酶扩增体系和反应程序进行PCR。将PCR产物纯化后克隆到带有化iquitin启 动子的过表达载体PCAMBIA1390上，经测序鉴定得到与目的基因完全相同的序列，获得表达 载体ubi:0sW服Υ104(图l，pCAMBIA1390-W服Y104，SEQ ID No.3)。
[0027]实施例2转基因水稻植株的获得
[00%]取水稻' kitaake '成熟种子，人工或机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子经消毒 之后接种到诱导培养基上进行诱导培养。选择外观良好，生长力好的水稻愈伤组织为受体 材料，采用农杆菌介导法将ubi : 0SWRKY104转入水稻愈伤组织中，用含有lOOiiM的乙酷下香 酬和0D值为0.7的农杆菌的AAM培养液进行转化，转化后的材料经过共培养-脱菌-筛选-分 化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因水稻植株。共获得8个转基因植株。炼苗7d后 转移至大田生长。
[0029] 本实施例中设及的培养基配方如下：
[0030] 其中，诱导培养基配方为:N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钻母液巧.5mg/L 2,4- D+0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酷胺+30g/L薦糖，W水配制，调抑至 5.8~5.9后加入植物凝胶4g/L。
[0031] 共培养基配方为:N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+2.5mg/L2，4-D+0.5g/L谷氨酷胺+ 0.6g/L酸水解酪蛋白+ 10g/L葡萄糖+30g/L薦糖，W水配制，调pH至5.2后加入植物凝胶4g/ L。灭菌后，50°C左右加入AS(乙酷下香酬）100~2(K)yg/mL。
[0032] 筛选培养基配方为：N6大量+B5微量+NB有机+铁盐+铜钻母液+2.5mg/L 2,4-D+ 0.6g/L酸水解酪蛋白+2.878g/L脯氨酸+0.5g/L谷氨酷胺+30g/L薦糖，W水配制，调pH至5.8 ~5.9后加入植物凝胶4肖/1。灭菌后加入35111肖/1潮霉素(购自上海纽津生物技术有限公司）。
[0033] 分化培养基配方为:MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钻母液+0.05mg/L NAA+2. Omg/L Kinetin(激动素)+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L薦糖，W水配制，调 pH至5.8后加入植物凝胶4g/L。
[0034] 生根培养基配方为:MS无机+MS-B5微量+MS有机+铁盐+MS-铜钻母液+MS无机+30g/ L薦糖+lg/L水解酪蛋白+植物凝胶4g/L。
[0035] 实施例3转基因阳性株系的鉴定
[0036] 为检测水稻开花调苄基因 0SWRKY104的CDS序列已在水稻中过表达，利用Flag抗体 (购自Abmad公司，M2000化)对其在蛋白质水平上进行鉴定。
[0037] 提取转基因水稻植株WRKY104-0X-1和WRKY104-0X-2的总蛋白，经过SDS-PAGE蛋白 电泳后，进行免疫巧光反应，经Western Blot鉴定结果表明转基因植株中存在目的蛋白，而 野生型未杂出条带（图2)。
[0038] 实施例4转基因水稻表型分析
[0039] 与野生型水稻' ki taake '相比，无论在长日照、短日照条件下，转基因株系 WRKY104-0X-1和WRKY104-0X-2的开花时间明显推迟（图3)。
[0040] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 水稻开花调苄基因 OsWRKY 104在调节植物光周期和开花时间中的应用，其中基因 0sWRKY104编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.l所示或该序列经替换、缺失或添加一个或 几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，调节植物开花时间具体为推迟植物开花时 间。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述植物包括水稻。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过在水稻中过表达基因0sWRKY104的CDS 序列，从而推迟转基因水稻的开花时间及生育期。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，提取水稻总RNA，反转录成cDNA，以cDNA为 模板进行PCR扩增获得如SEQ ID如.2所示的基因〇81狀￥104的^5序列，并将所述^5序列 构建到植物双元表达载体的Ubiquitin启动子的下游，转化水稻，筛选转基因水稻植株。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物双元表达载体的出发载体为 pCAMBIA1390〇7. 根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，PCR扩增所用引物为： 正向引物F 5 ' -TCTGCACTAGGTACCTGCAGATGAAAATTCTCGAATCTTTTGGTC-3 ' 反向引物R 5'-ATGGATCCGTCGACCTGCAG TCCCCATATGCATATTGGACTG-3'。8. 根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述转化水稻具体为:采用农杆 菌介导的方法，将构建的表达载体转入水稻愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的AAM培养液 进行转化，转化后的材料经过共培养-脱菌-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选 转基因水稻植株。9. 根据权利要求5-8任一项所述的应用，其特征在于，构建的表达载体的全序列如SEQ ID No .3所示。10. 根据权利要求5-9任一项所述的应用，其特征在于，利用潮霉素筛选转基因水稻植 株。
【专利摘要】本发明提供水稻开花调节基因OsWRKY104在调节植物光周期和开花时间中的应用，将OsWRKY104基因在野生型水稻中过表达，转化植株在长日照、短日照条件下均晚花，表明OsWRKY104基因对开花的时间起着重要的调节作用。本发明首次利用过表达水稻开花调节基因OsWRKY104调节植物光周期和开花时间。基因OsWRKY10有着重要的应用价值，过表达OsWRKY104可以明显抑制水稻开花，使开花时间延迟，生育期延长。可用于解决杂交育种中的花期不遇问题、各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题、光周期敏感性问题及引种问题。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/29, C12N15/84
【公开号】CN105671054
【申请号】CN201610121271
【发明人】李宏宇, 刘斌, 赵涛, 刘军, 林辰涛
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年3月3日