专利名称：自发光材料用于化学发光Western blot的用途及其组合物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及自发光材料用于在化学发光Western blot的 χ-射线胶片上显示蛋白质分子量标准及其组合物和ffesternblot方法。
背景技术：
目前，研究机体组织或细胞中某一蛋白质表达水平是否发生变化，几乎都需要使 用化学发光蛋白质免疫印迹(Western blot)方法来检测。但这种方法检测结果在显影后 的X-胶片上只会显示被检测的条带，不能够同时显示一个精确定量目的蛋白的蛋白质分 子量标准，衡量被检测蛋白的分子量大小。这是因为虽然在SDS-PAGE时电泳泳道中加入了 预染蛋白质分子量标准，其能在电泳时出现强度均勻的条带，方便的了解目的蛋白的位置； 还能够监测后续免疫印迹的转移效率。但是，也是最欠缺的就是不能定量化学发光Western blot X-ray胶片上出现的条带的分子量，尤其被检测蛋白如果发生了糖基化或磷酸化修饰 后分子量发生变化。这一缺点是常规化学发光Western blot方法不能解决的，甚至至今仍 未有科学简便、直观的添加蛋白质分子量标准的方法。因此亟需一种用于化学发光Western blot实验X-ray胶片上添加蛋白质分子量标准的方法。通常^festern blot方法步骤是通过SDS-PAGE分离的蛋白质，转移到NC或PVDF 膜上，然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异性抗体后， 加入辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等标记的、能识别特异性抗体的种属特异性二抗，反应 一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，在显色液和辣根过氧化物酶或碱性磷 酸酶等反应后会发光。此时用X-胶片压在NC或PVDF膜上曝光，冲洗后的胶片上就会留下 目的蛋白的影像。如果目的蛋白量大，其形成的蛋白抗体复合物就大，光线就亮，胶片上的 影像就大和且色深；反之就条带小、色浅。以此可以判断目的蛋白表达是否发生变化。但是 这种传统方法一个缺点就是，做Western blot实验时使用的预染蛋白质分子量标准只能监 测到蛋白转印之前的目的蛋白电泳迁移、转移效率，这是由于预染蛋白质分子量标准不会 在X-胶片上显影，所以不能评价X-胶片显色后其上出现的蛋白条带的分子量大小，而且如 果显色后χ-胶片上不止一条显影带，那就不能精确说明哪条是目的蛋白条带显影，哪是非 特异条带等一系列矛盾，更无法定量目的蛋白发生磷酸化、糖基化后分子量改变和出现多 个条带等实验现象的问题。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的化学发光Western blot技术中 X-射线胶片上不能显示蛋白质分子量标准的不足，提供一种使化学发光蛋白质免疫印迹实 验中的X-射线胶片显示蛋白质分子量标准的方法及其所用的组合物。为解决上述技术问题，本发明提供了自发光材料在化学发光蛋白质免疫印迹实验 中的X-射线胶片显示蛋白质分子量标准中的应用。特别是用于制备显示化学发光蛋白质免疫印迹实验中X-射线胶片上蛋白质分子量标准的试剂。本发明还提供一种用于使化学发光蛋白质免疫印迹实验中的X-射线胶片显示蛋 白质分子量标准的组合物，包括自发光材料，连接剂和填充剂。本发明中，所述的自发光材料包括自发光型发光材料和蓄光型自发光材料。自发 光型发光材料的基本成分为放射性材料，不需要从外部吸收能量，无论黑夜或白天都可持 续发光，又称为第一代自发光材料。蓄光型自发光材料主动吸蓄太阳光、灯光、紫外光、杂散 光等可见光，就可在黑暗中持续发光。主要为传统的硫化物荧光材料和近年来发展较快的 以稀土化合物为基质和以稀土元素为激活剂的发光材料。传统的硫化物荧光材料即第二代 自发光材料，发光亮度低，持续时间短。以稀土化合物为基质和以稀土元素为激活剂的发 光材料是第三代自发光材料。该材料主动吸蓄太阳光、灯光、紫外光、杂散光等可见光5 IOmin后，就可在黑暗中持续发光12h以上，并可根据实际需要，使其发出红、绿、蓝、黄、紫 等多种彩色光。第三代稀土蓄光型自发光材料，化学性质稳定，吸光、蓄光、发光过程可重 复进行，使用寿命可达20年以上，并且无毒害，不含放射性，生产过程也无有害物质产生， 为本发明优选。本发明优选 4SrO. 7AL203:Eu,4Sr0. 7AL203:Dy，4SrO. 7AL203:La, CaAl2O4:Eu, CaAl2O4 = Nb, Sr4Al14O25:Eu, Sr4Al14O25:Dy, SrAl2O4 = Eu, SrAl2O4 = Dy 或它们的混合物。自发光 材料在组合物中的含量较佳的为5% 35%，更佳的是15% 25%，百分比是质量百分比。本发明中，所述的连接剂是重要组成成分，起着分散自发光材料，给予组合物以适 当的粘性、流动性和吸附性能，能在使用后固着于NC膜或PVDF膜的表面。所述的连接剂较 佳的是丙三醇或树脂。所述的树脂包括各种天然树脂和合成树脂。连接剂在组合物中的含 量较佳的为50% 85%，更佳的是65% 70%，百分比是质量百分比。本发明中，所述的填充剂是白色、透明、半透明、不遮盖自发光材料的吸收或释放 光线的物质，主要起充填作用。适当采用填充剂，既可减少自发光材料用量，降低成本，又 可调节组合物的性质，如稀稠、流动性等。本发明中填充剂优选透明漆、丙烯酸透明漆、天 然树脂透明漆或它们的混合物。填充剂在组合物中的含量较佳的为5% 30%，更佳的是 10% 15%，百分比是质量百分比。本发明所述的组合物，较佳的还可以进一步包括辅助成分，如干燥剂、固化剂等。本发明所述的组合物的一较佳实施例为，质量百分含量的组分如下20% 4SrO. 7AL203:Eu，70%丙三醇，2%树脂和8%透明漆。本发明所述的组合物可长期室温干燥保存。本发明中，所述的蛋白质免疫印迹又称Western blot，是本领域常用的方法。本发明所述的用于使化学发光蛋白质免疫印迹实验的X-射线胶片显示蛋白质分 子量标准的组合物的制备方法是如常规的试剂一样将各组分简单混合均勻即可。本发明所述的用于使化学发光蛋白质免疫印迹实验中的X-射线胶片显示蛋白质 分子量标准的组合物在储存、运输及作为商品出售时，可以放置在一个保存管中，该保存管 管体为圆锥形，底部为锥形，管部有盖，管壁上有刻度。所述的盖较佳的是螺旋盖。本发明还提供一种使化学发光蛋白质免疫印迹实验中的X-射线胶片显示蛋白质 分子量标准的方法，包括将从电泳凝胶上转移了包括预染蛋白质分子量标准在内的蛋白质 蛋白的NC膜或PVDF膜在X-射线胶片上进行显像，其特征在于，在所述的NC膜或PVDF膜 上显示预染蛋白质分子量标准的条带位置上涂布如上所述的组合物，然后进行X-射线胶
4片显像。本发明中，所述的NC膜(醋酸纤维素膜)或PVDF膜(硝酸纤维素膜)是蛋白质 免疫印迹常用的蛋白质转移膜。其转移了蛋白质及预染蛋白质分子量标准，进行了化学发 光反应，需要进行下一步的X-射线显像。所述的预染蛋白质分子量标准是各种已知的不同 分子量的蛋白质与染料共价耦联物，在电泳过程中或者转膜时可以直接肉眼观察到。可以通过利用蘸水笔或笔芯状物体蘸取本发明如上所述的组合物，将该组合物涂 在NC膜或PVDF膜上。本发明的组合物可以精确的涂在预染蛋白质分子量标准的各个条带 上，而不会扩散污染到非目标位置。所述的NC膜或PVDF膜在X-射线胶片上进行显像的方法可以按照常规的化学发 光Western blot中的方法进行。由于NC膜或PVDF膜上所涂的组合物具有自然微弱发光 的特性，因此在χ-射线的胶片上曝光时可以显影，从而精确的把预染蛋白质分子量标准标 显示在胶片上，继而可以用于定量X-射线胶片上显像条带的分子量大小。本发明还提供一种改良的化学发光蛋白质免疫印迹的方法，包括将从电泳凝胶上 转移了包括预染蛋白质分子量标准在内的蛋白质蛋白的NC膜或PVDF膜在X-射线胶片上 进行显像，其特征在于，在所述的NC膜或PVDF膜上显示预染蛋白质分子量标准的条带位置 上涂布如上所述的组合物，然后进行X-射线胶片显像。所述的化学发光蛋白质免疫印迹的 其他条件如上所述。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果总述如下本发明通过在常规化学发光 Western blot操作过程中，X_ray光片曝光前用本发明试剂涂抹在预染蛋白质分子量标 准位置，曝光后就能在X-ray光片上得到清晰的蛋白质分子量标准显影带，达到测量目的 蛋白条带的目的，有效的弥补了常规化学发光Western blot的不足，大大改善了 Western blot技术。添加的蛋白质分子量标准条带清晰，符合国际上杂志分子量标注规范，广泛适用 于科研实验。本发明还提供了该方法所使用试剂制备方法，绿色环保、对人体无任何毒害作 用。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1为本发明一优选的用于使化学发光蛋白质免疫印迹实验中的X-射线胶片显 示蛋白质分子量标准的试剂。图2为Wfestern blot中SDS-PAGE电泳后的凝胶图，其中使用的是预染蛋白质分
子量标准。图3为Wfestern blot中SDS-PAGE转膜后承载预染蛋白质分子量标准的NC膜图 片。图4为Western blot中在转印目的蛋白的NC膜上预染蛋白质分子量标准的条带 位置涂抹本发明试剂后图片。图5为Western blot中在NC膜上预染蛋白质分子量标准的条带位置涂抹了本发 明的试剂曝光后χ-射线胶片的图片。其中未使用本发明的试剂为对照例。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明中所述 的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。所述的百分比若无特别说明之处是 指质量百分比。实施例1配方
权利要求
1.自发光材料在化学发光蛋白质免疫印迹实验中的X-射线胶片显示蛋白质分子量标 准中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，自发光材料用于制备显示化学发光蛋白质 免疫印迹实验中χ-射线胶片上蛋白质分子量标准的试剂。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的自发光材料是第三代自发光材料。
4.一种用于使化学发光蛋白质免疫印迹实验中的X-射线胶片显示蛋白质分子量标准 的组合物，其特征在于，包括自发光材料，连接剂和填充剂。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述的自发光材料是第三代自发光材料； 所述的连接剂是丙三醇或树脂；所述的填充剂是透明漆、丙烯酸透明漆、天然树脂透明漆或 它们的混合物。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述的第三代自发光材料是 4SrO. 7AL203:Eu,4Sr0. 7AL203:Dy,4SrO. 7AL203:La, CaAl2O4:Eu, CaAl2O4:Nb, Sr4Al14O25:Eu, Sr4Al14O25:Dy，SrAl2O4:Eu，SrAl2O4 = Dy 或它们的混合物。
7.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述的自发光材料的含量为5% 35%， 所述的连接剂的含量为50% 85%，所述的填充剂的含量为5% 30%，百分比是质量百 分比。
8.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述的组合物的组分如下20% 4SrO. 7AL203:Eu，70%丙三醇，2%树脂和8%透明漆，百分比为质量百分比。
9.一种使化学发光蛋白质免疫印迹实验中的X-射线胶片显示蛋白质分子量标准的方 法，包括将从电泳凝胶上转移了包括预染蛋白质分子量标准在内的蛋白质蛋白的NC膜或 PVDF膜在X-射线胶片上进行显像，其特征在于，在所述的NC膜或PVDF膜上显示预染蛋白 质分子量标准的条带位置上涂布如权利要求4 8任一项所述的组合物，然后进行X-射线 胶片显像。
10.一种化学发光蛋白质免疫印迹的方法，包括将从电泳凝胶上转移了包括预染蛋白 质分子量标准在内的蛋白质蛋白的NC膜或PVDF膜在X-射线胶片上进行显像，其特征在 于，在所述的NC膜或PVDF膜上显示预染蛋白质分子量标准的条带位置上涂布如权利要求 4 8任一项所述的组合物，然后进行X-射线胶片显像。
全文摘要
本发明公开了自发光材料的新应用，用于在化学发光蛋白质免疫印迹实验中的X-射线胶片上显示蛋白质分子量标准。本发明还公开了一种含有自发光材料的组合物，包括自发光材料，连接剂和填充剂。以及一种改良了的可以在X-射线胶片上显示蛋白质分子量标准的化学发光Western blot方法。通过在常规化学发光Western blot操作过程中，X-ray光片曝光前用本发明试剂涂抹在预染蛋白质分子量标准位置，曝光后就能在X-ray光片上得到清晰的蛋白质分子量标准显影带，达到测量目的蛋白条带的目的，有效的弥补了常规化学发光Western blot的不足，大大改善了Western blot技术。广泛适用于科研实验。所使用试剂制备方法，绿色环保、对人体无任何毒害作用。
文档编号C09K11/64GK102095867SQ20091020018
公开日2011年6月15日 申请日期2009年12月9日 优先权日2009年12月9日
发明者史子学, 沈阳, 邱亚峰, 邵东华, 马志永 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所