用于转染原生质体的改进技术的制作方法
【专利说明】
[0001] 本发明是申请号为201080057861. 3,申请日为2010年12月20日，发明名称为"用 于转染原生质体的改进技术"的中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及用于向植物细胞原生质体中引入感兴趣的外来分子的方法。发明还涉 及转染的植物细胞原生质体和用于实施所述方法的试剂盒。
【背景技术】
[0003] 遗传改造是刻意创造活细胞遗传物质变化的方法，所述方法目的在于改造那种细 胞或者由细胞构成其一部分的器官或由细胞再生的器官的一种或多种遗传编码的生物学 属性。这些变化可以采取删除部分遗传物质、加入外源性遗传物质或者像遗传物质中现有 核苷酸序列的替换的变化的形式。
[0004] 用于真核生物遗传改造的方法为人们所知已超过20年，并且已发现其广泛应用 于植物和动物细胞和微生物以改善农业、人类健康、食品质量和环境保护领域。
[0005] 遗传改造的常见方法由向细胞基因组中加入外源性DNA片段组成，然后这将赋予 那种细胞或其有机体除了通过已经现有的基因编码的属性以外的新的属性（包括其中现 有基因的表达将因此被抑制的应用）。尽管很多这样的实例可以有效地获得所需的属性，但 是这些方法不是非常准确，因为无法控制外源性DNA片段插入其中的基因组位置（并因此 无法控制最终的表达水平），并且因为所需的效果将其自身体现在由原始的且均衡的基因 组编码的自然属性之上。遇到的一个常见问题是，由于外源性DNA片段在宿主基因组DNA 中的随机整合，必要或有利的基因被失活或修饰，造成宿主所需特征的不必要的损失。
[0006] 相反，将导致预定义的基因组基因座中核苷酸的加入、删除或转化的遗传改造的 方法将允许现有基因的精确改造。
[0007] 随着过去十年里基因组学的出现，现在有可能迅速且成本有效地地破译动物、植 物和细菌的基因组。这已经导致大量的能够与如动物的疾病易感性或植物的产量特征的表 型有关的基因和调节序列。这将允许迅速建立序列的假定功能，但是一个基因对一种观察 到的表型负责的最终证明必须通过创建显示预期的改变的表型的突变系来获得。
[0008] 不同于动物细胞，植物细胞由多糖和蛋白质的混合物组成的厚厚的细胞壁包围， 而动物细胞可以轻易地服从外来分子的引入，植物细胞更加顽固并且需要稍微更加侵略性 的方法。为了向植物细胞中引入外来分子的现有技术程序可以分为2种类别。
[0009] 第一类重组了采用通过刺穿植物细胞壁向植物细胞中机械引入感兴趣的分子的 所有方法。这能够通过生物弹道递送（biolisticsdelivery)来完成，其中将感兴趣的分 子包被在金属珠（金或钨）上，使用气体加压装置将其推进到细胞中。然而，这种方法的效 率相当低并且因为不是所有的细胞都被转化，选择是必须的，其限制了目标的数目。另一种 方法使用了连接到一个微型操纵器上的微-或纳-针将化合物穿过细胞壁直接注射到植物 细胞中。然而，微注射需要特殊设备和大量技巧。该方法同样是单调的和费时的并且相较 于生物弹道递送几乎没有提供优势。但另一种方法使用了碳纳米管，其含有感兴趣的分子 并且其末端包被有细胞壁消化酶。据说，纳米管将局部地降解细胞壁并刺穿质膜允许其内 容物递送进入宿主细胞。虽然与微注射或生物弹道轰击（biolisticsbombardment)相比 侵略性较低，上述限制也适用于此。
[0010] 第二类重组了其中在引入感兴趣的分子之前用酶将整个植物细胞壁移除的所有 方法。细胞壁的完全移除破坏了细胞之间的联系，产生了个体化细胞的均匀混悬物，其允许 更均匀和更大规模的转染实验。这包括，但不仅限于，原生质体融合、电穿孔、脂质体介导的 转染和聚乙二醇介导的转染。因此，原生质体的制备是一种产生数百万细胞的非常可靠和 廉价的方法，并且由于其灵活性、效率和产量，通常比其它方法优选。
[0011] 几乎能够从每一种植物组织中分离原生质体。原生质体的主要来源是叶肉组织， 其每克鲜重产生大量的原生质体。其它组织类型的使用主要取决于现有程序对于所考虑的 系统和实验最终目标的可用性。
[0012] 许多生物学过程，若非全部，是空间上和时间上调节的。一个细胞都有其自己的 生物钟，细胞周期是其最明显的表现。每一个细胞将经历一系列发展阶段如生长（G0、G2)、 DNA复制（S)、分裂（M)和静止（GO)。因此，当设计意图与特异性通路相互作用的实验时，其 与处理所考虑的系统状态有关。感兴趣的分子的引入必须要仔细地定时以便匹配研究的方 法。感兴趣的分子或者必须在很长一段时间里在细胞环境中保持稳定直至它可以执行其活 性或者必须在所研究的方法开始之前不久被递送。例如，在通过向细胞中引入标记的微管 蛋白早前期带（pre-prophaseband)形成期间的微管动力学研究中，必须确定的一点是微 管蛋白在早前期带的形成之前不久被递送，除非标记的微管蛋白足够稳定以抵挡酶降解直 至早前期带形成开始。对于特定的实例，另一个考虑是向结构中而非早前期带中并入荧光 微管蛋白，并因此需要在所需的时间递送探针。
[0013] 不幸的是，除了细胞混悬培养物的极少数情况以外，原生质体能够从中衍生出来 的叶肉细胞处于静止状态（G0)，并且只有当采用一个适当的激素平衡触发原生质体时，它 们将重新进入细胞周期并积极地开始流动。一个静止原生质体经过一轮细胞周期所需的时 间在系统之间有很大不同，并且能够从几个小时到几天。此外，一旦用于生成原生质体的酶 混合物被清洗掉，原生质体就开始再形成其细胞壁，如果不采取预防措施来减缓或阻止细 胞壁再形成，这将降低甚至完全阻止外来分子的引入。因此，当要递送感兴趣的分子时原生 质体不能置之不理直至它们达到适当的阶段，必须积极地预防细胞壁的再形成同时应该保 留原生质体的流动能力。
【发明内容】
[0014] 本发明已经着手克服本领域的这些缺点并且已经发明一种方法，在所述方法中能 够更加有效地并且以更加可控的方式控制和转染原生质体和细胞周期。
[0015] 本发明人目前已经发现，两个转染步骤的组合允许原生质体中几个生物学过程的 详细控制。两个转染步骤的组合可以与细胞壁抑制剂的使用，和/或细胞时相（phase)同 步步骤组合。发明人已经发现，在第一转染步骤中与某些通路相互作用和/或导致双链DNA 断裂并且在第二转染步骤中采用外来分子进行转染的各种组合物的引入允许转染过程改 进的效率和控制。本发明人进一步发现，通过向原生质体中加入一种或多种非酶化学化合 物，所述化学化合物干扰细胞壁的形成如通过抑制纤维素合成酶、纤维素沉积或捕捉新兴 的纤维素微纤丝，通过外来分子的递送在时间上更加接近细胞周期中所需时相的可能性， 外来分子引入的时机和效率能够被增强和优化。本发明人还发现，通过在特定的细胞时相 同步细胞，可以实现增加的转染。
[0016] 从更广泛的方面讲，错配修复系统和/或NHEJ通路和/或DNA双链断裂的引入的 (瞬时）抑制以及（ii)采用感兴趣的外来分子如致突变的寡核苷酸的原生质体的转染，任 选地与原生质体系统中细胞壁再形成的瞬时抑制和/或细胞周期时相的同步结合是非常 有价值的，当细胞系统必须在细胞周期的特殊阶段被转染时，当细胞在特定生物/生化过 程中变得熟练时，所述过程在时间上远离原生质体分离的时间点。此外，原生质体系统中细 胞壁再形成的瞬时抑制允许瞬时表达的质粒的顺序引入，其组合作用导致所需的结果。例 如，如果某时引入ZFN构建体，例如，在引入供体构建体之前的4、6、12、18或24小时，基因 靶向是更有效的。这允许ZFNs被表达并且诱导对于适当的基因靶向事件所必需的DSBs的 发生。
[0017] 发明详述
[0018] 在第一个方面中，本发明涉及用于向植物细胞原生质体中引入一种或多种感兴趣 的分子的方法，所述方法包含下列步骤
[0019] -通过酶降解和/或从植物细胞中移除细胞壁来提供植物细胞原生质体；
[0020] -进行植物细胞原生质体的第一转染，所述转染采用
[0021] i.能够改变选自错配修复系统、非同源性末端连接（non-homologousend joining)的一种或多种通路的调节的第一组合物；和/或
[0022] ii.能够诱导DNA双链断裂的第二组合物
[0023] -采用一种或多种感兴趣的分子进行植物细胞原生质体的第二转染；
[0024]-允许细胞壁形成；
[0025] 其中第二转染在第一转染之后进行。
[0026] 本领域技术人员将会理解的是，术语"和/或"在本发明的范围中意味着可以进行 采用第一组合物的转染、或者采用第二组合物的转染、或者采用二者的转染。所以根据本发 明的第一转染，及其实施方案可以包含第一组合物或第二组合物或二者。
[0027] 在方法的第一步中，从植物细胞中提供原生质体。使用用于产生植物细胞原生 质体的常用程序（例如，使用软化霉素）