专利名称：特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种可以可在哺乳动物细胞内稳定表 达的，能特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体及其该载体的表达方法。
背景技术：
癌蛋白SET又称I2PP2A、TAF_Ii3，在细胞中广泛存在，是体内主要的丝-苏氨酸蛋 白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的胞内抑制蛋白，具有特异性、非竞争性和热 稳定性，同时SET也是组蛋白分子伴侣。其在急性未分化型白血病中首次被鉴定，近年来的 研究表明，SET是一个多功能蛋白，涉及细胞凋亡、肿瘤发生、转录调节、核小体装配、组蛋白 结合等方面。Madeira A等报道在Alzheimer，s疾病中SET蛋白参与了神经元凋亡过程，为 此疾病机理提供了新的线索；PP2A活性的缺失或改变与肿瘤发生有一定联系，许多细胞毒 素的促肿瘤作用与抑制PP2A的活性有关，PP2A被认为可能是一个潜在的肿瘤抑制因子。而 SET蛋白作为PP2A的胞内抑制蛋白，其与肿瘤发生也密切相关，如Wilm’ s肿瘤中SET mRNA 和蛋白表达都显著上升，通过癌蛋白SET的磷酸化可促进前列腺癌细胞生长，肝细胞癌变 中观察到I2PP2A/SET基因表达上调，PP2A活性受抑制；SET蛋白能诱导原癌基因C-Jun的 表达和影响转录因子AP-I的活性，同时也能增强激活蛋白-Kactivator protein-Ι)的转 录活性；SET作为组蛋白分子伴侣，能抑制组蛋白和核小体的乙酰化，从而导致组蛋白依赖 性转录的沉默和DNA去甲基化激活受阻。三氯乙烯(Trichloroethylene，TCE)为不饱和卤代脂肪羟类化学物，是电子、制 革和五金行业常用的有机清洗溶剂，经吸入和皮肤接触后可引起肝脏、肾脏、心脏及皮肤的 损害。近年来，三氯乙烯中毒事件呈上升趋势，死亡事件也时有报道。三氯乙烯中毒主要表 现为药疹样皮炎，但肝脏功能损害情况亦相当严重。刘建军等利用蛋白质组学技术研究三 氯乙烯刺激肝细胞后蛋白质差异表达，结果发现其中的SET差异蛋白在TCE低剂量时表达 上调，并且随着TCE剂量的增加，其表达继续上升。自 1998 年 Fire 等人发现 RNA 干扰(RNA interference, RNAi)现象以来，RNAi 技 术已被证实是一种特异、高效、经济的抑制基因表达的手段而受到极大的重视和欢迎。2001 年，RNAi技术被成功应用于哺乳动物细胞，其应用前景更加诱人，已经成为疾病研究和治疗 的热点。研究者们可以利用这项技术对目标基因或蛋白质进行特异性表达沉默，通过观察 其表达被抑制的细胞或者生物体的从形态到各项生理生化指标的变化，对该基因或蛋白质 的功能及参与的信号网络进行研究。这比传统的基因敲除方法要简单而且方便得多，因此 短短几年，就有了很多突破性的成果，其中研究得最多的是与疾病相关的一些基因和蛋白。RNA干扰是与靶基因序列同源的双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)所诱导 的一种特异性的转录后基因沉默现象(post-transcriptional gene silencing，PTGS)。 外源性或内源性的双链RNA进入细胞后，在三磷酸腺苷(ATP)依赖性RNA酶III (Dicer， DCR)的作用下被切割成3’端有2个突出碱基的21-23nt长度的小分子干扰RNA(small
4interference RNA, siRNA)；这些siRNA与RNAi特异性酶结合，形成RNA诱导沉默复合体 (RNA-induced silencing complex, RISC)；而后 RISC 在 siRNA 反义链的指导下与 siRNA 同源靶mRNA相结合，RISC中的重要组成成分Ago-2蛋白在近中点位置将其切割A，随后靶 mRNA被细胞内RNA酶降解，转录后的mRNA就不能翻译出相对应的蛋白，而RISC游离出来， 寻找新的目标分子，从而达到抑制靶基因表达的作用。现有技术中，没有发现存在可长效稳定表达，特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表 达载体，而且现有的其它shRNA表达载体往往存在转染效率低，干扰效果不稳定，载体用量 大，而且通常都需要多次瞬时转染等缺陷。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种可以长效稳定表达，且能特异性抑制SET蛋白表 达的shRNA表达载体，避免多次瞬时转染造成繁琐流程，能有效地抑制SET蛋白表达，可以 用于制备治疗SET蛋白表达异常相关疾病的药物中，解决现有技术存在的缺陷。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体，包括表达载体的基本序列、抗性 基因序列、多克隆位点、启动子序列、可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列，所述的可 表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列正向插入表达载体的多克隆位点序列内；所述可 表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列依据SET mRNA靶序列设计。优选的是所述表达载体为慢病毒表达载体PLVX-ShRNAl系列，优选为 pLVX-shRNAl，所述的多克隆位点包BamH I和EcoR I限制性酶切位点，所述寡核苷酸链包 括Sense+Loop+Antisense+终止序列，并在两端加上BamH I和EcoR I酶切位点；所述的 Loop为TTCAAGAGA，所述的终止序列为TTTTTT。更优的是所述的SET mRNA靶序列为 5' -GGATGAAGGTGAAGAAGAT-3 ‘ (SQE ID No
1)；所述的寡核苷酸链模板序列包括寡核苷酸正义链序列和寡核苷酸反义链序列，所述正 义链序列为5' -GATCCGGATGAAGGTGAAGAAGATTTCAAGAGAATCTTCTTCACCTTCATCCTTTTTTG-3' (S QE ID No6)；所述反义链序列为5' -AATTCAAAAAAGGATGAAGGTGAAGAAGATTCTCTTGAAATCTTCTTCACCTTCATCCG-3' (S QE ID No7)。更优的是所述的SET mRNA靶序列为 5' -GTGAAATAGACAGACTTAAT-3 ‘ (SQE IDNo
2)；所述的寡核苷酸链模板序列包括寡核苷酸正义链序列和寡核苷酸反义链序列，所述正 义链序列为5' -GATCCGTGAAATAGACAGACTTAATTTCAAGAGATTAAGTCTGTCTATTTCATTTTTTG-3' (S QE ID No 8)；所述反义链序列为5' -AATTCAAAAAATGAAATAGACAGACTTAATTCTCTTGAAATTAAGTCTGTCTATTTCACG-3'( SQE ID No 9)。更优的是所述的SET mRNA靶序列为
5
5' -GCAGCAAGAAGCGATTGAAC-3‘ (SQE ID No 3)；所述的寡核苷酸链模板序列包 括寡核苷酸正义链序列和寡核苷酸反义链序列，所述正义链序列为5' -GATCCGCAGCAAGAAGCGATTGAACTTCAAGAGAGTTCAATCGCTTCTTGCTGTTTTTTG-3'( SQE ID No 10)；所述反义链序列为5 ‘ -AATTCAAAAAACAGCAAGAAGCGATTGAACTCTCTTGAAGTTCAATCGCTTCTTGCTGCG-3‘( SQE IDNo 11)。更优的是所述的SET mRNA靶序列为 5' -GATGAAGAGGCACTGCATT-3 ‘ (SQE ID No
4)；所述的寡核苷酸链模板序列包括寡核苷酸正义链序列和寡核苷酸反义链序列，所述正 义链序列为5 ‘ -GATCCGATGAAGAGGCACTGCATTTTCAAGAGAAATGCAGTGCCTCTTCATCTTTTTTG-3‘ (S QE ID No 12)；所述反义链序列为5 ‘ -AATTCAAAAAAGATGAAGAGGCACTGCATTTCTCTTGAAAATGCAGTGCCTCTTCATCG-3‘ (S QE ID No 13)。更优的是所述的SET mRNA靶序列为 5' -GCCAAACCCATTACAGTAC-3 ‘ (SQE ID No
5)；所述的寡核苷酸链模板序列包括寡核苷酸正义链序列和寡核苷酸反义链序列，所述正 义链序列为5 ‘ -GATCCGCCAAACCCATTACAGTACTTCAAGAGAGTACTGTAATGGGTTTGGCTTTTTTG-3‘ (S QE ID No 14)；所述反义链序列为5' -AATTCAAAAAAGCCAAACCCATTACAGTACTCTCTTGAAGTACTGTAATGGGTTTGGCG-3' (S QE ID No 15)。本发明的目的之二在于提供一种特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体的构 建方法，包括步骤(A)依据Genbank的SET基因序列，根据shRNA设计原则选取SET mRNA靶序列，并 设计合成可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列；(B)将设计合成的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列正向插入表达载体的多克隆 位点序列内，构建特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体。本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果本发明利用慢病毒载体为介导构建靶向人SET基因干扰载体，具有转染效率高、 干扰效果稳定的特点，克服了质粒或逆转录病毒转染效率低、干扰效果不稳定的缺点，为 SET蛋白功能科研领域以及SET蛋白表达异常相关疾病的治疗提供了有力工具。
图1为本发明所述的慢病毒表达载体pLVX-shRNAl质粒图谱；图2为本发明实施例shRNA重组质粒测序结果示意图；图3-1为实施例嘌呤霉素筛选完后的Western blotting检测结果示意图；图3-2为实施例筛选细胞培养15d后的Western blotting检测结果示意6
图3-3为实施例筛选细胞培养2个月后的Western blotting检测结果示意图；图4-1本发明实施例嘌呤霉素筛选后SET的RT-PCR结果示意图；图4-2本发明实施例筛选细胞培养15d后SET的RT-PCR结果示意图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。实施例1靶向人SET的短发夹环RNA(shRNA)寡核苷酸链的设计与合成本实施例利用慢病毒介导的RNA干扰技术构建了靶向人SET基因的慢病毒干扰重 组载体，并包装出病毒转导入L-02肝细胞中，通过Western Blot和实时荧光定量PCR技术 分别从SET蛋白和mRNA水平来验证SET的表达，筛选出了高效抑制SET表达的最佳干扰片 段，构建了高效抑制SET表达的shRNA慢病毒表达载体，具体方法和步骤如下材料慢病毒表达载体pLVX-shRNAl vector和慢病毒转染包装试剂盒(Lenti-X Packaging system)购自Clontech公司，其带人TO启动子，嘌呤霉素(puromycin)抗性抗 性基因、BamH I和EcoR I酶切位点(见图1)；限制性内切酶BamH I和EcoR I、T4 DNA连 接酶购自New England BioLabs公司；DNA凝胶回收试剂盒购自美国MBI Fermentas公司； 大肠杆菌E. coli DH5 α、购自大连宝生物公司；高纯质粒提取试剂盒为Omega公司产品； IOOObp DNA Marker购自TaKaRa公司；shRNA寡核苷酸链由上海生工公司合成；SET兔抗鼠 一抗购自GloboZymes公司，HRP标记的羊抗鼠二抗购自美国sigma公司，ECL试剂盒为美国 GE公司产品。靶向人SET的短发夹环RNA(shRNA)寡核苷酸链的设计与合成针对人SET mRNA序 列(Genbank Accession NM 001122821)，根据 shRNA 设计原则及 www, clontech. com 上的 在线设计软件选择5条19nt靶序列，经BLAST同源性比对分析，5条靶序列与人类其他基 因编码序列无同源性，分别起始于SET基因第801、159、120、336、677位点。寡核苷酸链由 Sense (下划线部分)+Loop (TTCAAGAGA) +Antisense+终止序列(TTTTTT)组成，并在两端加 上 BamHI 禾Π EcoR I 酶切位点，分别命名为 siRNAl、siRNA2、siRNA3、siRNA4、siRNA5，另外设 计对照序列siRNA c，不针对人任何基因，具体序列如表1。寡核苷酸链由上海生工公司合 成。表1靶向SET基因shRNA寡核苷酸链序列Table 1 the sequences of shRNA oligonucleotides targeting SET gene
权利要求
一种特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体，其特征是包括表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点、启动子序列、可表达的SETshRNA的寡核苷酸链模板序列，所述的可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列正向插入表达载体的多克隆位点序列内；所述可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列依据SET mRNA靶序列设计。
2.如权利要求1所述的特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体，其特征是所述 表达载体为慢病毒表达载体pLVX-shRNAl，所述的多克隆位点包BamH I和EcoR I限制性酶 切位点，所述寡核苷酸链包括Sense+Loop+Anti sense+终止序列，并在两端加上BamH I和 EcoR I酶切位点；所述的Loop为TTCAAGAGA，所述的终止序列为TTITTT。
3.如权利要求2所述的特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体，其特征是所述 的 SET mRNA 靶序列为 5' -GGATGAAGGTGAAGAAGAT-3 ‘ (SQEID No 1)；所述的寡核苷酸链 模板序列包括寡核苷酸正义链序列和寡核苷酸反义链序列，所述正义链序列为5 ‘ -GATCCGGATGAAGGTGAAGAAGATTTCAAGAGAATCTTCTTCACCTTCATCCTTTTTTG-3 ‘ (SQE ID No 6)；所述反义链序列为5 ‘ -AATTCAAAAAAGGATGAAGGTGAAGAAGATTCTCTTGAAATCTTCTTCACCTTCATCCG-3 ‘ (SQE ID No 7)。
4.如权利要求2所述的特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体，其特征是所述 的 SET mRNA 靶序列为 5' -GTGAAATAGACAGACTTAAT-3 ‘ (SQE ID No 2)；所述的寡核苷酸 链模板序列包括寡核苷酸正义链序列和寡核苷酸反义链序列，所述正义链序列为5 ‘ -GATCCGTGAAATAGACAGACTTAATTTCAAGAGATTAAGTCTGTCTATTTCATTTTTTG-3 ‘ (SQE ID No 8)；所述反义链序列为5 ‘ -AATTCAAAAAATGAAATAGACAGACTTAATTCTCTTGAAATTAAGTCTGTCTATTTCACG-3‘ (SQE ID No 9)。
5.如权利要求2所述的特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体，其特征是所述 的 SET mRNA 靶序列为 5' -GCAGCAAGAAGCGATTGAAC-3 ‘ (SQEID No 3)；所述的寡核苷酸链 模板序列包括寡核苷酸正义链序列和寡核苷酸反义链序列，所述正义链序列为5 ‘ -GATCCGCAGCAAGAAGCGATTGAACTTCAAGAGAGTTCAATCGCTTCTTGCTGTTTTTTG-3 ‘ (SQE ID No 10)；所述反义链序列为5 ‘ -AATTCAAAAAACAGCAAGAAGCGATTGAACTCTCTTGAAGTTCAATCGCTTCTTGCTGCG-3‘ (SQE ID No 11)。
6.如权利要求2所述的特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体，其特征是所述 的 SET mRNA 靴序列为 5' -GATGAAGAGGCACTGCATT-3 ‘ (SQE IDNo 4)；所述的寡核苷酸链 模板序列包括寡核苷酸正义链序列和寡核苷酸反义链序列，所述正义链序列为5 ‘ -GATCCGATGAAGAGGCACTGCATTTTCAAGAGAAATGCAGTGCCTCTTCATCTTTTTTG-3 ‘ (SQE ID No 12)；所述反义链序列为5 ‘ -AATTCAAAAAAGATGAAGAGGCACTGCATTTCTCTTGAAAATGCAGTGCCTCTTCATCG-3 ‘ (SQEID No 13)。
7.如权利要求2所述的特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体，其特征是所述 的SET mRNA靶序列为5」GCCAAACCCATTACAGTAC-3 ‘ (SQE IDNo 5)；所述的寡核苷酸链 模板序列包括寡核苷酸正义链序列和寡核苷酸反义链序列，所述正义链序列为5 ‘ -GATCCGCCAAACCCATTACAGTACTTCAAGAGAGTACTGTAATGGGTTTGGCTTTTTTG-3 ‘ (SQE ID No 14)；所述反义链序列为5 ‘ -AATTCAAAAAAGCCAAACCCATTACAGTACTCTCTTGAAGTACTGTAATGGGTTTGGCG-3 ‘ (SQE ID No 15)。
8.—种构建权利要求1-7任一项所述特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体的方 法，包括步骤(A)依据Genbank的SET基因序列，根据shRNA设计原则选取SETmRNA靶序列，并设计 合成可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列；(B)将设计合成的SETshRNA的寡核苷酸链模板序列正向插入表达载体的多克隆位点 序列内，构建特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体。
9.权利要求1-7任一项所述的特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体在制备治疗 SET蛋白表达异常相关疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种特异性抑制SET蛋白表达的shRNA表达载体及其构建方法和应用，所述shRNA表达载体，包括表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点、启动子序列、可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列，所述的可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列正向插入表达载体的多克隆位点序列内；所述可表达的SET shRNA的寡核苷酸链模板序列依据SET mRNA靶序列设计。本发明利用慢病毒载体为介导构建靶向人SET基因干扰载体，具有转染效率高、干扰效果稳定的特点，克服了质粒或逆转录病毒转染效率低、干扰效果不稳定的缺点，为SET蛋白功能科研领域以及SET蛋白表达异常相关疾病的治疗提供了有力工具。
文档编号C12N15/113GK101948859SQ20101025572
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者刘建军, 周丽, 李 杰, 杨细飞, 蒋英芝 申请人:深圳市疾病预防控制中心