水稻开花调节基因OsWRKY104在调节植物光周期和开花时间中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体地说，设及水稻开花调苄基因0SWRKY104在调节植 物光周期和开花时间中的应用。
【背景技术】
[0002] 植物的开花时间（作物中或被称作抽穗期）是指植物从营养生长到生殖生长的转 变时间，它受到外部环境和内部发育因子的调控，且决定着植物分布及地区适应性。过去的 十几年里，研究人员已在调控植物开花的分子机理方面取得了一定的进展，在模式植物拟 南芥和水稻中，许多调控开花的基因已被鉴定并且其分子机理被详细描述。在拟南芥中，光 敏色素和隐花色素能够感应光信号，并通过生物钟在长日照条件下促进开花。生物钟相关 基因 GI(GIGANTEA)在生物钟和CO(CONSTANS)之间起着关键的连接作用，并能够正向调控C0 基因的表达，GI-C0-FT途径是长日照条件下调控拟南芥开花的核屯、机制。
[0003] 水稻作为短日照模式植物，已有多个调控其开花的网络途径被报道。与拟南芥只 有一个成花素基因 FT(FL0WERING LOCUS T)不同，水稻进化了两个成花素基因，Hd3a 化eading date 3a)及其同源基因 RFTURICE化0WERING LOCUS T)，而在它们的上游，至少 存在lihdUEarly heading date 1)和HdUHeading date 1)两条影响开花的分子途径。Hdl 介导的途径与拟南芥中的CO同源，而化dl是水稻中所特有的。目前，已报道了大量的水稻基 因通过W上两个途径调控水稻开花。最新研究表明，Hd3a与14-3-3蛋白形成复合体后转入 细胞核内，与转录因子FD1结合形成Ξ聚体FAC(flo;rigen activation complex),诱导 0sMADS15的转录，从而导致水稻开花。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供水稻开花调苄基因0sWm(Y104在调节植物光周期和开花时间 中的应用。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明提供的水稻开花调苄基因 OsW服Y104在调节植物光 周期和开花时间中的应用，其中基因0SWRKY104编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.l所示 或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0006] 前述的应用，所述调节植物开花时间具体为推迟植物开花时间。
[0007] 本发明所述植物包括但不限于水稻。
[000引前述的应用，通过在水稻中过表达基因0SWRKY104的CDS序列，从而推迟转基因水 稻的开花时间及生育期。具体方法如下：
[0009] 提取水稻（如野生型日本晴'kitaake'）总RNA，反转录成cDNA，WcDNA为模板进行 PCR扩增获得如SEQ ID齡.2所示的基因03胖服￥104的〔05序列，并将所述〔05序列构建到植 物双元表达载体的化i qu i t in启动子的下游，转化水稻，筛选转基因水稻植株。
[0010] 优选地，所述植物双元表达载体的出发载体为PCAMBIA1390。
[00川 PCR扩增所用引物为：
[0012] 正向引物F 5'-TCTGCACTAGGTACCTGCAGATGAAAATTCTCGAATCTTTTGGTC-3'（沈Q ID No. 4)
[0013] 反向引物R 5'-ATGGATCCGTCGACCTGCAG TCCCCATATGCATATTGGACTG-3'（SEQ ID No. 5)
[0014] 更优选地，本发明构建的表达载体的全序列如SEQ ID No.3所示。
[0015] 携带有目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微 注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York，第411-463页；Geiserson和Corey， 1998,Plant Molecular Biology,2"*^ Edition) 〇
[0016] 本发明中转化水稻的具体方法如下：采用农杆菌介导的方法，将构建的表达载体 转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的材料经过共培 养-脱菌-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。
[0017] 优选地，利用潮霉素筛选转基因水稻植株。
[001引将OsW服Y104基因在水稻野生型中过表达，转化植株在长日照、短日照条件下均晚 花，表明OsWRKYl 04基因对开花的时间起着重要的调节作用。
[0019] 本发明首次利用过表达水稻开花调苄基因 0SWRKY104调节植物光周期和开花时 间。基因 OsW服Y10有着重要的应用价值，过表达0SWRKY104可W明显抑制水稻开花，使开花 时间延迟，生育期延长。可用于解决杂交育种中的花期不遇问题、各种作物、蔬菜、水果、花 弁的生育期控制问题、光周期敏感性问题及引种问题。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明实施例1中表达载体PCAMBIA1390-WRKY104的结构示意图。
[0021] 图2为本发明实施例3中过表达基因 0SWRKY104水稻材料推迟水稻开花的表型(A) 及Western Blot检测转基因阳性水稻株系结果(B)。
[0022 ]图3为本发明实施例4中过表达基因 OsW服Y104水稻材料的的开花时间比较。
[0023] 图巧日图3中，WT为野生型水稻，WRKY104-0X-1和WRKY104-0X-2为转基因株系。
【具体实施方式】
[0024] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratoiy manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0025] 实施例1水稻开花调苄基因 0SWRKY104的克隆及植物表达载体的构建
[0026] 在水稻基因数据库化ttp: //rice .plantbiology .msu. edu/)中找到0sWRKY104基 因，根据其序列设计PCR扩增引物（SEQ ID No. 4和5)，提取野生型日本晴' kitaake '总RNA， 反转录成cDNA，WcDNA为模板进行PCR获得基因 OsW服Y104的CDS序列（SEQ ID No.2)。按照 PrimeSTAR聚合