加快凤阳产气霉生长的方法及所用的预处理后活性炭颗粒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物发酵领域，尤其是提供一种用活性炭吸附加快凤阳产气霉生长 的方法。
【背景技术】
[0002] 产气霉（Muscodor spp.)(现在也称麝香霉）是一类属于炭角菌科的内生真菌， 最早由Worapong等（2001)从肉桂树分离所得，其显著特征是能产生挥发性有机化合物 (volatile organic compounds，简称VOCs)，这些VOCs具有广泛的生物活性，能抑制或杀死 许多病原真菌、病原细菌和一些昆虫。而后，人们利用其特有的形态学、生理学、生物化学方 面的特征及核糖体RNA的序列来寻找和鉴定新的产气霉属内生真菌，越来越多的产气霉种 被发现。由于产气霉能产生有广泛抑菌活性的VOCs，科学家们利用GC-MS等化学分析手段 分离鉴定了产气霉产生的VOCs成分，发现不同菌株产生的VOCs成分不尽相同。尽管VOCs 具有广泛的抑菌活性，而产气霉自身生长速度非常缓慢，在工业发酵上成为难以突破的瓶 颈。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种加快凤阳产气霉生长的方法及所用的预处 理后活性炭颗粒。
[0004] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于加快凤阳产气霉生长的预处理后活 性炭颗粒，其制备方法为依次进行以下步骤：
[0005] 1)、加热洗涤：
[0006] 在活性炭颗粒中加入去离子水后煮沸，弃去废液后，得初次洗涤后活性炭颗粒；
[0007] 2)、超声波清洗：
[0008] 在初次洗涤后活性炭颗粒中加入去离子水进行超声波清洗，弃去废液后，得二次 洗涤后活性炭颗粒；
[0009] 3)、将二次洗涤后活性炭颗粒用去离子水反复清洗，直至洗涤液中无肉眼可见浑 浊；
[0010] 4)、将步骤3)所得的活性炭颗粒沥干水分后于50~70°C (较佳为60°C )烘干至 恒重。
[0011] 作为本发明的用于加快凤阳产气霉生长的预处理后活性炭颗粒的改进：
[0012] 所述步骤1)的加热洗涤重复3~5次后，再进行步骤2)。
[0013] 作为本发明的用于加快凤阳产气霉生长的预处理后活性炭颗粒的进一步改进：
[0014] 所述步骤1)中：活性炭颗粒与去离子水的用量比为Ig :4~6ml，煮沸时间为20~ 40min ；
[0015] 所述步骤2)中：于53KHZ超声波清洗仪进行清洗，清洗时间为20~40min (例如 为30min)。去离子水与步骤1)中的活性炭颗粒的用量比为8~10ml :lg。
[0016] 本发明还同时提供了利用上述预处理后活性炭颗粒进行加快凤阳产气霉生长的 方法，在凤阳产气霉生长环境中配设预处理后活性炭颗粒（目的是为了吸附凤阳产气霉生 长过程中所产生的VOCs)。一般而言，每100g培养基配设20~30g预处理后活性炭颗粒。
[0017] 备注说明：上述预处理后活性炭颗粒实际使用前，需高压（1.05X 105Pa、12rC ) 灭菌锅中灭菌30min，烘干（60°C烘干至恒重）。然后才能放入凤阳产气霉生长环境中。
[0018] 作为本发明的加快凤阳产气霉生长的方法的改进：凤阳产气霉的生长方式为平皿 生长或发酵生长。
[0019] 在本发明中，活性炭颗粒的粒径约为200目。例如可选用沪试牌颗粒活性炭（编 号 7440440)。
[0020] 本发明所述的凤阳产气霉为Muscodor sp. ZJLQ024 (亦名：Muscodor. fengyangensis ZJLQ024)，在专利号为 200910153512. 0 的发明《Muscodorsp.属植物内生 真菌ZJLQ024及其用途和杀菌剂》中有明确告知，保藏号为CGMCC No. 2863。
[0021] 产气霉因其产生的VOCs对多数细菌、真菌及昆虫具有抑制甚至杀死作用，其作为 生物防治制剂具有很大的应用潜力，目前在农业、医药及工业应用上受到越来越多科技工 作者的重视。凤阳产气霉Muscodor. fengyangensis ZJLQ024在培养的过程中生长十分慢， 是由于产生的VOCs成分抑制了自身的生长。本发明采用预处理后活性炭吸附的方法，证明 活性炭吸附对凤阳产气霉为Muscodor sp. ZJLQ024生长有促进作用，为凤阳产气霉快速发 酵提供指导意义。
[0022] 本发明的优点是：在凤阳产气霉生长过程中，提供活性炭吸附VOCs的方法，使有 抑菌活性的VOCs部分被活性炭吸附，从而减缓VOCs对凤阳产气霉生长的影响而加快凤阳 产气霉的生长。
【附图说明】
[0023] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0024] 图1为不同条件下生长的凤阳产气霉ZJLQ024(培养8天）；
[0025] 图2为凤阳产气霉ZJLQ024生长曲线；
[0026] 图3为有无活性炭的凤阳产气霉ZJLQ024对峙病原指示菌效果对比；
[0027] 对峙病原指示菌从上至下依次为青霉菌（KH8)、灰霉（ZAU10)、立枯丝核菌 (ZAU05)、桃子褐腐菌（TZ01);
[0028] 图4为固相微萃取-气质联用测定的凤阳产气霉ZJLQ024挥发性有机化合物的总 离子流图；
[0029] 图5为固相微萃取-气质联用测定的加活性炭的处理组产气霉Z几 Q024挥发性有 机化合物的GC-MS总离子流图；
[0030] 图6为加入活性炭（左图）和不加活性炭（CK，右图）的固体发酵产物的生长对 比。
【具体实施方式】
[0031] 材料：供试菌株为凤阳产气霉Muscodor fengyangensis ZJLQ024。
[0032] 病原指不菌包括：KH8 青霉菌 Penicillium expansum ;ZAU10 灰霉菌 Botrytis cinerea;ZAU05立枯丝核菌Rhizoctonia solani ;TZ01 桃子褐腐菌Monilinia fructicola 等；
[0033] 活性炭来源为沪试牌颗粒活性炭（编号7440440)，该试剂大小约为200目，黑色无 定形粒状物或细微粉末。无臭。无味。无砂性。不溶于任何溶剂。对各种气体有选择性的 吸附能力，对有机色素和含氮碱有高容量吸附能力，每g总表面积可达500~1000m2,相对 密度约1. 9~2. 1，表观相对密度约0. 08~0. 45。
[0034] 本发明所涉及的仪器包括超净工作台、恒温培养箱、电子天平、pH计、烘箱、 电磁炉、微波炉、冰箱、真空干燥箱、GRT-20D型50L固体发酵罐、超声波仪、Agi I ent 6890N-5975B型GC-MS仪、MLS3750型高压灭菌锅、BS233S型分析天平、顶空固相微萃取装 置等。
[0035] 本发明涉及五种培养基，分别为PDA培养基、PDB培养基、察氏培养基、冷冻保存培 养基和麦粒固体发酵培养基，其配制方法分别如下：
[0036] PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂L 5% (即， 15g琼脂），自来水1000mL。取定量土豆切成均匀小块，加水煮沸至土豆用玻璃棒一戳击破， 8层纱布过滤，加入20g葡萄糖，冷却，加自来水定容至lOOOmL，三角瓶装1. 5%的琼脂，加入 液体，封装，121°C、15min高压灭菌。
[0037] PDB培养基（马铃薯葡萄糖培养基）：土豆200g，葡萄糖20g，自来水1000mL。取定 量土豆切成均匀小块，加水煮沸至土豆用玻璃棒一戳击破，8层纱布过滤，加入20g葡萄糖， 冷却，加自来水定容至lOOOmL，封装，121°C、15min高压灭菌。
[0038] 察氏培养基：硝酸钠 3g，磷酸氢二钾lg，硫酸镁（MgS04. 7H20)0. 5g，氯化钾0. 5g， 硫酸亚铁0. 〇lg，蔗糖30g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。将离子化合物硝酸钠、磷酸氢二钾、硫 酸镁、氯化钾及硫酸亚铁加离子水配成母液，用无菌过滤器过滤液体。其余如蔗糖，琼脂，蒸 馏水按比例装瓶，121°C、15min高压灭菌。将其溶解后倒在培养皿前，将无机离子化合物混 合液按比例与培养基混合。
[0039] 冷冻保存培养基（液体）：葡萄糖10g，酵母提取物lg，酸水解酪蛋白0. 5g，丙三醇 (甘油）180mL。用蒸馏水将葡萄糖、酵母提取物、酸水解酪蛋白溶解后，再加入甘油、最后用 蒸馏水定容至lOOOmL，121°C、灭菌20min。
[0040] 麦粒固体发酵培养基：取一定量麦粒加自来水浸泡过夜，浸泡时间7-9h左右。倒 掉麦粒多余的水分，l〇〇g麦粒装至IL的三角瓶，121 °C、40min连续高压灭菌两次。
[0041] 实施例1、菌株的保存和活化培养（属于常规技术）
[0042] 1、菌株的常温或低温保存
[0043] 在超净工作台，于2ml无菌冷冻保存管加入不超过I. 5ml融化的PDA培养基，盖 盖，倾斜放置。待凝固后，将保存的菌株接种到斜面培养基，数天后，菌丝成功定殖于斜面， 可见新鲜的菌丝长出，加入经3次高压灭菌的石蜡将菌丝淹没，盖盖，于常温下或KTC冰箱 保存。使用时，用无菌牙签挑取菌组织，接种于平板PDA培养基上进行活化。
[0044] 2、菌株的冷冻保存
[0045] 于超净工作台，在PDA上的菌落挖取4-5块菌块，置于2ml无菌冷冻保存管，加入 高压灭菌的冷冻保存液，将菌块淹没。盖盖，将冷冻保存管依次于4°C和-20 °C下放置Ih后， 转移至-80°C超低温冰箱中进行长期保存。使用时，于室温中自然解冻，挑取其中的菌块接 种于平板PDA培养基上进行活化。
[0046] 3、菌株的活化
[0047] 用牙签从保存菌株的冷冻保存管中取得菌块，将其接种到PDA培养基，封口膜封 口于25 °C，黑暗培养箱培养。
[0048] 实施例2、活性炭的预处理
[0049] 为保证活性炭的高吸附活性，活性炭进行如下预处理，依次进行以下步骤：
[0050] 1)、加热洗涤：
[0051] 称取100g刚开封的