供提高的凝固的替换
[0840]
[084。导致蛋白水解活性降低的替换
[0842]大部分突变位于分子的本体中。产生的构象变化可能导致对底物的可及性增加。 两个突变见于标志催化裂隙的进口的叶处。L163E替换增加负电荷。运强化了来自实施例7 的结果，表明电荷在运些位置中的重要性。
[0843]表6导致蛋白水解活性降低的突变
'[0845] 导致凝固提高且蛋白水解活性降低自哀 '
[0846] 导致凝乳能力总体提高的一些替换导致可能与底物识别相关的电荷变化。运些包 括导致较高正电荷的H134Q，W及导致更负电荷的Q34犯替换。对凝固和特异性二者均具有 正效应的其他替换最可能导致凝乳酶分子发生更具一般性的构象变化。
[0847] 表7提供提高的凝固和降低的蛋白水解活性的突变 [084引 L画」 买砸例9蹤驼雙体的巧价
[0化0] 变体表征
[0851] 再次产生在实施例7中针对其凝乳活性(C)和总蛋白水解活性(P)评价的骆驼凝乳 酶变体并针对其酪蛋白切割特异性C/P进行评价(下表1)dC/P比是促凝剂在乳酪制备中的 效力的量度，即由一定体积的乳获得的乳酪凝乳的产量。凝乳活性和总蛋白水解活性分别 如实施例4和5中所述来确定。然而，在该实施例中，不经针对凝固活性归一化来测量蛋白水 解活性。
[0852] 将骆驼凝乳酶作为参照进行分析。将所有变体的C/P值表示为与野生型骆驼凝乳 酶的相对值。检测酶样品中的总蛋白质浓度对C/P的影响，并相应地根据运一相关性校正c/ P值。
[0853]表1骆驼凝乳酶变体的分析
[0854]
[0化5] 在46种经表征的变体中总共有30种显示出相比较于野生型骆驼凝乳酶而言提高 的C/P(下表2)。对前S名变体33、6和20观察到3倍W上的提高。
[0856] 表2C/P提高的骆驼凝乳酶变体
[0857]
[0咖]对C/P的位置和突变效应的统计学分析
[0859] 使用基于PCA的统计学分析来鉴定对骆驼凝乳酶的凝乳相对于总酪蛋白蛋白水解 (C/P)的特异性具有正效应的单一突变。发现W下突变有益于高C作比：
[0860] H134Q、F281A、I103V、V256I、I154L、S222G、L224V、Q346E、S331Y、K77T、V367I、 G309D、V261A、D325Q、L280I、D117N、L163E、S212A。
[0化1 ] 实施例10:骆驼变体的评价 [0化。变体表征
[0863]基于实施例7中确定的位置和突变效应，产生另一组与野生型骆驼凝乳酶相比具 有多个替换的骆驼凝乳酶变体并如实施例9中所述针对其酪蛋白底物特异性(C/P)进行评 价(下表1)。
[0864]表1骆驼凝乳酶变体的分析
[08 化]
[0866] 在29种变体中总共有26种显示出与野生型骆驼凝乳酶相比提高的C/巧k。对最佳 变体观察到2倍的提高(下表2)。
[0867] 表2C/P提高的骆驼凝乳酶变体
[086引
[0869] 对C/P的位置和突变效应的统计学分析
[0870] 使用基于PCA的统计学分析来鉴定对骆驼凝乳酶的凝乳相对于总酪蛋白蛋白水解 (C/P)的特异性具有正效应的单一突变。发现W下突变有益于高C作比：
[0871] S331Y、Y79S、K77T、D117N、H134Q、N108D、G309W、L224V、D156V、L280I、M223E、 V367I、F114Y。
[087。实施例11:骆驼变体的评价
[0873] 对来自实施例9和10之变体的组合组进行基于PCA的统计学分析，并鉴定对骆驼凝 乳酶的凝乳相对于总酪蛋白蛋白水解(C/P)的特异性具有正效应的单一突变。发现W下突 变有益于高C作比：
[0874] F281A、H134Q、I103V、S331Y、S222G、I154L、L280I、G309D、D117N、L224V、N108D、 L163E、G309W、K77T、Y79S。
[08巧]运些突变与实施例9和10中确定的有益突变充分一致。
[087引对C/P的位置和突变效应的结构分析
[0877]如实施例8中可见，大部分的有益突变仍远离底物结合裂隙。仅L280I和F281A直接 位于裂隙中(Gilliland等1990)。1280指入C端叶的疏水核内。因此，该突变可能导致结合裂 隙发生微细构象改变，并且由此影响底物特异性。第281位是S2结合位点的一部分并且与酪 蛋白底物中的P2位置相互作用。该位置的突变非常可能影响酪蛋白结合，并且由此影响蛋 白水解dG309W和S33^突变位于已描述与K-酷蛋白相互作用^帮助底物结合在催化裂隙中 的区域中的C端叶的表面上(Gilliland等1990)。因此，这些突变可能对底物结合具有积极 影响。115化和0156￥^及1163目表示对N端叶的核的改变，可能导致酶发生微细的结构重排 并影响催化活性dS222G和L224V突变将改变引入可能W其活化形式与蛋白质N端相互作用 的目折叠中（Lan組olm Jensen等）。对酶活化状态的潜在影响可导致转移的酷蛋白底物特异 性。剩余的命中突变K77T、Y79S、I103V、N108D、D117N和H134Q位于N端叶的表面上，并且除 I103V之外均表示极性氨基酸的交换。酶表面上的这些改变最有可能影响与酷蛋白分子的 相互作用，导致有利于K-酷蛋白的特异性提高。
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【主权项】
1. 一种用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其包括以下步骤： (a) :在具有凝乳酶活性的亲本多肽中的一个或更多个位置处产生改变，其中所述改变 包含在至少一个氨基酸位置的替换、缺失或插入，所述至少一个氨基酸位置对应于以下任 意位置：70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223;224;238;246;256 ;261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、 Y、W;G309;R312D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W ;320;324;D325Q;326;331 ;336; 346; 361; 367和379;以及 (b) :生产并分离步骤(a)的经改变多肽，从而获得所述分离的凝乳酶多肽变体，其中所 述变体具有凝乳酶活性； 并且其中： (i) :所述亲本多肽的氨基酸位置是通过所述亲本多肽与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的多 肽的比对来确定的一即SEQ ID NO: 1的多肽被用来确定所述亲本多肽的对应氨基酸序列； 且 (ii) :所述亲本多肽与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽具有至少65%序列同一性， 所述成熟多肽为SEQ ID NO: 1的第59位氨基酸至第381位氨基酸； 并且前提是所述分离的凝乳酶多肽变体不是选自由以下组成的组的特定变体： Q246E+G309D+S329P+D337E； R125Q+G128N+H204R+Q246E+S284T； Y185F+R213Q+Q246E； V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F； G128D+L188I+Y326F； G128N+R312S+S313Y+Y326F； G128N+R312S+S313Y+Y326F； D117N+V261A+R312S； D216S+L224V+V263I+F281V+G309D； Y79S+L224V+L311I;和 R119S+L224V+T297S。2. 如权利要求1所述的用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述分离的凝乳 酶多肽变体具有： -与包含SEQ ID NO: 1的成熟多肽的牛凝乳酶的C/P比相比提供更高C/P比的凝乳酶活 性;和 -与包含SEQ ID NO: 2的成熟多肽的骆驼凝乳酶的C/P比相比提供更高C/P比的凝乳酶 活性。3. 如前述权利要求中任一项所述的用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述 改变包含在至少一个氨基酸位置的替换，并且其中所述替换是L70M;F75Y;K77T;Y79S; V90L；D102N；I103V；K120Q；F124Y；H134Q；I154L；L163E；S212A；M223E；L224V；L238I；Q246E； V256I;V261A;K279V;F281A;R300D、E、S、T、N、Q ;R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V;Y326F; K336D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;S331Y;Q346E;I361L ;V367I;SK379P。4. 如权利要求3所述的用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述替换是 Q246E;K279V;R300Q;R312S;Y326F;K336D、E、S、T、N、QSK336Q。5.如前述权利要求中任一项所述的用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述 改变包含在至少一个氨基酸位置的替换，并且其中所述替换是： H134Q+Q246E+Y326F； D117N+L280I+G309D； H134Q+D156V+G309D； D156V+Q246E+L280I； D117N+H134Q+L280I； D156V+G309D+Y326F； D117N+D156V+D325M； L280I+D325M+Y326F； D117N+Q246E+Y326F； D117N+H134Q+D325M； N310Q+N349Q+K279V； R300Q+N307D； N307D+G309D； N307D+R312S； R300Q+K336Q； N307D+K336Q； G309D+R312S； R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q； N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q； L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q； L280I+G309D+L224V+E320T+T235S； L280I+G309W+K77T+R324I； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L； L280I+G309D+Q220S+L224V+H134Q； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309W+F75Y+Y79S； L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E； L280I+G309D+L224V+I103V+L238I； L280I+G309D+F124Y+Q346E+I154L； L280I+G309D+I154L+V261A+V367I； L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A； L280I+G309D+L70M+T342S； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309D+Y79S+T342S+I154L； L280I+G309D+Y79S+I103V+F281A； L280I+G309D+V256I+V261A+K379P； L280I+G309D+Q346E+K77T+T235S； L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+Y326F+L70M+D325Q； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309W+S212A+V26ΙΑ； L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F； L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N； L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L； L280I+G309D+L70M+T342S； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A； L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L;或 L2801+G309W+S212A+V261Α。6. 如前述权利要求中任一项所述的用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述 亲本多肽与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽具有至少95%序列同一性。7. 如权利要求1至5中任一项所述的用于制备分离的凝乳酶多肽变体的方法，其中所述 亲本多肽与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成熟多肽具有至少95%序列同一性，所述成熟多 肽是SEQ ID NO:2的第59位氨基酸至第381位氨基酸。8. -种分离的凝乳酶多肽变体，其是通过权利要求1至7中任一项所述的方法获得的。9. 一种分离的凝乳酶多肽变体： (a) :其在具有凝乳酶活性的亲本多肽中的一个或多个位置处包含改变，其中所述改变 包含在至少一个氨基酸位置的替换、缺失或插入，所述至少一个氨基酸位置对应于以下任 意位置：70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 223; 224;238;246;256;261 ;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W; G309;R312D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W;320 ;324;D325Q;326;331;336 ;346; 361;367和379;且 (b) :其中所述变体具有凝乳酶活性； 并且其中： (i) :所述亲本多肽的氨基酸位置是通过所述亲本多肽与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的多 肽的比对来确定的一即，SEQ ID NO: 1的多肽被用来确定所述亲本多肽的对应氨基酸序列； 且 (ii) :所述亲本多肽与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽具有至少90%序列同一性， 所述成熟多肽为SEQ ID NO :1的第59位氨基酸至到第381位氨基酸;且 (iii):所述分离的变体多肽与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽具有小于100%序 列同一"性； 并且前提是所述分离的凝乳酶多肽变体不是选自由以下组成的组的特定变体： Q246E+G309D+S329P+D337E； R125Q+G128N+H204R+Q246E+S284T； Y185F+R213Q+Q246E； V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F； G128D+L188I+Y326F； G128N+R312S+S313Y+Y326F； G128N+R312S+S313Y+Y326F;和 D117N+V261A+R312S； D216S+L224V+V263I+F281V+G309D Y79S+L224V+L311I 以及 R119S+L224V+T297S;并且 其中所述分离的变体具有与包含SEQ ID NO: 1的成熟多肽的牛凝乳酶的C/P比相比提 供更高C/P比的凝乳酶活性。10. 如权利要求9所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述亲本多肽与SEQ ID NO: 1(牛 凝乳酶)的成熟多肽具有至少97%序列同一性;并且 其中所述分离的牛凝乳酶变体与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的成熟多肽相比包含少于10 个氨基酸改变(例如替换）。11. 如权利要求9至10中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述改变包含在至 少一个氨基酸位置的替换并且其中所述替换是L70M ;F75Y;K77T;Y79S;V90L;D102N ;I103V; N108D；D117N；F114Y；K120Q；F124Y；H134Q；I154L；D156V；L163E；S212A；S222G；M223E； L224V;D325Q;L238I;Q246E;V256I ;V261A;K279V;L280I;F281A ;R300D、E、S、T、N、Q;G309D、 W;R312D、E、S、T、N、Q;E320T;R324V;Y326F ;K336D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W; S331Y;Q346E;I361L;V367I;或K379P。12. 如权利要求9至10中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述改变包含在至 少一个氨基酸位置的替换并且其中所述替换是 H134Q+Q246E+Y326F； D117N+L280I+G309D； H134Q+D156V+G309D； D156V+Q246E+L280I； D117N+H134Q+L280I； D156V+G309D+Y326F； D117N+D156V+D325M； L280I+D325M+Y326F； D117N+Q246E+Y326F； D117N+H134Q+D325M； N310Q+N349Q+K279V； R300Q+N307D； N307D+G309D； N307D+R312S； R300Q+K336Q； N307D+K336Q； G309D+R312S； R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q； N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q； L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q； L280I+G309D+L224V+E320T+T235S； L280I+G309W+K77T+R324I； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L； L280I+G309D+Q220S+L224V+H134Q； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309W+F75Y+Y79S； L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E； L280I+G309D+L224V+I103V+L238I； L280I+G309D+F124Y+Q346E+I154L； L280I+G309D+I154L+V261A+V367I； L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A； L280I+G309D+L70M+T342S； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309D+Y79S+T342S+I154L； L280I+G309D+Y79S+I103V+F281A； L280I+G309D+V256I+V261A+K379P； L280I+G309D+Q346E+K77T+T235S； L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+Y326F+L70M+D325Q； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309W+S212A+V26ΙΑ； L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F； L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N； L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L； L280I+G309D+L70M+T342S； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A； L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L;或 L2801+G309W+S212A+V261A。13. -种分离的凝乳酶多肽变体： (a) :其在具有凝乳酶活性的亲本多肽中的一个或多个位置处包含改变，其中所述改变 包含在至少一个氨基酸位置的替换、缺失或插入，所述至少一个氨基酸位置对应于以下任 意位置：70; 75; 77; 79; 90; 102; 103; 108; 114; 117; 120; 124; 134; 154; 156; 163; 212; 222; 223;224;238;246;256 ;261;K279V;L280;F281;R300D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、 Y、W;G309;R312D、E、S、T、N、Q、C、U、G、P、A、V、I、L、M、F、Y、W ;320;324;D325Q;326;331 ;336; 346;361;367和379;且 (b) :其中所述变体具有凝乳酶活性； 并且其中： (i) :所述亲本多肽的氨基酸位置是通过所述亲本多肽与SEQ ID NO: 1(牛凝乳酶）的多 肽的比对来确定的一即，SEQ ID NO: 1的多肽被用来确定所述亲本多肽的对应氨基酸序列； 且 (ii) :所述亲本多肽与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的成熟多肽具有至少90%序列同一 性，所述成熟多肽为SEQ ID NO:2的第59位氨基酸至到第381位氨基酸;且 (iii) :所述分离的变体多肽与SEQ ID N0:2(骆驼凝乳酶）的所述成熟多肽具有小于 100 %序列同一性； 并且前提是所述分离的凝乳酶多肽变体不是选自由以下组成的组的特定变体： Q246E+G309D+S329P+D337E； R125Q+G128N+H204R+Q246E+S284T； Y185F+R213Q+Q246E； V261A+V263I+G309W+L311I+Y326F； G128D+L188I+Y326F； G128N+R312S+S313Y+Y326F； G128N+R312S+S313Y+Y326F； D117N+V261A+R312S； D216S+L224V+V263I+F281V+G309D； Y79S+L224V+L311I;和 R119S+L224V+T297S;并且 其中所述分离的变体具有与包含SEQ ID NO: 2的成熟多肽的骆驼凝乳酶的C/P比相比 提供更高C/P比的凝乳酶活性。14. 如权利要求13所述的分离的凝乳酶多肽变体，其中所述改变包含在至少一个氨基 酸位置的替换并且所述替换是： H134Q+Q246E+Y326F； D117N+L280I+G309D； H134Q+D156V+G309D； D156V+Q246E+L280I； D117N+H134Q+L280I； D156V+G309D+Y326F； D117N+D156V+D325M； L280I+D325M+Y326F； D117N+Q246E+Y326F； D117N+H134Q+D325M； N310Q+N349Q+K279V； R300Q+N307D； N307D+G309D； N307D+R312S； R300Q+K336Q； N307D+K336Q； G309D+R312S； R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q;或 N158Q+N349Q+R300Q+N307D+G309D+R312S+K336Q； L280I+G309D+S331Y+T342S+D325Q； L280I+G309D+L224V+E320T+T235S； L280I+G309W+K77T+R324I； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L； L280I+G309D+Q220S+L224V+H134Q； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309W+F75Y+Y79S； L280I+G309D+F75Y+S331Y+Q346E； L280I+G309D+L224V+I103V+L238I； L280I+G309D+F124Y+Q346E+I154L； L280I+G309D+I154L+V261A+V367I； L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A； L280I+G309D+L70M+T342S； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309D+Y79S+T342S+I154L； L280I+G309D+Y79S+I103V+F281A； L280I+G309D+V256I+V261A+K379P； L280I+G309D+Q346E+K77T+T235S； L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+Y326F+L70M+D325Q； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309W+S212A+V26ΙΑ； L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F； L280I+G309D+K120Q+M223E+H239N； L280I+G309D+H239N+R324I+D325Q； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L； L280I+G309D+L70M+T342S； L280I+G309D+H134Q+V213F+F281A； L280I+G309D+Y79S+L224V+S212A； L280I+G309D+S331Y+L224V+Y326F； L280I+G309D+H134Q+M223E+L70M； L280I+G309W+L238I+T342S； L280I+G309D+V213F+E320T+V90L;或 L2801+G309W+S212A+V261Α。15.-种用于制备食品产品或饲料产品的方法，其包括向食品或饲料成分添加有效量 的根据权利要求8至14中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体，以及进行进一步的制备步 骤以获得所述食品产品或饲料产品;并且 其中所述产品是乳基产品，且其中所述方法包括向乳添加有效量的根据权利要求8至 14中任一项所述的分离的凝乳酶多肽变体以及进行进一步的制备步骤以获得所述乳基产 品；并且 其中所述乳是大豆乳、绵羊乳、山羊乳、水牛乳、牦牛乳、美洲驼乳、骆驼乳或牛乳;并且 其中所述乳基产品是发酵乳产品、夸克或乳酪。
【文档编号】A23L29/00GK106062187SQ201580009539
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年2月26日
【发明人】约翰尼斯·马腾·范丹尼布林克, J·L·詹森, J·雅各布森, 马丁·伦德, 伊本·杰普森, C·杰克尔
【申请人】科.汉森有限公司