专利名称：藓羽藻原生质团聚体作为外源基因的受体表达系统的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因转化方法，具体地说是海洋藓羽藻原生质团聚体作为外源基因的受体表达系统的应用。
背景技术：
植物基因的遗传转化是指将外源DNA通过载体、媒体或其他物理、化学方法导入植物细胞并得到整合和表达的过程。这些外源基因的受体都是细胞，由此需要借助一系列特殊的转化手段来完成外源基因进入细胞。目前已经建立了十余种基因转化方法，这些转化系统所采用的方法都有或多或少的缺点(如表1所示)。
表1几种主要植物基因转化方法特点比较
藓羽藻是一种多核单细胞的海洋绿藻。它的全能性不同于高等植物细胞的全能性，在没有细胞膜和壁的情况下，藓羽藻细胞内的部分原生质体就能团聚，这些团聚体在几小时内就可以形成新的膜和壁，并在数周内发育成成熟的新个体。
发明内容
就是克服上述转化系统和方法的缺点，本发明的目的在于提供海洋藓羽藻原生质团聚体作为外源基因的受体表达系统的应用，使转化系统和转化方法融为一体，过程简单方便，是简单高效的转化方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为藓羽藻原生质团聚体作为外源基因的受体表达系统的应用。
实验前，将藓羽藻洗净，吸净(用吸水纸)藓羽藻表面的水分，分离原生质体，同时，加入外源基因，在缓冲液中使之团聚在一起，形成团聚体；所述外源基因应为携带启动子的外源基因；所述藓羽藻在分离原生质体前培养4天到10天，培养条件为在海水或含0.1M NaNO3和0.1M的NH3H2PO4的富营养海水中，光照∶黑暗＝12～16h∶8～12h，光照强度15～80μmolm-2s-1；团聚体的培养条件一般与野生藓羽藻的培养条件相同即可。
可进行应用的外源基因的种类理论上，只要是自己携带启动子的外源基因都有机会在团聚体内表达。这种转化形式类似于基因枪的转化作用，但它比基因枪更精确，同时要比基因枪便宜地多；所述外源基因可以为phrGFP-1、plRES-hrGFP-1a、phrGFP-C或phrGFP。
缓冲液的种类缓冲液的作用是用来防止原生质体团聚前酶和氧对细胞器和外源DNA的损害作用。团聚时使用的缓冲液并没有固定的类别，但一定要注意两个问题，一是PH值，范围在6-8之间；另一个是注意缓冲液的渗透压要和(藓羽藻生活或培养的)海水的渗透压相一致，避免细胞器膨胀或者物质外渗。下面是我们采用的几种缓冲液1)0.1M的磷酸钾缓冲液(0.1mM EDTA，5mM巯基乙醇，pH6.6-7.1)；2)0.45M山梨糖醇，50mM Tris，5mM EDTA，0.2％BSA，1％聚乙烯吡咯烷酮，0.025％精胺，0.025％亚精胺，and 1mL β-巯基乙醇，pH 7.0；3)400mM蔗糖，50mM Tris，20mM EDTA-Na2，0.2％小牛血清蛋白，0.2％β-巯基乙醇，pH 6.5。
团聚体的培养条件培养器皿和培养液均高压灭菌。原生质体团聚后有一个生成膜和壁的过程，它们的形成时间分别约为6小时和12小时，而且团聚体有贴壁的特点，所以在挪动和换水时不要改变团聚体原来的位置，在换培养液时可以用注射器吸水加水，加水时要注意贴壁缓慢进行。培养液不能添加过多，以4mm高度为宜。团聚体有较强的适应环境的能力，温度在10-30℃均可，15℃-20℃左右最好，但要注意温度保持相对恒定，所以要在恒温无菌的培养箱内进行培养。团聚体培养要注意避免强光，光强在15-80μmolm-2s-1范围都可以，随着团聚体的发育逐渐增加光强增大培养液体积。团聚体延伸后最好转移到蓝光下进行培养，因为蓝光更加接近海水中的光质。
本发明具有如下优点1.转化过程简单。本发明转化系统和转化方法融为一体，过程简单方便，转化效率高，组培条件简单，外源基因接受范围广，并且可以在较短时间内表达外源基因。带有外源基因的原生质体再生植株生命活力强，繁殖能力高。实验结果可以看出，从原生质体到团聚体只需要2分钟时间，从团聚体到具有完整的膜和壁的再生细胞在10小时内就可以完成，从团聚体到具有有性再生能力的植株只需要7周的时间，而且从再生植株产生足够的原生质体起，就可以再利用其原生质体进行扩繁。叶状体的剪段培养更是增殖转基因植株的有效方式。我们的实验结果还表明，叶状体片段平均每天可以生长33毫米，无论是原生质体再生植株还是叶状体片段再生植株，它们的生物量都要比野生植株的大得多，而且它们的繁殖能力更强。
2.本受体系统转化效率高，外源基因产物量大。实验结果证明，在8小时的转化率为15.3％，72后的转化率可增至21％。由于藓羽藻为多核的单细胞藻，同一细胞内的有大量的基因组DNA，DAIPI染色可以看出，一个亚细胞中就有数个核，加之羽藻的增殖速度快，从而产生大量的外源基因产物。
3.成本低。原生质体团聚体受体系统的建立耗费低廉，设备要求低；藓羽藻的原生质体在有限空间和时间内可以产生较大量的外源基因受体，组织培养条件要求低。本发明外源基因表达系统的材料较容易获得。藓羽藻在整个中国的海域都有分布，在我国南方海域可以常年在高低潮之间采到藓羽藻；在北方秋冬季节也可以采到藓羽藻。藓羽藻叶状体可以剪段培养，因此即使从野外采集不到新鲜的材料，也可以通过组培的方法获得一定的生物量。
4.应用效果好。实验证明，在原生质体团聚前加入带有启动子的外源基因，这些外源基因可以能够高效地进入原生质体的团聚体内，并在团聚体内表达；这些带有外源基因的原生质体团聚体在一定条件下能够发育为正常植株。因此，藓羽藻的原生质体团聚体可以成为一个全新的外源基因受体与表达系统。单株藓羽藻的原生质体就能产生上千个团聚体，而且团聚体有较高的存活率。Kim(2001)实验证明团聚体的平均存活率可达40％。在实验中，我们培养原生质体的存活率为15％。
图1为自然界中的藓羽藻图片；(其为栖息在高低潮之间海域的野生藓羽藻配子体；在北方广大海域，7月份后出现羽藻配子体，10月份后其生物量达到最大，12月份后气温降至0℃以后，逐渐死亡消失。但在部分温暖的海域，如一些较大工厂温水的排水口仍然可以发现少量能够越冬的藓羽藻配子体。)图2为藓羽藻原生质体团聚体的发育过程的显微照片；(其为藓羽藻原生质体团聚萌发并发育成成熟的个体，表示原生质体可以团聚并发育成成熟的个体，再生藻株的生物量比野生藻株的要大；挤出的原生质体在培养液中2分钟就可以团聚成球状体，30分钟内形成糖-脂膜，6小时内形成脂质的膜，12小时内形成由木糖和果胶质组成的细胞壁。这些团聚体的成活率为15％左右。3日后，团聚体开始萌发。其中A和B为第一次实验结果，C和D为第二次实验结果。A为72小时时团聚体萌发的情况，A中有一些团聚体仍然没有萌发。萌发后的再生植株生长速度相当快，每天达到33毫米；B为培养原生质体27天时的情况。C为团聚12小时时的情况，有些团聚体已经开始拉长；D为团聚后第10天的生长状况。)图3为藓羽藻叶状体片段的再生图片；(其为藓羽藻叶状体剪段培养的结果；其中A是取出的一根单独的藻丝，有较长的叶状体，也有少量的假根；B是将藻丝按顺序剪成3段；C是剪段培养后第二天的情况，可以看出，每段都有假根长出，而且叶状体的生长量也较大；D是一周后的剪段培养情况，从图可以看出，每一段叶状体都长出大量的假根，新的叶状体因为生长量较大而在培养皿边缘弯曲。)图4为外源基因(phrGFP-1)在藓羽藻原生质体团聚体中的表达的荧光显微照片。(其中A为团聚0.5小时后在荧光显微镜下观察外源基因表达的情况，其中大约有15的团聚体有荧光发出；B为对照，团聚前没有加入外源基因，没有团聚体从团聚体中发出；C和D是团聚初期较早发光的团聚体。)具体实施方式
实施例1操作步骤和过程如下外源基因的表达于海滨的高低潮之间采集藓羽藻※，挑选干净完整的藻株，挑选好的藻株用大量的煮沸过的海水冲洗，尽可能除去表面的杂质、虫子和卵。然后将藓羽藻在培养室内培养一周，培养条件为富营养海水(煮沸的天然海水中加入0.1M NaNO3和0.1M的NH3H2PO4)，光照∶黑暗＝16∶8，光照(～20μmolm-2s-1)由日光灯提供，20℃，每24小时更换一次培养液，更换时注意清洗羽藻和去处破裂的藻株。
挑选完整洁净的藻株，在解剖镜下用去除杂藻和其它杂质，用0.3％的KMnO4消毒5分钟，然后用大量高压灭菌海水冲洗数次。再用大量高压灭菌纯水快速冲洗藓羽藻，去处表面离子，马上用吸水纸吸干表面水分。将藻株剪段后用8层纱布滤出原生质体于1.5ml eppendorf管中(使用器具均高压灭菌)。按15-20ng/ml原生质体的比例加入外源基因-未经RNA酶处理的phrGFP-1(Stratagene)载体DNA，并在0.1M的磷酸钾缓冲液(0.1mMEDTA，5mM巯基乙醇，pH 6.6-7.1)中，25℃下处理20分钟，使之团聚在一起。将管中的缓冲液倒入培养皿(r＝30mm，h＝10mm)中，用注射器吸出缓冲液，加入灭菌的海水，再吸出海水，重复多次，除去缓冲液成分，然后加入灭菌海水培养团聚体。团聚体的培养条件同上述野生藓羽藻的培养条件。万能荧光显微镜紫外光(380nm)观察外源基因表达情况(如图4所示)。
实验结果证明，在8小时的转化率为15.3％，72后的转化率可增至21％。最终发育成熟的个体占团聚体总数的15％，其中1.72％的植株携带外源基因phrGFP-1。
实施例2-4与实施例1不同之处在于，外源基因分别为荧光蛋白报告基因plRES-hrGFP-1a，phrGFP-C和phrGFP，它们在团聚体初期的表达率为0.2％，1.9％和0.07；荧光素酶表达基因pGL2-Promoter和pGL2-Bisc(采用TD20/20荧光发光计检测)，初期表达率为0.06％，0.01％。携带外源基因的藻株正在培养中。
权利要求
1.藓羽藻原生质团聚体作为外源基因的受体表达系统的应用。
2.按照权利要求1所述的藓羽藻原生质团聚体作为外源基因的受体表达系统的应用，其特征在于将藓羽藻洗净，吸净藓羽藻表面的水分，分离原生质体，同时，加入外源基因，在缓冲液中使之团聚在一起，形成团聚体。
3.按照权利要求1所述的藓羽藻原生质团聚体作为外源基因的受体表达系统的应用，其特征在于所述外源基因为携带启动子的外源基因。
4.按照权利要求2所述的藓羽藻原生质团聚体作为外源基因的受体表达系统的应用，其特征在于所述藓羽藻在分离原生质体前培养4-10天，培养条件为含0.1M NaNO3和0.1M的NH3H2PO4的富营养海水中，光照∶黑暗＝12-16h∶8-12h，光照强度10～100μmolm-2s-1。
5.按照权利要求2所述的藓羽藻原生质团聚体作为外源基因的受体表达系统的应用，其特征在于团聚体的培养条件与野生藓羽藻的培养条件相同。
6.按照权利要求2所述的藓羽藻原生质团聚体作为外源基因的受体表达系统的应用，其特征在于所述缓冲液PH值为6-8，渗透压与藓羽藻生活的海水的渗透压相一致。
7.按照权利要求2所述的藓羽藻原生质团聚体作为外源基因的受体表达系统的应用，其特征在于所述缓冲液含0.1mM EDTA、5mM巯基乙醇的0.1M的磷酸钾缓冲液，pH6.6-7.1；0.45M山梨糖醇，50mM Tris，5mMEDTA，0.2％BSA，1％聚乙烯吡咯烷酮，0.025％精胺，0.025％亚精胺，和1mL β-巯基乙醇，pH7.0；或400mM蔗糖，50mM Tris，20mM EDTA-Na2，0.2％小牛血清蛋白，0.2％β-巯基乙醇，pH6.5。
8.按照权利要求2所述的藓羽藻原生质团聚体作为外源基因的受体表达系统的应用，其特征在于所述外源基因为phrGFP-1、plRES-hrGFP-1a、phrGFP-C或phrGFP。
全文摘要
本发明涉及基因转化方法，具体地说是藓羽藻原生质团聚体作为外源基因的受体表达系统的应用。本发明的优点为转化系统和转化方法融为一体，过程简单方便，转化效率高，组培条件简单，外源基因接受范围广、产物量大，并且可以在较短时间内表达外源基因，成本低，应用效果好。
文档编号C12N1/13GK1673345SQ20041002148
公开日2005年9月28日 申请日期2004年3月26日 优先权日2004年3月26日
发明者王广策, 叶乃好, 曾呈奎 申请人:中国科学院海洋研究所