拟斯卑尔脱山羊草nam-s1基因及其分子标记和应用
【专利摘要】本发明涉及拟斯卑尔脱山羊草NAM?S1基因及其分子标记和应用。本发明提供的来源于拟斯卑尔脱山羊草6号染色体的NAM?S1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。基因NAM?S1在小麦籽粒蛋白质积累方面发挥重要作用。基因NAM?S1与抗白粉病基因Pm12之间的遗传距离为7.3cM，NAM?S1基因在高蛋白质小麦新品种培育中具有潜在的应用价值。另外，本发明还提供用于特异检测NAM?S1基因的分子标记CauNAM?S1及其应用，该标记能够特异检测小麦品种中是否存在NAM?S1基因，还可以检测小麦材料中是否含有抗白粉病基因Pm12，可同时用作小麦高蛋白和抗白粉病筛选的分子标记。
【专利说明】
拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因及其分子标记和应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因及其分子标记和应用。
【背景技术】
[0002] 小麦目前是全球第一大粮食作物，全世界约有35 %~40 %的人口将其作为主要的 食物来源，约占全球卡路里消费总量的20%，全球小麦年产量7亿吨左右，提供约7000万吨 的蛋白质。因此，增加小麦籽粒的蛋白含量不仅能够改良小麦的品质，而且有助于大幅度提 高食用蛋白质的总量。小麦籽粒蛋白含量(grain protein concentration，GPC)及其组成 决定着小麦的加工品质和营养品质。小麦的籽粒蛋白含量是典型的数量性状，而且容易受 到环境条件的影响(Groos et al.，2003)。2006年，1^1^等通过图位克隆获得了控制蛋白含 量的基因NAM-B1，该基因位于小麦6BS染色体上，编码一种NAC转录因子（Uauy et al.， 2006)。拟斯卑尔脱山羊草含有抗病、优质及其他有用的基因，这些优良基因在改良小麦时 容易利用。拟斯卑尔脱山羊草(Aegilops speltoides)的S基因组与普通小麦的B基因组在 进化上具有较近的亲缘关系，故推测在拟斯卑尔脱山羊草的6SS上也应该有一个控制籽粒 尚蛋白含量的基因。
[0003] 白粉病是一种严重影响小麦产量和品质的世界性病害，在各国小麦产区均有发 生。近二十年来，小麦白粉病发生的范围和面积不断扩大，危害程度日益加重，目前，小麦白 粉病已成为影响小麦产量的重要限制因素。小麦白粉病的病原菌为禾本科布氏白粉菌小麦 专化型，属子囊菌亚门真菌，该病菌具有多个生理小种，在不同地理生态环境中与寄主互作 过程中变异速度快，目前一些大面积生产应用的品种已经或正在丧失抗性，因此白粉病害 处于随时大面积流行的严重态势。农药防治对防控白粉病起到了一定的作用，但是会耗费 大量的人力和财力资源，不利用生态环境。利用现代生物技术，不断鉴定和挖掘小麦中的抗 白粉病基因或QTL位点，将抗白粉病基因或QTL位点通过分子基因工程或分子标记辅助选择 培育和推广抗病品种，是防治小麦白粉病最为安全、经济和有效的途径。小麦抗白粉病基因 Pml2也位于小麦-拟斯卑尔脱山羊草易位系6SS ? 6BL的6SS上。目前为止，在现有文献中尚 没有小麦-拟斯卑尔脱山羊草易位系中控制籽粒高蛋白含量的基因报道，也不清楚抗白粉 病基因Pml2与高蛋白含量基因的遗传距离。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因，以及NAM-S1基因在增加小麦 籽粒蛋白质含量中的作用，并且证明在小麦-拟斯卑尔脱山羊草易位系中该基因与抗白粉 病基因Pml2之间的遗传距离。
[0005] 本发明的另一目的是提供拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因分子标记CauNAM-Sl及其 应用，利用该标记特异检测小麦品种中是否存在NAM-S1基因，还用于检测小麦材料中是否 含有抗白粉病基因Pml2,同时用作小麦高蛋白和抗白粉病筛选的分子标记。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明提供的拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因，其为控制小 麦籽粒蛋白质含量的基因，利用该基因可提高小麦籽粒的蛋白含量。
[0007] 拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的核苷酸序列为：
[0008] i)SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；或
[0009] ii)SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且 表达相同功能蛋白质的核昔酸序列;或
[0010] iii)在严格条件下与SEQ ID N0:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸 序列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下杂交，并用该溶液洗膜;或
[0011] iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的 核苷酸序列。
[0012] 本发明还提供由上述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因编码的蛋白，其氨基酸序列如 SEQIDN0:2**。
[0013] 本发明还提供含有所述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的表达盒、重组载体、重组 菌或转基因细胞系。
[0014]本发明还提供所述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因，含有所述NAM-S1基因的表达 盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在提高作物蛋白含量中的应用。
[0015] 本发明中涉及的作物包括但不限于小麦、大麦、黑麦、燕麦、拟斯卑尔脱山羊草。
[0016] 携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转 化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998,Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和 Corey,1998,Plant Molecular Biology,2nd Edition)〇
[0017] 例如，可将含有所述NAM-S1基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系通过 农杆菌介导、花粉管导入或基因枪的方法转入作物中，培育高籽粒蛋白含量的转基因作物。
[0018] 本发明还提供所述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的分子标记CauNAM-Sl，用于特 异性PCR扩增该分子标记的引物为：正向引物F5 ' -ACCGCAGACGATGCCGGCT-3 '和反向引物 R5 '-TCAGGGATTCCAGTTCACG-3 '。
[0019] 本发明还提供所述分子标记CauNAM-Sl在检测作物中NAM-S1基因和/或Pml2基因 中的应用，
[0020] 本发明还提供所述分子标记CauNAM-Sl在小麦高蛋白含量和/或抗白粉病的分子 标记辅助育种中的应用。
[0021] 本发明还提供所述分子标记CauNAM-Sl在筛选和鉴定兼具高蛋白含量和抗白粉病 的小麦新品种中的应用。
[0022]本发明还提供用于检测作物中NAM-S1基因和/或Pml2基因的引物，包括正向引物 F5 ' -ACCGCAGACGATGCCGGCT-3 ' 和反向引物R5 ' -TCAGGGATTCCAGTTCACG-3 '。
[0023]本发明进一步提供含有所述引物F和R的检测试剂盒。
[0024]本发明从拟斯卑尔脱山羊草中克隆得到一个小麦NAM家族基因，命名为NAM-S1， NAM-S1基因全长1547bp，由3个外显子和2个内含子组成，其开放阅读框全长1227bp，编码 408个氨基酸，预测其分子量为43.6kDa，等电点为9.007。
[0025] 在小麦-拟斯卑尔脱山羊草6SS ? 6BL易位系中NAM-S1基因替换NAM-B1后提高了籽 粒蛋白的含量。根据NAM-S1基因序列，开发出特异检测NAM-S1基因的分子标记CauNAM-Sl， 在6SS ? 6BL易位系的分离群体中证明该标记和小麦抗白粉病基因Pml2之间的遗传距离为 7.3cM。因此，利用CauNAM-Sl标记和抗白粉病基因Pml2的分子标记同时进行筛选，能够获得 兼具尚蛋白和抗白粉病的小麦新品种。
[0026]本发明具有以下优点：
[0027]( - )小麦是世界上最重要的粮食作物之一，全球小麦年产量约7亿吨，如果小麦籽 粒蛋白含量增加1 %，相当于全球小麦蛋白含量增加700万吨。与普通小麦6BS染色体的NAM-B1基因相比，本发明的NAM-S1基因大幅度提高了小麦籽粒蛋白质含量，因此，NAM-S1基因对 于增加全球的食用蛋白质供应具有重要意义。
[0028](二）本发明提供了特异检测NAM-S1基因的分子标记CauNAM-Sl标记，该标记是基 于琼脂糖电泳的标记，方法较为简单，可使用新型的核酸染料进行染色，更加安全、实用。对 于充分利用NAM-S1基因，促进小麦分子育种具有重要意义。
[0029](三)本发明提供的CauNAM-Sl标记可同时检测控制小麦籽粒蛋白含量的基因NAM-S1和抗白粉病基因Pml2,即一个标记同时选择两种性状，对于提高小麦分子育种的效率，实 现多性状的聚合育种具有重要的意义。
【附图说明】
[0030]图1为本发明实施例1中对克隆获得的拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的电泳检测 结果以及基因结构分析结果;其中，a:克隆的NAM-S 1基因的电泳检测结果，b: NAM-S 1基因结 构分析；1_4分别为基因组DNA、lkb DNA marker，DL2000DNA marker，cDNA〇 [0031 ]图2为本发明实施例2中构建的拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的系统进化树。
[0032] 图3为本发明实施例3中分子标记CauNAM-Sl在10抗和10感材料中的扩增结果;其 中，S1-S10代表感白粉病小麦材料，R1-R10代表抗白粉病小麦材料。
[0033] 图4为本发明实施例3中NAM-S1基因的分子标记连锁图谱;其中，左侧标注的数值 表示相邻位点之间的遗传距离(单位，cM)。
【具体实施方式】
[0034]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，以下实 施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验 条件;所用原料均为市售商品。
[0035] 实施例1拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的克隆
[0036]根据NCBI上公布的NAM-A1 (DQ869672)、NAM-D1 (DQ869675)、NAM-B1 (DQ869673)、 NAM-B2(DQ869676)、NAM-D2(DQ869677)基因的序列信息，设计扩增NAM-S1基因的引物 NAMS10RF1，用高保真酶PCR扩增后获得NAM-S1基因完整的基因组和cDNA序列。PCR反应体系 为：模板DNA 3ul，正、反向引物各lul，dNTP(10mM)0.4ul，高保真Taq DNA聚合酶（5U/yl) 0.2ul，10 XPCR反应缓冲液2ul，加ddH20补足20ul后混匀。PCR反应条件为：94°C3min; 94°C 30s，58°C30s，72°C2min，共33个循环;72°C7min，16°C结束反应。PCR反应结束后，以1%琼脂 糖电泳检测扩增结果。电泳结果表明，NAM-S1基因组DNA和cDNA的大小分别为1.5kb(图la中 泳道1)和1.2kb (图la中泳道4)左右。
[0037]表1引物序列信息
[0039 ]实施例2拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的遗传进化分析
[0040] 从NCBI GenBank下载其他物种的NAM家族基因，利用MEGA 6.0软件绘制了拟斯卑 尔脱山羊草NAM-S1基因的编码蛋白与其他物种中同源NAM基因的编码蛋白的系统进化树。 结果显示（图2)，不同来源的NAM蛋白分成了4类(Group)。其中NAM-S1属于Group II，此外还 包括了 NAM-B1 (6B染色体）、NAM-B2 (2B染色体)和NAM-A1 (6A染色体）、NAM-D2 (2D染色体)和 AetNAM-Dl(6D染色体），大麦的HvNAM-1和HvNAM-2(H基因组），提莫非维小麦的NAM-G(G基因 组）。进一步可将Group II分为两个亚类，两个亚类分别是来源于小麦第六和第二同源群的 部分NAM蛋白，其中来自第六同源群的HvNAM-1、NAM-B1、NAM-A1、NAM-D1、NAM-V1和NAM-G1位 于第一个亚类(Subgroup I)，来自第二同源群的NAM_B2、NAM_D2和HvNAM-2位于第二个亚类 (Subgroup II)。进化树中NAM-S1蛋白与来源于小麦第六同源群的部分NAM蛋白同被分在第 一个亚类，表明NAM-S1基因来源于拟斯卑尔脱山羊草的6号染色体。
[0041 ]在Group II中，来源于普通六倍体小麦中的NAM-A1、NAM-B1、NAM-B2、NAM-D1、NAM-D2均已经被证明具有加速衰老，提高籽粒中蛋白质、铁、锌的含量的生物学功能。从进化树 来看，来源于拟斯卑尔脱山羊草的NAM-S1基因与已知功能的基因同被分为一个类群（图2)， 可以推测NAM-S1基因可能也具有相关的功能，即加速衰老，提高籽粒中蛋白质、铁、锌的含 量。
[0042] 实施例3拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因分子标记开发
[0043] 根据以上序列比对结果，设计出用于特异检测NAM-S1基因的标记CauNAM-Sl，用于 特异性PCR扩增标记CauNAM-Sl的引物见表1。
[0044]挑选小麦抗白粉病基因Pml2F2分离群体中10个抗病和10个感病后代，进行了NAM-S1基因的分子标记检测。结果如图3所示，该结果表明，NAM-S1基因和Pml2基因遗传距离较 近，在F2分离群体中NAM-S1基因和Pml2基因发生了交换。
[0045] 为了确定NAM-S 1和Pm 12基因的遗传距离，本发明利用CauNAM-S 1在Pml 2的F2 (n = 430)分离群体中进行检测。用Mapmaker EXP 3.0软件计算标记与抗病基因之间的遗传距 离，L0D值为3.0。利用Mapdraw V2.1软件整合了匕&1'(：1169、〇&11127、匕&1'(3198、？11112和碰(3105 分子标记，绘制了 NAM-S1基因的遗传连锁图谱（图4)。结果显示，与NAM-S1基因最近的标记 为wmcl05，其次为Pml2，其中NAM-S1基因与Pml2之间的遗传距离为7.3cM。
[0046] 实施例4利用分子标记CauNAM-Sl检测不同小麦材料中的NAM-S1基因
[0047]对总共6个Pml2的F2:3家系的70单株进行了籽粒蛋白质含量(GPC)的测定和抗白粉 病鉴定，并通过分子标记筛选确定了 Pml2的带型，结果如表2所示，。
[0048] 表2 Pml2分离群体GPC统计
[0052] 对每个F2:3家系材料进行抗病性鉴定后，分别统计抗病、感病和杂合单株的平均蛋 白质含量，统计结果如表3所示，抗病、感病和杂合单株的平均GPC分别是20.54%、17.56% 和19.97 %，统计结果显示，抗病材料的平均GPC含量要高于杂合和感病材料，根据NAM-S1和 Pml2基因的遗传距离，初步推测NAM-S1是有功能的基因。在6SS ? 6BL易位系中，NAM-S1基因 的导入会提高6SS ? 6BL易位系材料的GPC含量。
[0053] 表3 Pml2分离群体GPC统计
[0055]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。 [0056] 参考文献
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【主权项】
1. 拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因，其特征在于，其核苷酸序列为： i) SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；或 ii) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达 相同功能蛋白质的核昔酸序列;或 iii) 在严格条件下与SEQ ID NO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序 列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下 杂交，并用该溶液洗膜;或 iv) 与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷 酸序列。2. 由权利要求1所述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸 序列如SEQ ID NO:2所示。3. 含有权利要求1所述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的表达盒、重组载体或重组菌。4. 权利要求1所述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因，或权利要求2所述表达盒、重组载体 或重组菌在提高作物蛋白含量中的应用，优选所述作物为小麦、大麦、黑麦、燕麦、拟斯卑尔 脱山羊草。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将权利要求3所述的表达盒、重组载体或重 组菌，通过农杆菌介导、花粉管导入或基因枪的方法转入作物中，培育高籽粒蛋白含量的转 基因作物。6. 权利要求1所述拟斯卑尔脱山羊草NAM-S1基因的分子标记CauNAM-Sl，其特征在于， 用于特异性PCR扩增该分子标记的引物为：正向引物F5 ' -ACCGCAGACGATGCCGGCT-3 '和反向 引物R5 ' -TCAGGGATTCCAGTTCACG-3 '。7. 权利要求6所述分子标记在检测作物中NAM-S1基因和/或Pml2基因中的应用，优选所 述作物为小麦、大麦、黑麦、燕麦、拟斯卑尔脱山羊草。8. 权利要求6所述分子标记在小麦高蛋白含量和/或抗白粉病的分子标记辅助育种中 的应用。9. 权利要求6所述分子标记在筛选或鉴定高蛋白含量和/或抗白粉病小麦品种中的应 用。10. 用于检测作物中NAM-S1基因和/或Pml2基因的引物，其特征在于，包括正向引物 F5 ' -ACCGCAGACGATGCCGGCT-3 ' 和反向引物R5 ' -TCAGGGATTCCAGTTCACG-3 '。
【文档编号】C07K14/415GK105821052SQ201610306056
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】解超杰, 孙其信, 倪中福, 赵传志, 耿妙苗, 李映辉, 李峰, 曹廷杰
【申请人】中国农业大学