〇l，与空载体组相比；##，P〈〇.〇l，与Ρ311高表达 组相比。
[0022] 图4、外源性TGFM可以恢复Ρ311敲除引起的细胞功能缺陷。免疫印迹检测 α -平滑肌肌动蛋白的蛋白水平。*，Ρ〈0. 05,与Ρ311敲除型空白对照组相比；**，Ρ〈0. 01， 与野生型空白对照组相比；##，Ρ〈0. 01，与敲除型TGFI3 1刺激组相比。
【具体实施方式】
[0023] 为了更好地理解本发明，下面通过实例对本方面进行具体的描述。本申请中未明 确记载的实验步骤和条件，则采用常规的实验步骤和条件。免疫印迹法、荧光素酶活性检 测、免疫荧光染色均参考《分子克隆实验指南（第三版）》（科学出版社）和《组织和细胞培 养技术》（人民卫生出版社）。
[0024] 实施例1 Ρ311对小鼠表皮干细胞中TGFβ 1的调控作用
[0025] 细胞培养和处理方式：Ρ311野生型和敲基因小鼠由Gregory A Taylor教授馈赠 (美国杜克大学医学教研室，敲除序列如SEQ ID No. 2)。利用经典的两步消化法和差速贴 壁法分离并培养1日龄小鼠的表皮干细胞，利用CD71和CD49f流式鉴定表皮干细胞纯度为 95%以上。原代表皮干细胞达到70%汇合时，分别转染已构建好的P311腺病毒表达载体和 Myc空载体（两种载体均购自重庆金麦生物技术有限公司），24h后观察转染比例并换液， 72h后检测各项指标。
[0026] 检测各细胞部位、不同合成阶段的TGF β 1 :转染72h后，常规方法提取细胞内总蛋 白和RNA。免疫印迹检测发现，P311高表达的表皮干细胞TGFβ 1前体和活性TGFβ 1蛋白 的水平分别显著升高到对照组的4. 21和6. 89倍（图1A、B、C)。酶联免疫法检测Ρ311野生 型表皮干细胞的培养上清内总TGF β 1水平较对照组显著升高（图1D)实时定量PCR检测 发现，Ρ311高表达的表皮干细胞TGFI3 I mRNA水平较对照组显著下降（图1Ε)，同时TGF0 I 型受体和II型受体mRNA水平分别升高到对照组的1. 72和2. 22倍（图1F、G)，且均有统 计学意义。。
[0027] 综上，本实施例证实了 P311可以促进表皮干细胞TGF β 1的合成和分泌。
[0028] 实施例2 Ρ311调控TGF β 1的具体机制。
[0029] 细胞培养和处理方式：小鼠原代表皮干细胞的分离培养和鉴定同实施例1，原代 表皮干细胞达到70%汇合时，分别转染已构建好的Ρ311腺病毒表达载体和Myc空载体（两 种载体根据SEQ ID No. 2设计，委托重庆金麦生物技术有限公司构建合成），24h后观察转 染比例并换液，造成人为强制高表达P311。
[0030] 观察P311对TGF β 1启动子活性的影响。P311强制高表达后，加入TGF β 1启动子 质粒，利用双荧光酶报告系统检测荧光信号强度，检测P311对TGFf3 1启动子活性的影响。 结果发现，P311高表达组的启动子活性略微低于空载体组，且具有统计学意义（图2A)。
[0031] 观察P311对TGFf3 I mRNA稳定性的影响。P311强制高表达后，加入放线菌素（其 可结合RNA聚合酶而抑制mRNA合成），0h、3h、6h、12h、24h提取RNA，realtimePCR检测不同 时间点TGFf3 1的水平并计算降解率。结果发现，P311高表达组的降解速率（回归线斜率） 略微高于空载体组（图2B)。
[0032] 观察P311对TGF β 15' /3' -UTR活性的影响。构建TGF β 15' /3' -UTR表达质粒 (三种质粒皆委托重庆金麦生物技术有限公司构建合成），在小鼠原代表皮干细胞中转染 Ρ311腺病毒，成功后加入TGF β 15' /3' -UTR表达质粒，利用双荧光酶报告系统检测荧光信 号强度，检测Ρ311对TGFI3 15' /3' -UTR活性的影响。结果发现，与空载体组相比，Ρ311可 以显著提高3' -UTR和5' /3' -UTR的活性，而对5' -UTR的活性没有显著影响（图2C)。提 示Ρ311主要通过提高TGF β 13' -UTR活性来促进TGF β 1蛋白翻译。
[0033] 综上，本实施例证实了 Ρ311蛋白可能通过提高TGFI3 13' -UTR活性，进而促进 TGF β 1蛋白翻译。
[0034] 实施例3 Ρ311发挥类似TGF β 1的生物学效应
[0035] 细胞培养和处理方式：按前述方法（实施例1)分离培养小鼠表皮干细胞并人 为高表达Ρ311，24小时转染成功后，向培养基中加入5 μΜ LY2109761 (Selleck，S2704)， 继续培养48小时。TGF恢复实验中，向培养基中加入10ng/ml TGF β I (Life invitrogen, PHG9214)，培养 72 小时。
[0036] P311发挥类似TGF β 1的转分化作用并可被TGF β 1抑制剂阻断：上述时间点收集 细胞，相差显微镜检测发现P311高表达的表皮干细胞由立方形变为长梭形，而LY2109761 组则无这种改变（图3A)。免疫荧光染色发现P311高表达后α -平滑肌肌动蛋白阳性细胞 数目增多，而上皮细胞钙粘蛋白阳性细胞数目降低，加入LY2109761后，Ρ311引起的这些改 变均未出现（图3Β)。定量分析发现，Ρ311高表达组中含有约40%的平滑肌肌动蛋白阳性 细胞，远远高于空载体组和P311+LY2109761组（图3C);而Ρ311高表达组中的上皮细胞钙 粘蛋白阳性细胞比例（约10% )远远低于空载体组和P311+LY2109761组（均大于40%， 如图3D)
[0037] 外源性TGF β 1可以恢复Ρ311敲除引起的细胞功能缺陷：免疫印迹检测发现， TGFf3 1刺激后，Ρ311野生型和敲基因型表皮干细胞的α -平滑肌肌动蛋白均有显著升高， 但Ρ311野生型组仍然高于敲基因组。而实际上，无刺激时，Ρ311基因敲除的表皮干细胞内 α -平滑肌肌动蛋白蛋白水平低于Ρ311野生型，而TGFf3 1刺激后的Ρ311敲基因小鼠中的 α -平滑肌肌动蛋白的蛋白水平与无 TGFβ 1刺激的Ρ311野生型小鼠中的α -平滑肌肌动 蛋白的蛋白水平并无显著差异（图4)，即外源性的TGFM恢复了因 Ρ311敲除引起的α-平 滑肌肌动蛋白下降。
[0038] 综上，本实施例验证了 Ρ311蛋白具有与TGFβ 1相类似的生物学效应。
【主权项】
1. 调控蛋白P311在制备调控转化生长因子M表达的药物中的用途。2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的调控蛋白P311具有如SEQIDNo. 1 所示的氨基酸序列。3. 如权利要求1或2所述的用途，其特征在于：编码调控蛋白P311的基因具有如SEQ IDNo. 2所示的核苷酸序列。4. 特异调控转化生长因子M合成的药物，其特征在于：其主要活性成分为P311蛋 白。5. 如权利要求4所述的药物，其特征在于：所述的P311蛋白具有如SEQIDNo. 1所示 的氨基酸序列。6. 如权利要求4或5所述的药物，其特征在于：编码蛋白P311的基因具有如SEQID No. 2所示的核苷酸序列。
【专利摘要】本发明属于生物医学治疗技术领域，具体涉及一种转化生长因子β1(TGFβ1)调控蛋白P311的应用。本发明提供了调控蛋白P311在制备调控转化生长因子β1表达的药物中的用途。本发明还提供了特异调控转化生长因子β1合成的药物，其主要活性成分为P311蛋白。P311蛋白是一种理想的用于调控TGFβ1的小分子药物。本发明发现并证实了P311蛋白可以促进TGFβ1的合成，并发挥与TGFβ1类似的生物学效应。本发明为治疗以TGFβ1为主要发病机制的相关疾病提供一种新选择。
【IPC分类】A61K38/17, C12N15/12, A61P35/00, C07K14/47, A61P43/00
【公开号】CN104892747
【申请号】CN201510364154
【发明人】李海胜, 罗高兴, 吴军, 贺伟峰, 张路, 杨思思, 谭江琳, 周峻峄
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年6月26日