，其中部分转基因株系受害不明显。
[0036] 拔节期植株耐热性实验：转基因纯合的玉米植株和受体自交系种子播在花盆 中，植株在适宜生长条件下（温度不高于32°C，不低于22°C)长到12-13叶期，然后移入 到36°C (照光）下生长4h，再在40°C下持续热处理5天（照光13h/d，暗llh/d)，移入 32°C (光）/26°C (暗）下恢复生长，照光13h/d，暗llh/d。热处理后，未转基因对照植株叶 片几乎全部受损，下部叶片死亡，雄穗发育不良，无正常花粉，无雌穗发生；转ZmNF-YA3株 系中绝大多数的耐热性显著优于受体自交系的，其中部分株系叶片受害轻，仅下部叶片干 死脱落，但雄穗发育仍受到严重影响，花粉败育率高达60 %，雌穗发育也大幅度推迟，花期 不育，自交结实困难。
[0037] 灌浆期植株耐热性实验：播在花盆中的转基因纯合的玉米植株和受体自交系植株 在适宜生长条件下（温度不高于35°C，不低于22°C)长到授粉后10天，移入36°C (照光）下 生长24h，再在40°C下持续热处理5天（照光13h/d，暗llh/d)，移入32°C (光）/26°C (暗） 下恢复生长，照光13h/d，暗llh/d。热处理后，受体自交系植株部分死亡，存活植株几乎叶 片全部受损，下部叶片死亡，果穗变小，秃顶约占果穗长度的3/4-1/2,籽粒数不到未受胁迫 植株的1/2,百粒重不到未受胁迫植株的3/4,单株产量大幅度下降。转ZmNF-YA3基因株 系中只有少数株系与受体自交系的受害程度相近，绝大多数株系的耐热性优于受体自交系 的，其中部分转基因株系的植株叶片受害轻，只是下部叶片干死，但果穗发育仍受到严重影 响，秃顶约占果穗长度的1/3,籽粒数比未受胁迫植株显著减少，百粒重一般下降30 %，单 株产量虽明显下降，但显著高于经过同样处理的受体自交系植株的。
[0038] 根据不同生长条件下的性状观察和产量比较，选出过表达ZmNF_YA3基因的耐热 玉米育种材料，进而培育出玉米耐热自交系。
[0039] 实施例3 :转玉米ZmNF_YA3基因创造棉花抗逆材料
[0040] 1.棉花遗传转化载体的构建
[0041] 在构建ZmNF-YA3过表达结构时，从玉米cDNA中克隆的ZmNF-YA3序列，以全长形 式插入到植物表达载体pCambial300-Prd29B: :MCS-PCaMV35S: :als中，与Prd29B形成融合 基因，产生质粒pCambial300-Prd29B: :ZmNF-YA3-PCaMV35S: :als。酶切鉴定后，质粒被导入 根瘤农杆菌AGLO或LBA4404中，用于植物遗传转化。
[0042] 2.棉花无菌苗获得
[0043] 取棉花自交系或优良品种的种子，用浓硫酸脱去表面绒毛，用70%乙醇浸泡2分 钟，再用0. 1%氯化汞浸泡10-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子， 以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水（30-40毫 升水/250毫升三角瓶），封口后放在黑暗条件（23-30°C )下1-2天。待种子萌动（露白） 后，将其放在铵盐减半的改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚轴伸长至3-5厘米时， 剥去一片子叶，露出茎端生长锥。
[0044] 2.农杆菌培养及活化
[0045] 将带有双元载体（Mini-Ti质粒带有除草剂草丁膦抗性基因 als)的根瘤农杆菌 (AGLl或LBA4404)在附加抗生素的YEP培养基中28°C下震荡培养，震荡速率为110r/min， 使细菌处于对数生长期。然后3000r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用铵盐减半的 1/2改良MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100mg/l乙酰丁香酮的铵盐减半 的1/2MS液体培养基悬浮，稀释10-25倍用于转化。
[0046] 3.棉花无菌苗转化
[0047] (1)将菌液倒在4. 5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的苗端 浸泡在菌液中4-5分钟。
[0048] (2)浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，把根部插入无生长调节剂的改良MS培养基上 于黑暗中培养2-3天，培养温度为24-26Γ。然后将无菌苗放在散射光下培养2天。
[0049] (3)将照光培养后的无菌苗移栽到上层蛭石下层壤土的花盆中，蛭石覆盖植株顶 部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28°C，夜温18-23°C，隔天浇灌1/2改良MS培 养基无机盐。
[0050] 4.转化植株筛选与定植
[0051] 转化植株长出3片叶后，喷洒I. 5mg/l绿黄隆（沈阳农药厂生产，有效成分25% ) 水溶液，以植株掉液滴为宜。未转化的对照植株在喷洒后3天停止生长，12天左右开始死 亡。转化植株在喷洒后，一些个体变化同对照植株相似，另一些个体有强的抗性，持续生长。 存活植株长到5叶期时，将其定植到田间。
[0052] 5.抗除草剂植株的分子生物学鉴定
[0053] 抗除草剂植株长到7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。PCR阳 性植株进行Southern blotting检测。在获得的186株抗除草剂PCR阳性植株中，约32% 以上（60/186)的植株为转基因个体。
[0054] 6.转基因植株的鉴定和利用
[0055] 转基因植株开花后自交或姊妹交结实。种子播种在大田或温室，在植株4-6叶期 时取叶片提取DNA，采用PCR技术检测子代植株是否带有外源基因，并统计外源基因在子代 分离比例。结果表明，以无菌苗茎尖分生组织为转基因受体组织，能有效获得转基因植株。 并且，在部分转基因株系后代中，外源基因遗传方式符合孟德尔定律，及在传代中稳定。转 基因纯合系经田间性状选择和抗性测定，选出保持受体品种基本特性且耐旱耐热性有明显 提1?的转基因株系，并用于棉花品种改良D
【主权项】
1. 一种玉米核因子基因ZmNF-YA3在改变植物抗逆性中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述玉米核因子基因ZmNF-YA3的cDNA序 列如SEQIDNo. 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示；所述植物是指栽培的草 本作物，或玉米，或棉花；所述改变植物抗逆性是指改变植物的抗旱性和/或耐热性。3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述玉米核因子基因ZmNF-YA3基因有cDNA 形式或该ZmNF-YA3基因以正义形式、反义形式或其RNAi结构形式。4. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述玉米核因子基因ZmNF-YA3在改变植物 抗逆性中的应用方法是：从玉米cDNA或基因组中克隆ZmNF-YA3基因序列，以基因全长形式 或该基因以正义或反义形式、或RNAi结构形式重组到植物表达载体中，形成融合基因，然 后采用转基因技术将融合基因导入植物细胞，获得转基因植株；通过检测转基因表达强度 和对植株进行性状鉴定，从中筛选出生长和抗逆性发生明显改变的转基因植株及其后代， 创造出在植物育种中具有应用价值的植物新种质。5. 如权利要求4所述的应用，其特征是，所述ZmNF-YA3基因以正义形式、反义形式或其 RNAi结构形式与启动子融合，其中所述启动子有胁迫诱导型和/或组成型的。
【专利摘要】本发明公开一种玉米核因子基因ZmNF-YA3在改变植物抗逆性中的应用。是从玉米中克隆出ZmNF-YA3基因，以正义或反义形式或RNAi结构形式将该基因重组到植物表达载体中，形成融合基因；利用转基因技术获得转基因植株；通过检测转基因表达和对植株进行抗逆性测定，从中筛选出抗逆性明显提高的转基因植株及其后代，创造出具有应用价值的植物新种质。其中所述玉米核因子基因ZmNF-YA3的cDNA序列如SEQ？ID？No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ？ID？No.2所示；所述植物是指栽培的草本作物，或玉米，或棉花。本发明的应用对于培育高产抗逆转基因农作物具有重要意义。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/29, C12N15/84
【公开号】CN105400792
【申请号】CN201510980226
【发明人】张举仁, 李朝霞, 王保梅
【申请人】山东大学
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年12月23日